1. 介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)是一种进行性神经退行性疾病，也是导致老年人认知障碍和痴呆最常见的原因。临床上表现为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间能力损害等[1]。AD的主要发病机制之一是淀粉样蛋白(Aβ)的肽不溶性沉积，他们是一种叫做淀粉样前体蛋白(APP)由β和γ分泌酶依次顺序裂解而成的[2]。Aβ具有折叠性和粘性，易于聚集成大型的不溶性纤维，这些纤维以斑块形式在大脑中沉积。在AD模型的大脑中所观察到的Aβ在脑实质中异常聚集(Aβ斑块)，主要的原因是Aβ清除能力下降，而不是Aβ生成过多[3]。从肽类物质的特性来看，Aβ的被动转运能力欠佳，需要依赖转运蛋白才能穿过血脑屏障(BBB)。低密度脂蛋白受体相关蛋白-1 (LRP1)是介导Aβ以游离形式或者与伴侣分子(如载脂蛋白E)相结合后通过血脑屏障进行清除的主要受体[4]。在血脑屏障腔侧有所表达的P-糖蛋白(P-gp)，则发挥着介导Aβ流出至外周循环的作用[5]。据相关报道，在AD患者体内，血脑屏障处LRP1和P-gp的表达水平有所降低，这一变化有利于Aβ在大脑中不断积累[6]。血浆中的Aβ (其中包含了从大脑中流出的Aβ)，主要是通过肝脏以游离状态或者与血浆脂蛋白相结合的形式被快速清除掉。近期，部分研究报道称，内源性可溶性循环低密度脂蛋白受体相关蛋白(sLRP)在清除全身Aβ的“汇活性”以及维持Aβ脑内稳态方面，有着至关重要的作用。通常情况下，LRP能够结合70%~90%的Aβ并形成复合物，该复合物无法穿过血脑屏障进入大脑，进而有利于Aβ主要通过肝脏来消除。然而，在AD疾病状态下，sLRP1大部分会发生氧化，这就阻碍了它与循环中的Aβ40相结合，进而导致游离Aβ40的血浆水平急剧升高[7]。
LRP1在肝脏中呈现高表达，并且已被证实可抑制小鼠肝脏对Aβ的摄取[8]，在中发现，通过对小鼠投喂高脂饮食，能够以时间依赖性的方式降低肝脏LRP1在细胞膜上的表达量，同时还能以促进小胶质细胞活化的同时增加淀粉样斑块[9]。多项研究均已证明，肝脏是外周循环中Aβ清除的主要途径，并且指出血浆Aβ若不能被正常清除，在很大程度上会诱发阿尔茨海默病(AD)。然而，过往的这些研究大多将重点聚焦于LRP1对Aβ肝脏清除所做出的贡献。尽管LRP1已被认定为Aβ全身清除的主要途径，但在Aβ肝脏清除过程中，其他发挥作用的肝脏转运机制仍有待进一步深入探究。鉴于此，在本研究中，我们致力于对Aβ40肝脏摄取以及胆汁排泄的机制进行详细的表征，并且运用体外HepG2细胞联合培养HSCE细胞(SCH)来研究P-gp、LRP1等转运蛋白在这一过程中所扮演的角色。之所以采用这一细胞模型，是因为它为研究底物载体转运赋予了独特的优势。由于P-gp在脑组织中有所表达，且有助于维持Aβ的脑内稳态，我们由此提出假设：除LRP1之外，P-gp也参与介导Aβ的肝脏摄取以及胆汁消除过程。
2. 实验材料
2.1. 主要试剂
人肝窦内皮细胞永生化(批号：iCell-0019a)、ECM培养基(批号：iCell-h070-001b)和DMEM高糖培养基(批号：iCell-138-0001)购自上海赛百康；胎牛血清(德国PAN-Biotech，批号：P150407)；LRP1蛋白一抗(批号：ab3572)和P-gp蛋白一抗(批号：ab3366)；购自英国Abcam公司；GAPDH蛋白一抗(批号：P60037M)和羊抗兔Ig(H+L)-HRP (批号：Ab392644)均购自中国Abmart公司；罗丹明123 (上海麦克林，批号：R817327)；Transwell-膜嵌套(美国corning公司，批号：3460)；FITC-Aβ42 (Absci，批号：FT-42-T1)。
2.2. 主要仪器
电子天平(瑞士梅特勒–托利多公司)；无菌超净台(Thermo公司)；酶标仪(Leica公司)；光学显微镜(德国Leica公司)；荧光显微镜(Leica公司)；生物显微镜(日本Nikon公司)；二氧化碳恒温培养箱(Thermo公司)；电泳仪(BIO-RAD公司)；电泳槽(BIO-RAD公司)。显影仪(LAS 500公司)。
3. 实验步骤
3.1. 细胞复苏和培养
预热培养基和一个细胞培养瓶。将HepG2和HSCE细胞瓶从液氮罐取出后置于37℃的水浴锅中解冻。解冻后吸出细胞混悬液转入装有15 mL离心管中，向离心管中加入2 mL预热后的细胞培养基，在25℃，1000 r/min离心机中离心5 min。弃上清液，加入1 mL预热培养基使细胞重悬并接种于培养瓶中置于5% CO2，37℃细胞培养箱中培养并标记细胞名称、日期。
HSCE细胞被放置在含有5%胎牛血清、1%青霉素–链霉素混合物的ECM培养基中培养，而HepG2细胞被放置在含有5%胎牛血清和1%青霉素–链霉素混合物的DEME培养基中培养，以确保其正常生长和繁殖。细胞被放置在5% CO2的37℃恒温培养箱中，以维持稳定的生长环境。
3.2. 药物的制备
贯叶金丝桃素由本课题组自己提取，其原液浓度为450 mg/25 mL。
维拉帕米
精密称取0.010 g的维拉帕米，将药物溶解于0.1 mL DMSO中，用纯水稀释至1 mL，配制成原液浓度为22,000 μM。后续用母液进行稀释，终浓度为50 μM进行后续实验。
3.3. 体外细胞实验浓度筛选
本实验采用CCK-8方法分别测定不同浓度的贯叶金丝桃素对细胞的毒性作用，筛选出最佳药物浓度。将100 μL的细胞悬液(2 × 105个/孔)与等体积的培养基混合后，分别加入96孔板的每个孔中。将培养板置于培养箱中预培养24 h，使细胞贴壁生长。随后，移除原有培养基，并向每个孔中加入100微升不同浓度的贯叶金丝桃素溶液(0、0.01、0.1、1、10、100 μM) [4]刺激细胞24 h后，在每个孔中加入10 μL的CCK-8溶液和90 μL无血清DEME培养基，继续放入培养箱内孵育2 h。用酶标仪测定各孔在450 nm的吸光度。
3.4. 慢病毒转录
将HepG2细胞进行传代铺板，每个孔接种2 × 105个细胞，铺板后将细胞置于37℃，5% CO2培养箱中孵育24 h。取0.2 ml的病毒置于适量的20 ml培养基中，轻轻混匀。每个培养瓶中加入2 ml培养基孵育过夜。去除含病毒的培养基，并用新鲜的完全培养基替换。去除含病毒的培养基，并用新鲜的完全培养基替换。在37℃、5% CO2至48~72小时，使病毒基因与靶细胞整合并表达。然后，收获细胞进行WesternBlot检测细胞P-gp蛋白表达，验证基因沉默细胞是否构建成功，将成功构建的PXR基因沉默细胞株分进行后续的实验。
3.5. Western Blot法测定蛋白
采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后，根据蛋白上样量和细胞样品蛋白浓度，计算蛋白体积并加入相对体积5倍的蛋白上样缓冲液，以蛋白裂解液补齐剩余体积，以使蛋白上样缓冲液被稀释至1倍。取30 μg蛋白经变性后用10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，湿转移至硝酸纤维素(NC)膜，用含5%脱脂奶粉的Tris-Hcl缓冲盐溶液(TBST)室温封闭2 h，分别孵育P-gp (180 kD)、LRP1 (85 kD)、和GADPSH (36 kD)的一抗，4℃摇床过夜。洗涤后孵育二抗1 h，与ECL化学发光液反应后，成像系统进行自动曝光，并用ImageJ软件测定各显色条带的光密度值进行分析。以各组目的蛋白/内参灰度值的比值作为各组蛋白表达的相对含量。
3.6. 肝细胞双层膜屏障的建立
transwell小室倒置将0.5 mL HSCE细胞(2 × 105个/孔)接种到小室，放置4~6 h至细胞贴壁。再将1mLHpeG2细胞(2 × 105个/孔)接种到12孔Transwell板。在顶侧(Apicalside, AP)加入0.2 mL DEME培养基，在基底侧(Besideside, BL)加入1 mL的ECM培养基并在37℃，5% CO2的培养箱中培养。之后每天更换ECM培养基至7天后形成膜，做后续实验(见图1)。
Figure 1. Establishment of liver cell sandwich model
图1. 肝细胞三明治模型建立
3.7. 罗丹明123在三明治培养肝细胞模型中的外排
为了确定ABCB1/P-gp转运活性，在建立好的模型中加入P-gp特异性底物Rho123孵育4小时[10]。
取100 mg Rho123加入10 mL PBS中并用PBS稀释至1 mg/mL，得到储备液。精密吸取储备液适量，用PBS稀释至50 μg/mL，作为转运实验的给药浓度。然后同样的方法加Rho123储备液稀释得到0、3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL的标准曲线溶液。
在各外室加入1.5 mL浓度为50 μM的Rho123，内室加入0.5 μL PBS共培育4 h后取出外AP侧取出100 uL的转运溶液至96孔板中，复孔5个，并在酶标仪上测定取出溶液和标准曲线中Rho123 (Ex = 500)的OD值，从而计算从AP侧取出的转运溶液中伊文思蓝的浓度及通透系数Pa值[11]。
Papp = (dQ/dt)/(A * C0)
(C0是药物初始浓度，dQ/dt为接收的药物出现的速率，A为聚碳酯膜的表面积。一般认为，吸收良好的药物，其表观渗透系数为PaPP > 1 × 10−6 cm/s；而吸收较差的药物，其PaPP < 1 × 10−7 cm/s。)
3.8. FAM-Aβ在三明治培养肝细胞模型中的外排
FAM-Aβ储备液稀释得到0、31.25、62.5、125、250、500 ng/mL的标准曲线溶液，用485 nm激发光和535 nm发射光检测其荧光值。
在各外室加入1.5 mL浓度为500 ng/mL FITC-Aβ42，内室加入500 μL PBS共培育4 h后取出BP测上清液至96孔板中，使用酶标仪检测FITC-Aβ42，的荧光。根据其标准曲线检测每组样品中FITC-Aβ42的浓度(单位为ng/mL)，FITC-Aβ42用Papp表观通透系数的Aβ转换。
3.9. 统计学分析
数据采用excel进行分析，计量数据采用±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
4. 结果
4.1. 贯叶金丝桃素给药剂量的确定
用0.01、0.1、1、10、100 μM的HYP处理细胞24 h后，其CCK-8结果显示，100 μM HYP显著降低细胞存活率(P < 0.05) (见图2)，结合参考文献，本研究选择了0.5 μM进行后续实验[12]。
Figure 2. The effect of different concentrations of Hypericin on the activity of HSEC cells compared to the control group (n = 6; ****, P < 0.001 compared to the control group)
图2. 不同浓度的贯叶金丝桃素对HSEC细胞的活性影响其数据显示与对照组相比(n = 6；****，P < 0.001与控制组相比)
4.2. PXR基因沉默细胞的验证
表达PXR的慢病毒采用MOI由于慢病毒载体含荧光，为此转染24小时后，我们选择激发波长488 nm/发射波长507 nm，在蓝光激发下观察GFP/RFP阳性细胞比例，阳性率 ≥ 80%，证明转染效率良好(见图3)。
经2代传代培养，通过荧光显微镜观察到GFP标记基因阳性率 ≥ 80%，则证明GFP标记基因稳定传代表达。
Figure 3. Results of transfection of HpeG2 with lentivirus
图3. 慢病毒转染HpeG2结果
慢病毒转染后的HepG2细胞细胞，予以HYP干预后，P-gp蛋白表达增加，但LRP1蛋白水平略微降低(详见图4)，证明转染成功。
Figure 4. Effects of different treatments on P-gp protein expression in HepG2 cells
图4. 不同处理对HepG2细胞中P-gp蛋白表达影响
4.3. hCMEC/D3细胞单层膜屏障转运能力测定
通过酶标仪对罗丹明123溶液进行全波长扫描(400~800 nm)，结果显示其在507 nm处存在最强吸收峰，表明该波长下染料分子对光能的吸收能力最强(见图5)。HepG2细胞和HSCE细胞共孵育7天后采用HYP处理24 h，用Rho123的表观通透性评估胆管细胞P-gp外排。图5(C)的结果显示，与对照组相比，用HYP刺激24小时后，其Rho123的Papp值增加，表明模型中P-gp外排能力增强。并且使用维拉帕米导致Rho123的Papp值显著性下降。以上提示HYP可以增强HepG2细胞中P-gp的胆管细胞外排的活性，但是这种效果能够被维拉帕米阻断。
注：(A) Rho123波长；(B) Rho123标准曲线；(C) Rho123从BP侧到AP侧示意图；(D) Rho123从BP侧到AP侧的表观通透性。
Figure 5. Measures the transport volume of Rho123 in the liver cell sandwich model and evaluates the transport function of P-gp
图5. 测量Rho123在肝细胞三明治模型中的转运量，评估P-gp的转运功能
注：(A) FITC-Aβ42在hCMEC/D3细胞单层膜中的转运量示意图；(B) FITC-Aβ42从BP侧到AP端的Papp值，其数据显示与对照组相比(n = 3; *, P < 0.05; **, P<0.01; ***, P < 0.001)。
Figure 6. Measures the transport capacity of FITC-Aβ42 in the blood-brain barrier
图6. 测量FITC-Aβ42在血脑屏障中转运能力
图6的结果显示，HYP增加了FITC-Aβ42从BP侧到AP侧的Papp值，采用维拉帕米干预后，FITC-Aβ42从BP侧向AP侧的Papp值有显著性下降。以上结果提示HYP能够增强脑血管中内皮细胞里P-gp的活性从而增强BBB对Aβ42转运能力。
5. 讨论
阐明Aβ的肝脏转运机制可能为开发新治疗靶点提供思路——通过增强肝脏对Aβ的全身清除效率，进而降低脑内Aβ负荷。尽管现有研究已聚焦于LRP1在肝细胞转运Aβ中的作用[13]，但对于P-gp这一在Aβ跨血脑屏障(BBB)转运及肝脏清除中均具明确功能的转运蛋白，其具体机制仍知之甚少[14]。因此，为全面解析这些转运蛋白在Aβ4肝脏清除中的作用机制，本研究采用三明治培养的永生化人源HepG2肝细胞和肝窦内皮细胞(HSCE)开展相关实验。为此，我们选择一种人源强效PXR激活剂–贯叶金丝桃素(Hyperforin, HYP) [15]作为干预药物，是圣·约翰草提取物的活性成分之一，临床上主要用于治疗抑郁症。我们之前的研究发现HYP仅上调P-gp但对LRP1无任何作用，提示HYP有治疗阿尔茨海默病(AD)的潜力，但是具体的治疗机制尚不清楚。既往报道激活PXR可以诱导P-糖蛋白和CYP3A4酶上调[16]。本章节证明HYP激活PXR后可通过增强HepG2细胞中P-gp的活性来增加肝胆系统对Aβ42转运机制。首先进行HYP安全浓度的评价，通过不同浓度的HYP处理HSCE细胞后，根据细胞存活率及HYP在血液中实际的含量选择5 μM进行干预。多项研究通过定量PCR (qPCR)和Western blot检测发现，HepG2细胞中hPXR蛋白表达水平显著低于原代人肝细胞[17]，为了提高hPXR靶基因的基础表达，通过慢病毒转染并稳定转然后HYP处理后可显著性升高HepG2细胞内P-gp的表达证明转染成功。
罗丹明123 (Rhodamine123, Rdml23)作为一种荧光探针，许多研究将其视作为染色胆管细胞一种标记染料。本章建立一种三明治模型建，然后使用Rhol23测试了胆管细胞的功能，Rhol23是通过多种跨膜通道蛋白如多药耐药蛋白1 (P-gp)转运小物质。其P-gp主要定位于肝细胞的胆小管侧膜(Canalicular Membrane)，在三明治模型中属于顶膜(Apical Membrane)区域[18]。发现Rdml23可以被HegG2细胞摄取并储存于细胞质中，并且在黄迪等人实验中发现Rdml23摄取后逐渐被排泄入胆管中[19]。为明确三明治模型成立，我们选取AP侧的Rhp123的Papp来计算转运能力。与正常组相比，HYP能够增加Rho123 Papp值，说明了HYP能够增强Rho123外排。并且应用了一种P-gp的特异性抑制剂维拉帕米，维拉帕米能够在不减少P-gp表达量的同时抑制P-gp的转运活性[20]。给予维拉帕米后，其Rho123的Papp值显著性降低，证明在三明治模型中肝–胆的模型建立成功同时可以验证P-gp的转运活性。接下来我们使用FITC-Aβ42以检测P-gp将Aβ42转运胆管的能力，研究结果显示：HYP孵育24 h之后，其FITC-Aβ42的Papp值升高，说明三明治模型对Aβ42转运能力升高，同时给予Verlipamil的FITC-Aβ42的Papp值降低，证明通过上调HepG2的P-gp蛋白的表达和转运活性水平，能够提升该模型对Aβ42外排能力。
总而言之，本研究提供了一种永生化细胞的肝胆模型，并使用Rho123验证模型成立同时证明上调P-gp能够促进肝胆排泄Aβ42。
NOTES
*通讯作者。