花生总蛋白N-糖链的质谱分析研究

N-Glycan Analysis of Peanut Total Protein by Mass Spectrometry

摘要: 本研究以花生为实验材料，释放花生蛋白N-糖链，并对花生蛋白N-糖链进行质谱分析，从而对花生蛋白进行深入研究。结果表明，花生总蛋白含有10条蛋白条带，并在花生总蛋白中检测到10条糖链，其糖链结构组成为H₈N₂，H₉N₂，H₃N₂，H₃N₂Xyl，H₄N₂，H₃N₂FucXyl，H₄N₂Xyl，H₅N₂，H₆N₂，H₇N_2。这10条糖链均为N-糖链，且均为中性糖。本文对花生总蛋白N-糖链进行质谱分析，对花生蛋白N-糖链的研究具有重要意义。

Abstract: In this study, peanut was selected as the experimental material to release peanut protein N-glycan, and the N-glycan of peanut protein was analyzed by mass spectrometry, so as to conduct an in-depth study on peanut protein. The results showed that peanut total protein contained 10 protein bands and 10 glycan were detected in peanut total protein. The glycan was composed of H₈N₂,H₉N₂,H₃N₂,H₃N₂Xyl,H₄N ₂,H₃N₂FucXyl,H₄N₂Xyl,H₅N₂,H₆N₂, and H₇N₂. These 10 glycan all N-glycan, and they are all neutral glycan. In this paper, the total peanut protein N-glycan was analyzed by mass spectrometry, which is of great significance to the study of peanut protein N-glycan.

1. 引言

目前，花生是我国乃至全球种植最广泛的经济作物之一 [1]。花生蛋白中球蛋白约占90%，水溶性清蛋白约占10%，球蛋白又包含花生球蛋白和伴花生球蛋白 [2]，花生蛋白的营养价值高且富含多种人体必需氨基酸 [3]。花生蛋白具有乳化性、吸油性、吸水性、凝胶性等重要功能性质，是一种常用食品基料，花生蛋白中各自功能特性的蛋白材料可在不同类型的食品中应用 [4]。但是，花生蛋白也是我们日常生活中一种非常重要的过敏原 [5]。目前，已被发现的花生过敏原蛋白就有11种，其中有2种是主要过敏原，分别是Ara h1和Ara h2 [6]，而鸡蛋中的主要过敏蛋白为卵黏蛋白和卵白蛋白 [7]。研究发现，致敏蛋白大都是N-糖基化蛋白，且N-糖链在过敏中起着重要作用。因此，研究花生蛋白中的N-糖链对研究花生蛋白致敏有着非常重要的作用。

首先，对大豆蛋白的N-糖链进行释放。目前，常用酶法和化学法两种方法来对N-糖链进行释放。酶法中常用的酶分苷糖酶和蛋白酶两种，其中苷糖酶可特异性作用于苷糖键，且苷糖酶分为内切苷糖酶和外切苷糖酶，而蛋白酶则是选择性地水解肽链，形成含有糖链的肽段。化学释放法则是主要选择肼解法，需要在90℃且无水的条件下反应4 h，反应条件较酶法更苛刻且不安全，所以化学法应用并不广泛 [8]。

然后，对收集的N-糖链进行纯化。常用的糖链纯化方法有反向色谱法、正向色谱法、层析法、化学捕获法，离子交换色谱法、高效液相色谱法。本文中所用的方法为反向色谱法，因为糖链的亲水度高，在反向柱中不易保留可以直接从反向柱中穿透出来，以达到纯化糖链的目的。所用的反向柱有C18和C8固相萃取小柱 [9]。

最后，糖链的分离分析方法。糖链的分离分析方法有电泳法、液相色谱法、质谱法。电泳法是通过高压直流电场驱动带有电荷的样品移动，进而实现分离的，它可以在一定程度上分离纯化糖蛋白糖链，并且可以得到相关的结构信息，具有效率高，消耗样品少等特点 [10]。液相色谱被广泛应用于糖链的制备、分离、纯化等研究，液相检测器一般是紫外检测器，检测前需要把糖链进行柱前衍生，如果液相装备有蒸发光散射检测器可直接检测分析没有荧光吸收的糖链。主要用于电离糖链的质谱法有电喷雾电离质谱和基质辅助激光解析电离质谱两种。

本实验选择花生作为实验材料，释放花生蛋白糖链，并对花生蛋白糖连进行质谱分析，为今后开发低致敏性花生蛋白制品提供依据，对花生蛋白致敏性研究具有重要的意义。

2. 材料与仪器

2.1. 实验材料与试剂

新鲜干燥红皮花生购于超市；透析袋(截留分子量8000~14,000 KDa)购于Union Carbide Co.公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、盐酸购于天津天力公司；Acr (丙烯酰胺)、Bis (甲叉双丙烯酰胺)、Tris (三羟甲基氨基甲烷)、SDS (烷基硫酸钠)、DTT (二硫苏糖醇)、溴酚蓝、TEMED (四甲基乙二胺)、AP (过硫酸铵)、PMP (1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)均购于Aladdin公司；蔗糖、考马斯G-250、甘氨酸均购于普利化工有限公司；丙酮、甲醇、氨水、二氯甲烷、冰乙酸、乙腈等均为国产分析纯。

2.2. 仪器与设备

FMS型粉碎机(台湾弘荃机械有限公司)；DF-101S型恒温磁力搅拌(郑州生化仪器有限公司)；PHS-3C型PH计(上海仪电科学仪器有限公司)；Scientz-18N型冷冻干燥机(宁波新芝生物科技公司)；DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)；Premium HA 125 SM型电子天平(天美公司)；Sigma 3-18KS型高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；YPD-300D型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；7020-03型C18固相萃取柱(北京化标源科技有限公司)；SCIEX X500R QTOF型质谱仪(AB SCIEX公司)。

3. 实验方法

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3.1. 花生蛋白的提取

花生去皮于粉碎机中粉碎，花生粉末和丙酮1:10 (m/v)的比例，在烧杯中添加丙酮和花生粉末，烧杯用保鲜膜包裹在4℃搅拌两小时，搅拌速度为300 rpm，静置弃去上清液，反复脱脂至上清液澄清，5000 r/min离心30 min得到沉淀，将沉淀置于通风橱中晾干，得到脱脂粉末。配置PBS缓冲液(取磷酸二氢钾0.24 g，磷酸氢二钠1.44 g，氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，加去离子水800 mL充分溶解，然后加浓盐酸调至7.4，最后定容至1000 mL)，按花生脱脂粉末和PBS缓冲液1:7 (m/v)的比例，在烧杯中添加花生脱脂粉末和PBS缓冲液，于4℃搅拌24小时，搅拌速度为300 rpm，静置取上清液，4℃下5000 r/min离心30 min，收集所得上清液。使用pH计校准液校准pH计后，加盐酸将收集到的上清液PH调至4.55边调PH边搅拌，使沉淀完全后，4℃下5000 r/min离心30 min，收集沉淀，将沉淀用适量水溶解后装进活化好的透析袋，置于装满水的烧杯中透析48 h期间需多次换水，透析好后将透析液倒进培养皿中，置于冰箱中冷冻，待完全冻住后，将培养皿放在冷冻干燥机中冻干24 h即可得到花生蛋白粗品，粗品需−20℃保存。

3.2. SDS-PAGE电泳鉴定蛋白

配置SDS-PAGE电泳所需溶液：30%分离胶贮液(取Acr 30 g，Bis 0.8 g，定容至100 mL)，浓缩胶贮液(取Acr 10 g，Bis 0.5 g，定容至100 mL)，分离胶缓冲液(取Tris 36.3 g水溶，调pH 8.8，定容至100 mL)，浓缩胶缓冲液(Tris 6.0 g水溶，调pH 6.8，定容至100 mL)，上样缓冲液(SDS 1 g，DTT 1 g，溴酚蓝20 mg，蔗糖40 g，0.25 M且pH为8.5的Tris-HCl缓冲液20 mL，定容至1000 ml)，G-250染色液(1 g考马斯G-250，182 mL甲醇，182 mL蒸馏水，36 mL冰乙酸)，电极缓冲液(Tris 0.15 g，甘氨酸0.72 g，SDS 0.025 g，定容至250 mL)配好后放置4℃冷藏。

固定好电泳玻璃板后检漏，配置10%SDS，10%AP，分离胶(分离胶贮液8 mL，分离胶缓冲液2.5 mL，10% SDS 0.2 mL，10% AP 0.1 mL，蒸馏水9.18 mL，TEMED 0.02 mL)，充分混匀后注胶并水封。分离胶凝结后，配浓缩胶(浓缩胶贮液3 mL，浓缩胶缓冲液1.25 mL，10%SDS 0.1 mL，10% AP 0.05 mL，TEMED 0.02 mL)，充分混匀后加浓缩胶并插入样梳。称取样品5 mg，加0.5 mL上样缓冲液，溶解后在100 ℃水中加热10 min，浓缩胶凝结后，向槽内倒入电泳缓冲液，拔出样梳，每孔内加样10 μL，接通电源，稳压120 V进入分离胶后，电压改为90 V。电泳结束后，将凝胶板放在培养皿内，倒入染色液，染色4 h，染色完成后，将胶片放于盛有水的烧杯中在100℃水浴锅中加热0.5 h，可得到花生总蛋白胶片。

3.3. 花生蛋白糖链的提取

称取1392 mg PMP，样品10 mg于4 mL离心管中，在通风橱中加入配置好的50%甲醇–氨水溶液(取4 mL离心管加入2 mL甲醇，2 ml氨水摇匀)至4 mL，震荡使样品溶解，然后将离心管置于水浴锅中80℃反应48 h，反应结束后，取两个4 mL离心管每个离心管中分装样品2 mL，每个离心管中各加二氯甲烷2 mL，用二氯甲烷萃取，分别取上清液于4 mL离心管中，各用200 μL移液枪加冰乙酸20滴震荡摇匀，再加二氯甲烷加至4 mL，震荡摇匀后静置，待有明显分层后，取上清液于1.5 mL离心管中，转速5000 r/min离心30 min，取上清液至烧瓶中用旋转蒸发仪蒸干，再用4 mL蒸馏水溶解后，分别加入2 mL至4 mL离心管中，每个离心管中各加二氯甲烷2 mL，用二氯甲烷萃取，分别取上清液于4 mL离心管中，各用200 μL移液枪加冰乙酸20滴震荡摇匀，再加二氯甲烷加至4 mL，震荡摇匀后静置，待有明显分层后，吸取上清液至1.5 mL离心管中，转速5000 r/min离心30 min，取上清液至烧瓶中用旋转蒸发仪蒸干，蒸干后用1 mL蒸馏水溶出过C18柱(如果是新柱子先用20%乙腈洗12 mL，再用25%乙腈洗12 mL，再用蒸馏水洗12 mL)，将溶解的1 mL样品上柱，用蒸馏水洗6 mL，再用25%乙腈洗3 mL，干燥即得花生总蛋白N-糖链样品 [11]。

3.4. 糖链的质谱分析

取收集到的糖链样品，用乙腈稀释样品后用一次性过滤器过滤，设置进样量为10 µL，用ESI-MS法进行分析。ESI-MS参数：离子源电喷雾质谱电压4 KV，鞘气N2流速20.0 arb；辅助气体N2流速为10.0 arb，毛细管温度300℃，毛细管电压350 V，毛细管透镜电压250 V，样品进样量为10 µL，流动相为50%甲醇，流速为20 µL/min。

4. 结果与分析

4.1. 花生总蛋白SDS-PAGE鉴定

如图1所示，经过脱脂，浸提，等电点沉淀几个步骤后得到的花生蛋白含有10个条带，条带非常明显的则含量较高，条带不清晰的则含量较少。图中第一条蛋白带即为本实验的目标蛋白，说明在花生总蛋白中，该蛋白的含量较高。

Figure 1. SDS-PAGE identification of total peanut protein

图1. SDS-PAGE鉴定花生总蛋白

4.2. N-糖链的质谱分析

如图2所示，花生总蛋白中检测到10条糖链，质谱峰m/z为：1045.42H₈N₂(PMP)₂，1126.10H₉N₂(PMP)₂，1263.58H₃N₂(PMP)₂，1395.50H₃N₂Xyl(PMP)₂，1425.50H₄N₂(PMP)₂，1541.50H₃N₂FucXyl(PMP)₂， 1557.08H₄N₂Xyl(PMP)₂，1587.08H₅N₂(PMP)₂，1749.08H₆N₂(PMP)₂，1911.67 H₇N₂(PMP)₂。其中m/z 1045.42和1126.10为双电荷[M+H+K]²⁺型离子峰，其余各峰均为[M+Na]⁺型离子峰。

Figure 2. Analysis of protein glycan by mass spectrometry

图2. 蛋白糖链的质谱分析

4.3. N-糖链的相对定量分析

由图3可见，糖链的含量差别较大，H₄N₂Xy1型糖链含量最高约为34%，H₅N₂型糖链含量约为21%仅次于H₄N₂Xy1型糖链，而H₇N₂型糖链含量最少约为1%。H₃N₂型糖链，H₄N₂型糖链和H₃N₂Fucxyl型糖链的含量较为接近。其中H₃N₂X1、H₃N₂F1X1糖链为复杂型(complex)糖链，占总糖链的20.1%；H₃N₂糖链为核心型(core)五糖结构，占总糖链的6%；H₄N₂X1糖链为杂合型(hybrid)糖链，占总糖链的34%；其它的糖链为高甘露糖(high-mannose)链，占总糖链的39.9%。如表1所示，表中包括了花生蛋白糖链的单糖组成(Monosaccharide composition)、质谱峰(m/z)、离子型(Ion)、糖结构(Proposed structure)及糖型(Type)。

Figure 3. Relative quantitative analysis of protein N-glycan chain

图3. 蛋白N-糖链的相对定量分析

Table 1. Summary of monosaccharide composition, structure and sugar type of protein glycan

表1. 蛋白糖链的单糖组成、结构和糖型总结

5. 结论

实验以花生为材料，通过脱脂，浸提，等电点沉淀得到花生蛋白，通过SDS-PAGE电泳得到花生蛋白含有10条蛋白带。提取花生蛋白糖链后，用ESI-MS法解析了花生蛋白糖链的组成及相对含量，花生蛋白共含有10条糖链，其糖组成分别为：H₈N₂ (2%)，H₉N₂ (3%)，H₃N₂ (6%)，H₃N₂Xyl (15%)，H₄N₂ (4.9%)，H₃N₂FucXyl (5.1)，H₄N₂Xyl (34%)，H₅N₂ (21%)，H₆N₂ (8%)，H₇N₂ (1%)。这10条糖链均为N-糖链，且均为中性糖。

基金项目

2018年洛阳师范学院国家级项目培育基金项目(No. 2018-PYJJ-006)的项目支持。