异基因造血干细胞移植患者NK细胞重建与aGVHD相关性研究

The Relationship between Circulating Natural Killer Cells and Acute Graft-versus-Host Disease after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation

摘要: 目的：本研究为探讨接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的患者中，自然杀伤细胞(NK细胞)重建情况与急性移植物抗宿主病(aGVHD)的关联。方法：研究纳入安徽医科大学第一附属医院2017年6月至2023年7月期间105例allo-HSCT患者，检测其移植后+30天、+60天、+90天NK细胞计数，分析NK细胞与aGVHD发生、严重程度及预后的关联。结果：在发生aGVHD的64例患者的NK细胞计数明显低于未发生者(P < 0.05)，且发生II~IV度aGVHD的患者NK细胞水平更低(P < 0.05)。ROC曲线表明，移植后+30天、+60天、+90天NK细胞计数预测aGVHD的临界值分别为120、129.5、137.5 cells/μl (AUC分别为0.712、0.730、0.732)。生存分析显示，+60天NK细胞计数 ≥ 129.5 cells/μl组1年OS率为81.4%，显著高于<129.5 cell/μl组的56.3% (P = 0.049)；+90天NK细胞计数 ≥ 137.5 cell/μl组1年OS率达90.9%，与<137.5 cell/μl组的70.0%相比差异显著(P = 0.033)。II~IV度aGVHD患者3年OS率(19.6%)显著低于0~I度组(44.1%, P = 0.008)。预处理方案中抗胸腺细胞球蛋白(ATG)的使用及是否发生aGVHD是影响NK细胞重建的关键因素。结论：本研究证实，allo-HSCT后NK细胞重建水平与aGVHD的发生及预后密切相关，可作为早期预测aGVHD的生物标志物。

Abstract: Objective: This study aimed to explore the association between natural killer (NK) cell reconstitution and acute graft-versus-host disease (aGVHD) in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). Methods: A total of 105 patients who underwent allo-HSCT at The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University from June 2017 to July 2023 were included. NK cell counts were detected at +30, +60 and +90 days post-transplantation, and their associations with the occurrence, severity, and prognosis of aGVHD were analyzed. Results: The NK cell counts in patients with aGVHD were significantly lower than those without aGVHD (P < 0.05), and the NK cell levels in patients with grade II~IV aGVHD were even lower (P < 0.05). Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis showed that the cut-off values of NK cell counts for predicting aGVHD at +30, +60, and +90 days were 120, 129.5, and 137.5 cells/μl, respectively (with areas under the curve [AUC] of 0.712, 0.730, and 0.732, respectively). Survival analysis revealed that the 1-year overall survival (OS) rate in the group with NK cell count ≥ 129.5 cells/μl at +60 days was 81.4%, which was significantly higher than that in the group with NK cell count < 129.5 cells/μl (56.3%, P = 0.049). Additionally, the 1-year OS rate in the group with NK cell count ≥ 137.5 cells/μl at +90 days reached 90.9%, which was significantly different from that in the group with NK cell count < 137.5 cells/μl (70.0%, P = 0.033). The 3-year OS rate in patients with grade II~IV aGVHD (19.6%) was significantly lower than that in the grade 0~I group (44.1%, P = 0.008). The use of antithymocyte globulin (ATG) in the conditioning regimen and the occurrence of aGVHD were key factors influencing NK cell reconstitution. Conclusion: This study confirms that the level of NK cell reconstitution after allo-HSCT is closely associated with the occurrence and prognosis of aGVHD, and it can serve as a biomarker for the early prediction of aGVHD.

1. 引言

随着医疗技术的发展，异基因造血干细胞移植(Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation)的应用日益广泛，目前已成为治疗恶性血液疾病的有效方法，显著提高了血液系统疾病的治愈率。然而，患者在移植后，其预后会受到急性和慢性移植物抗宿主病(GVHD)的影响，尤其是急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease, aGVHD)会引发严重的并发症，进而对患者的生存率和生活质量产生影响[1]。allo-HSCT的主要挑战之一是降低GVHD的发病率和严重程度，同时提高移植物抗白血病(graft versus leukemia, GVL)效应，而移植后的免疫功能重建(immune reconstitution, IR)是影响allo-HSCT的主要原因之一。其中NK细胞属于机体固有免疫，在allo-HSCT后可达到快速免疫重建[2]，由于移植过程中的处理需要大量清除移植物中的T细胞，以及术后长期的免疫抑制治疗，NK细胞所发挥的固有免疫作用在预防感染和介导GVL效应中至关重要。本研究旨在探讨allo-HSCT患者NK细胞重建动力学与急性移植物抗宿主病(aGVHD)的发生、严重程度及预后的关联。

2. 材料与方法

2.1. 研究对象

本次研究对象为2017年6月至2023年7月期间就诊于安徽医科大学第一附属医院血液内科，并接受异基因造血干细胞移植的患者(n = 105)。其中男性患者53例，女性52例，中位年龄35 (14~60)岁。本研究已通过安徽医科大学第一附属医院医学伦理委员会审批(伦理审查批件号：PJ2025-06-63)，并获得免除知情同意许可。

移植后+30天检测的患者共45例，其中男性24例，女性21例。移植后+60天检测的患者共59例，其中男性29例，女性30例。移植后+90天检测的患者共64例，其中男性32例，女性32例。

按疾病类型分类，急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)的患者49例、急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)的患者34例、再生障碍性贫血( aplastic anemia, AA)的患者14例，其他类型血液疾病8例(包括骨髓增生异常综合征3例、非霍奇金淋巴瘤1例、慢性粒细胞白血病4例)。按移植前疾病状态，完全缓解(CR, complete remission或Complete remission with incomplete recovery of blood, CRi) 96例，部分缓解(PR, partly remission) 7例，复发2例。按供受者性别匹配情况，性别相合组48例，不相合组55例。按供受者血型匹配情况，血型相合组53例，血型不合组52例。按供受者亲缘关系，单倍体供者73例、同胞供者22例、无关亲缘供者10例。按干细胞来源分类，外周血干细胞移植51例，骨髓移植5例，脐血移植8例，骨髓联合外周血移植37例，其他组合4例。按预处理方案，采用清髓方案者57例，采用减低剂量者48例。按预处理方案是否含ATG，含ATG者89例，不含ATG者16例。按预防GVHD方案是否含移植后环磷酰胺(post-transplant cyclophosphamide, PTcy)，含有者PTcy 66例，不含者PTcy 39例。

在105例患者中，67存活，38例死亡(26例疾病复发，12例死于严重感染)，中位随访时间为21 (1~82)月，见表1。

Table 1. General characteristics of patients

表1. 患者一般情况特征

一般情况特征
纳入因素		病例数% (n = 105)
性别	男	53 (50.5%)
	女	52 (49.5%)
年龄		35 (14~60)
原发疾病	AML	49 (46.7%)
	ALL	34 (32.4%)
	AA	14 (13.3%)
	其他	8 (7.6%)
移植前原发疾病状态	CR	96 (91.4%)
	PR	7 (6.7%)
	复发	2 (1.9%)
供受者性别是否相合	不相合	50 (47.6%)
	相合	55 (52.4%)
供受者血型是否相合	相合	53 (50.5%)
	不相合	52 (49.5%)
供者类型	同胞全相合移植	22 (21.0%)
	单倍体相合移植	73 (69.5%)
	无关供者	10 (9.5%)
移植物来源	骨髓	5 (4.8%)
	外周血	51 (48.6%)
	脐血	8 (7.6%)
	骨髓 + 外周血	37 (35.2%)
	其他	4 (3.8%)
输注单个核细胞(×10^8/kg)		7.42 (5.38, 10.54)
CD34^+细胞输注量(×10^6/kg)		3.76 (2.86, 4.80)
中性粒细胞植入时间(天)		11 (10, 12)
血小板植入时间(天)		12 (11, 15)
预处理方案	MAC	57 (54.3%)
	RIC	48 (45.7%)
预处理是否含有ATG	是	89 (84.8%)
	否	16 (15.2%)
急性GVHD预防方案是否含有PTcy	是	66 (62.9%)
	否	39 (37.1%)
aGVHD	是	64 (61.0%)
	否	41 (39.0%)

注：AML：急性髓系白血病，ALL：急性淋巴细胞白血病；MAC：清髓预处理方案，RIC：减低强度预处理。PTcy：移植后环磷酰胺；性别、原发疾病、供者类型用构成比(%)表示；移植时年龄用中位数(最小值–最大值)表示；CD34⁺细胞输注量、单个核细胞输注量、中性粒细胞及血小板植入时间均用中位数(四分位数间距)表示。

2.2. 纳入和排除标准

纳入标准：1) 在安徽医科大学第一附属医院血液内科接受异基因造血干细胞移植的血液病患者；2) 临床资料及随访资料较为完整的患者。

排除标准：1) 既往存在严重心、肺、肾疾病或其它肿瘤疾病患者；2) 临床资料及随访资料严重缺失的患者。

2.3. 移植过程

2.3.1. 外周血造血干细胞动员方案

采用粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)，剂量为(5~10) μg/kg/d，皮下注射5~6天，根据血象选择采集最佳时机，确保采集到的细胞中CD34⁺细胞计数 ≥ 2 × 10^6/kg。

2.3.2. 预处理方案

根据患者病情及移植供者来源选择预处理方案，经典和改良的清髓预处理方案(MAC)包括Bu/Cy (白消安16 mg/kg口服 + 环磷酰胺120 mg/kg)、mBuCy + ATG (阿糖胞苷4~8 g/m² + 白消安9.6 mg/kg + 环磷酰胺3.6 g/m² + 抗胸腺细胞球蛋白10 mg/kg)，减低强度预处理(RIC)包括Flu/Bu (氟达拉滨150 mg/² + 白消安8~10 mg/kg)、Flu/Bu/TT (氟达拉滨150 mg/m² + 白消安8 mg/kg + 塞替哌5 mg/kg)、RIC-mBuCy (羟基脲80 mg/kg + 阿糖胞苷2 g/m² + 白消安4.8 mg/kg + 环磷酰胺2.0 g/m² + 司莫司汀250 mg/m²)、RIC-BuFlu (羟基脲80 mg/kg + 阿糖胞苷2 g/m² + 白消安9.6 mg/kg + 氟达拉滨150 mg/m² + 司莫司汀250 mg/m²)、RIC-mBuFluATG (阿糖胞苷8 g/m² + 白消安9.6 mg/kg + 氟达拉滨150 mg/m² + 司莫司汀250 mg/m² + 抗胸腺细胞球蛋白10 mg/kg)、RIC-mBuCyFLU + ATG (阿糖胞苷8 g/m² + 白消安9.6 mg/kg + 氟达拉滨150 mg/m² + 环磷酰胺2.0 g/m² + 司莫司汀250 mg/m² + 抗胸腺细胞球蛋白10 mg/kg)。

2.3.3. aGVHD预防

同胞供者术后预防采用环孢素A (CsA) + 甲氨蝶呤(MTX)方案，单倍体移植和非亲缘供者预防采用CsA + MTX + MMF + PTcy方案或CsA + MTX + CD25单克隆抗体方案。脐血干细胞移植患者采用CsA + MMF方案。具体用法：从术前−1 d开始CsA 1.5 mg/kg/d，24 h内静脉滴注，直至患者能口服，维持CsA血清内药物浓度为200~400 μg/L。术后 + 1 d MTX 15 mg/m²，+3 d、+6 d和+11天MTX予以10 mg/m²剂量给药。每次MTX用药24小时后采用甲酰四氢叶酸钙解救。MMF和CsA同时或者+1 d开始给药，剂量为1.0 g/d，分2次口服。CD25单克隆抗体按照20 mg/d，静脉给药1次。

2.3.4. aGVHD治疗方案

根据急性移植物抗宿主病诊断标准相关文献[3]，确诊aGVHD后根据血清内药物浓度来调整CsA剂量，确诊Ⅱ度aGVHD使用甲泼尼龙(MP) 1 mg/kg/d，静脉滴注；确诊Ⅲ~Ⅳ度aGVHD患者予以MP 2 mg/kg/d，静脉滴注。病情好转后，激素逐步减停。若出现治疗3天内病情进行性加重，治疗7天病情无好转或治疗14天后症状未完全缓解，可判定为激素耐药的aGVHD，采用CD25单克隆抗体或芦可替尼进行二线治疗。

2.3.5. 移植后预防和治疗感染方案

从移植后−9~−2天起予以更昔洛韦10 mg/kg/d预防CMV感染，复方新诺明预防卡氏肺孢子菌，左氧氟沙星0.4 g/d预防细菌感染，伏立康唑200 mg/d预防真菌感染，同时充分水化碱化尿液，美司钠预防出血性膀胱炎。

2.3.6. allo-HSCT后疗效评价及随访

未输注血液制品情况下，外周血中性粒细胞计数连续3天 ≥ 0.5 × 10⁹/L定义为粒细胞植入，血小板连续7天 ≥ 20 × 10⁹/L定义为血小板植入。造血恢复前，每周至少进行2次血常规、CsA浓度、CMV及EB病毒DNA拷贝数检测，于移植后0.5、1、2、3、6、9、12个月监测供受者基因嵌合、骨髓细胞形态学、微小残留及遗传学改变。随访日期截止至2024年12月。无进展生存期(PFS)定义为移植当天(0天)至疾病复发、死亡或随访截止日期的时间；总生存率(OS)定义为移植当天至死亡或随访截止日期的时间。

2.3.7. 统计学方法

对于计量资料(如NK细胞数量)进行正态性检验，符合正态分布的资料以均数 ± 标准差($\overline{x}\pm s$ )表示，非正态分布的资料以中位数(四分位数间距) [M (Q1, Q3)]表示。计数资料(如GVHD发生率)以例数(百分比) [n(%)]表示。采用SPSS 26.0软件进行统计分析：计数资料组间比较采用χ²检验；正态分布的计量资料组间比较采用独立样本t检验，非正态分布采用Mann-Whitney U检验。采用Spearman秩相关分析变量相关性，通过Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank检验比较组间生存差异；单因素分析中P < 0.1进入多元回归，运用二元logistic回归分析进行多因素分析，筛选影响NK细胞的独立危险因素。通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)确定NK细胞计数临界值，计算曲线下面积(AUC)评估其对aGVHD发生风险及死亡率的预测效能。采用GraphPad 10.1.2绘制图像。以P < 0.05为差异有统计学意义，P < 0.01为差异有显著统计学意义。样本量基于既往文献报告相关性分析效能计算确定，采用PASS 15.0软件计算，基于Spearman相关分析，设定双侧α = 0.05，期望相关系数r = −0.3时，需样本量89例，考虑10%脱落率后纳入105例。

3. 结果

3.1. aGVHD组和无aGVHD组患者基本情况

将105例患者按照是否发生aGVHD，分为aGVHD组(n = 64)和无aGVHD组(n = 41)，分析患者发病相关因素(年龄 ≤ 35岁/>35岁、性别、基础疾病、供受者性别相合、血型配型、移植类型、供者移植物来源、回输干细胞中CD34⁺细胞和单个核细胞的计数、中性粒细胞植入时间、血小板植入时间等)，结果显示P > 0.05，两组间差异均无统计学意义，见表2。

Table 2. Comparative analysis of clinical characteristics between patients with and without aGVHD

表2. 是否发生aGVHD分组，两组患者基本临床资料特征比较分析

分组		例数(n = 105)	无GVHD组	GVHD组	χ^2值	P
性别	男	53	22 (53.7%)	31 (48.4%)	0.273	0.602
	女	52	19 (46.3%)	33 (51.6%)
年龄	≤35岁	54	21 (51.2%)	33 (51.6%)	0.001	0.973
	>35岁	51	20 (48.8%)	31 (48.4%)
原发疾病	AML	49	24 (58.5%)	25 (39.1%)	4.086	0.252
	ALL	34	10 (24.4%)	24 (37.5%)
	AA	14	5 (12.2%)	9 (14.1%)
	其他	8	2 (4.9%)	6 (9.4%)
移植前原发疾病状态	CR	96	38 (92.7%)	58 (90.6%)	0.435	0.804
	PR	7	2 (4.9%)	5 (7.8%)
	复发	2	1 (2.4%)	1 (1.6%)
供受者性别是否相合	不相合	48	19 (46.3%)	31 (48.4%)	0.044	0.834
	相合	55	22 (53.7%)	33 (51.6%)
供受者血型是否相合	相合	53	21 (51.2%)	32 (50.0%)	0.015	0.903
	不相合	52	20 (48.8%)	32 (50.0%)
供者类型	同胞全相合移植	22	11 (26.8%)	11 (17.2%)	1.464	0.479
	单倍体相合移植	73	26 (63.4%)	47 (73.4%)
	无关供者	10	4 (9.8%)	6 (9.4%)
移植物来源	骨髓	5	1 (2.4%)	4 (6.3%)	6.412	0.17
	外周血	51	17 (41.5%)	34 (53.1%)
	脐血	8	6 (14.6%)	2 (3.1%)
	骨髓 + 外周血	37	16 (39.0%)	21 (32.8%)
	其他	4	1 (2.4%)	3 (4.7%)
预处理方案	MAC	57	19 (46.3%)	38 (59.4%)	1.711	0.191
	RIC	48	22 (53.7%)	26 (40.6%)
预处理是否含有ATG	否	16	5 (12.2%)	11 (17.2%)	0.482	0.487
	是	89	36 (87.8%)	53 (82.8%)
急性GVHD预防方案是否含有PTcy	否	39	17 (41.5%)	22 (34.4%)	0.538	0.463
	是	66	24 (58.5%)	42 (65.6%)
输注单个核细胞 (×10^8/kg)			7.10 (5.365, 10.465)	7.625 (5.335, 10.955)	−0.496	0.62
CD34^+细胞输注量 (×10^6/kg)			3.93 (3.065, 4.800)	3.455 (2.900, 4.848)	−1.11	0.267
中性粒细胞植入时间(天)			11.0 (10.0, 13.0)	11.0 (10.0, 12.0)	−0.795	0.427
血小板植入时间(天)			13.0 (11.5, 18.5)	12.0 (11.0, 14.0)	−1.271	0.204

3.2. allo-HSCT后NK细胞免疫重建特征的研究

选取移植后+30天、+60天、+90天检测NK细胞绝对计数，按照移植后检测时间分组，分析免疫重建的影响因素。纳入性别、年龄、原发疾病、移植前疗效、供受者性别及血型匹配、供者类型、移植物来源、预处理方案(清髓/非清髓)、预处理是否应用ATG、aGVHD预防方案是否含有PTcy、监测时间点前GVHD病史、移植物中CD34⁺细胞数量、输入有核细胞数量、中性粒细胞及血小板植入时间等自变量，通过多元线性回归分析免疫指标与各因素关系，将P < 0.1的自变量纳入多元线性回归分析。

3.2.1. 移植后+30天NK细胞免疫重建指标影响因素

单因素分析显示，移植后+30天NK细胞计数可能与移植类型(P = 0.071)、预处理是否应用ATG (P = 0.026)和是否发生GVHD (P = 0.015)有关。多元线性回归分析无明显差异，见表3。

Table 3. Multivariate influencing factors of NK cells at +30 days post-transplantation

表3. 移植后+30天NK细胞多因素影响因素

	β	P值
供者类型	−0.129	0.458
预处理是否含有ATG	−0.307	0.081
有无GVHD	−0.202	0.161

3.2.2. 移植后+60天NK细胞免疫重建指标影响因素

单因素分析显示，移植后+60天NK细胞数可能与移植类型(P = 0.057)、aGVHD预防方案是否含有PTcy (P = 0.09)和是否发生GVHD (P = 0.008)有关。多元线性回归分析显示NK细胞计数与预防aGVHD方案是否含有PTcy (β = −66.676, P = 0.039)和是否发生GVHD (β = −84.128, P = 0.016)相关，见表4。

3.2.3. 移植后+90天NK细胞免疫重建指标影响因素

单因素分析显示，移植后+90天NK细胞数可能与移植类型(P = 0.059)、预处理方案是否含有ATG (P = 0.096)和是否发生GVHD (P = 0.002)有关。多元线性回归分析显示NK细胞计数与是否发生GVHD (β = −115.402, P = 0.005)有关，见表5。

Table 4. Multivariate influencing factors of NK cells at +60 days post-transplantation

表4. 移植后+60天NK细胞多因素影响因素

	β	P值
供者类型	−0.014	0.917
aGVHD预防方案是否含有PTcy	−0.279	0.039
有无GVHD	−0.312	0.016

Table 5. Multivariate influencing factors of NK cells at +90 days post-transplantation

表5. 移植后+90天NK细胞多因素影响因素

	β	P值
供者类型	−0.124	0.338
预处理是否含有ATG	−0.145	0.262
有无GVHD	−0.344	0.005

3.3. 移植后+30天、+60天、+90天检测NK细胞计数与aGVHD差异性分析

根据有无aGVHD分组，分为GVHD组和无GVHD组；根据发生aGVHD的严重程度分为0~I度GVHD组和II~IV度GVHD组。结果如表6。

Table 6. (a) Differential analysis of groups stratified by the occurrence of aGVHD at different days post-transplantation; (b) Differential analysis of groups stratified by the severity of aGVHD at different days post-transplantation

表6. (a) 移植后不同天数根据是否发生aGVHD分组差异性分析；(b) 移植后不同天数根据发生aGVHD严重程度分组的差异性分析

(a)
NK细胞计数	无GVHD组	GVHD组	Z	P	r	P
30天(n = 45)	168.00 (106.00,280.00)	100.00 (52.00, 170.50)	−2.443	0.015	−0.368	0.013
60天(n = 59)	181.00 (135.25,279.75)	110.00 (53.00, 187.00)	−2.638	0.008	−0.346	0.007
90天(n = 64)	203.50 (153.75,382.00)	124.00 (87.00, 208.00)	−2.808	0.005	−0.354	0.004
(b)
NK细胞计数	0~I度GVHD组	II~IV度GVHD组	Z	P	r	P
30天(n = 45)	151.00 (100.00,242.00)	70.00 (53.00, 135.00)	−2.141	0.032	−0.323	0.031
60天(n = 59)	186.00 (131.50,289.50)	139.00 (105.50, 205.05)	−1.764	0.078	−0.232	0.077
90天(n = 64)	170.00 (114.25,352.50)	194.00 (129.50, 232.00)	−0.298	0.766	−0.038	0.769

3.3.1. 移植后+30天与NK细胞计数差异性分析

根据表6，aGVHD组(22例)患者NK细胞计数为100.00 (52.00, 170.50) cells/μl，显著低于无aGVHD组(23例) NK细胞计数168.00 (106.00, 280.00) cells/μl (Z = −2.443, P = 0.015)。Spearman相关性分析表明，NK细胞计数与aGVHD发病呈负相关(r = −0.368, P = 0.013)。

Ⅱ~Ⅳ度aGVHD组(11例)患者NK细胞计数为70.00 (53.00, 135.00) cells/μl，低于0~Ⅰ度aGVHD组(34例)的151.00 (100.00，242.00) cells/μl (Z = −2.141, P = 0.032)。Spearman相关性分析表明，NK细胞计数与aGVHD发病严重程度呈负相关(r = −0.323, P = 0.031)。

ROC曲线显示，计算是否发生aGVHD的NK细胞绝对计数的临界值，并用于aGVHD的评估及监测，见图1。AUC = 0.712 (95%CI 0.559~0.866)；P = 0.015；灵敏度 = 0. 682；特异度 = 0.739；cut-off值120个/ul；进一步分组高NK30 (即移植后+30天NK细胞计数 ≥ 120个/μl)和用低NK30 (即移植后+30天NK细胞计数 < 120个/μl)评估高低NK细胞组间与GVHD的差异性，结果证明两组间具有统计学意义(χ²值 = 8.006, P = 0.005)，见表7。

Figure 1. ROC curve of NK cells at +30 days post-transplantation

图1. 移植后+30天NK细胞绘制ROC曲线

Table 7. Chi-square analysis of groups stratified by NK cell levels at +30 days post-transplantation

表7. 移植后+30天根据NK30高低分组卡方分析

	无GVHD组	GVHD组	χ²	P
NK30 ≤ 120	6 (28.6%)	15 (71.4%)	8.006	0.005
NK30 > 120	17 (70.8%)	7 (29.2%)

3.3.2. 移植后+60天与NK细胞计数差异性分析

对比表6数据，aGVHD组(15例)患者NK细胞计数为110.00 (53.00, 187.00) cell/μl，显著低于无aGVHD组(44例) NK细胞计数的181.00 (135.25, 279.75) cell/μl (Z = −2.638, P = 0.008)。Spearman相关性分析表明，NK细胞计数与aGVHD发病呈负相关(r = −0.346, P = 0.007)。

采用ROC曲线计算NK绝对计数的临界值，并用于GVHD的评估及监测，见图2。AUC = 0.730 (95%CI 0.563~0.896)；P = 0.008；灵敏度 = 0.600；特异度 = 0.841；cut-off值129.5个/ul；进一步分组高NK60(即移植后+60天NK细胞计数 ≥ 129.5个/μl)和用低NK60 (即移植后+60天NK细胞计数 < 129.5个/μl)评估高低NK细胞组间与GVHD的差异性，结果证明两组间具有统计学意义(χ²值 = 11.003, P = 0.001)，见表8。

3.3.3. 移植后+90天与NK细胞计数差异性分析

分析表6数据，aGVHD组(24例)患者NK细胞计数为124.00 (87.00, 208.00) cell/μl，显著低于无aGVHD组(30例) NK细胞计数的203.50 (153.75, 382.00) cell/μl (Z = −2.808, P = 0.005)。Spearman相关性分析表明，NK细胞计数与aGVHD发病呈负相关(r = −0.346, P = 0.007)。

采用ROC曲线计算NK绝对计数的临界值，并用于GVHD的评估及监测，见图3。AUC = 0.732 (95%CI 0.604~0.860)；P = 0.002；灵敏度 = 0.583；特异度 = 0.850；cut-off值137.5个/ul；进一步分组高NK90 (即移植后+90天NK细胞计数 ≥ 137.5个/μl)和用低NK90 (即移植后+90天NK细胞计数 < 137.5个/μl)评估高低NK细胞组间与GVHD的差异性，结果证明两组间具有统计学意义(χ²值 = 13.11, P < 0.001)，见表9。

Figure 2. ROC curve of NK cells at +60 days post-transplantation

图2. 移植后+60天NK细胞绘制ROC曲线

Table 8. Chi-square analysis of groups stratified by NK cell levels at +60 days post-transplantation

表8. 移植后+60天根据NK60高低分组卡方分析

	无GVHD组	GVHD组	χ²	P
NK60 ≤ 129.5	7 (45.8%)	9 (56.3%)	11.003	0.001
NK60 > 129.5	37 (86.0%)	6 (14.0%)

Figure 3. ROC curve of NK cells at +90 days post-transplantation

图3. 移植后+90天NK细胞绘制ROC曲线

Table 9. Chi-square analysis of groups stratified by NK cell levels at +90 days post-transplantation

表9. 移植后+90天根据NK60高低分组卡方分析

	无GVHD组	GVHD组	χ²	P
NK90 ≤ 137.5	6 (30.0%)	14 (70.0%)	13.11	<0.001
NK90 > 137.5	34 (77.3%)	10 (22.7%)

3.4. NK细胞与患者预后

3.4.1. GVHD与患者总体生存率

105例患者中，67存活，38例死亡(26例疾病复发，12例死于严重感染)，中位随访时间为21 (1~82)月。

根据是否发生aGVHD，分析3年内和总体患者生存曲线。发现无aGVHD组和GVHD组在3年内和总体OS率，可以看出有无aGVHD的患者在3年内的生存率具有差异(HR = 1.625, P = 0.049)，见图4，图5。

Figure 4. Overall survival curves of the aGVHD group and the non-aGVHD group in 3 years

图4. aGVHD组和无aGVHD3年内生存曲线

Figure 5. Overall survival curves of the aGVHD group and the non-aGVHD group

图5. aGVHD组和无aGVHD总体生存曲线

根据发生aGVHD的严重程度分析，0~I度aGVHD组患者总体OS率为62.7% (37/59)，Ⅱ~Ⅳ度aGVHD组患者总体OS率为65.2% (30/46)，但差异无统计学意义(χ² = 0.070, P = 0.791)，见表10，生存曲线见图6。

对比患者3年内OS率，0~I度患者OS率为44.1% (26/59)，显著高于II~IV度患者19.6% (9/46)，组间具有明显统计学差异(χ² = 6.983, P = 0.008)，见表11。

Table 10. Chi-square analysis of overall survival rates in patients grouped by the severity of aGVHD post-transplantation

表10. 移植后根据发生aGVHD严重性分组，分析患者总体生存率的卡方分析

	GVHD分度
	0~I度	II~IV度	χ²	P
存活	37 (62.7%)	30 (65.2%)	0.07	0.791
死亡	22 (37.2%)	16 (34.8%)

Figure 6. Analysis of overall survival curves based on grouping by the severity of aGVHD

图6. 根据是否发生发生aGVHD严重性分组，分析总体生存曲线

Table 11. Chi-square analysis of overall survival rates in patients grouped by the severity of aGVHD post-transplantation in 3 years

表11. 移植后根据发生aGVHD严重性分组，分析患者3年内生存率的卡方分析

	GVHD分度
	0~I度	II~IV度	χ²	P
3年内存活	26 (44.1%)	9 (19.6%)	6.983	0.008
3年内死亡	33 (55.9%)	37 (80.4%)

Figure 7. Analysis of overall survival curves based on grouping by the severity of aGVHD in 3 years

图7. 根据是否发生发生aGVHD严重性分组，分析3年内生存曲线

生存分析结果发现，Ⅱ~Ⅳ度aGVHD组患者的3年OS率和0~Ⅰ度aGVHD组(44.1% vs. 19.6%, P = 0.001)，差异有显著意义，见图7。

3.4.2. NK细胞计数与患者预后

根据ROC曲线得出NK30、NK60、NK90的截断值，分为高低两组，根据随访结果，以此绘制总生存期、1年生存期、3年生存期和无复发生存曲线图。

根据移植后+30天时NK细胞截断值，分为高NK30组(n = 24)和低NK30 (n = 21)，对比两组之间患者总体OS率、1年OS率和3年OS率，差异均无统计学意义。

根据移植后+60天时NK细胞截断值，分为高NK60组(n = 43)和低NK60 (n = 16)，对比两组之间患者总体OS率、1年OS率和3年OS率，结果提示高NK60组患者1年OS率81.4% (35/43)高于低NK60组56.3% (9/16) (χ² = 3.889, P = 0.049)，见表12。

Table 12. Analysis of differences in 1-year OS rates based on the cut-off value of 129.5 cells/μl at +60 days post-transplantation

表12. 根据移植后+60天cut-off值(129.5 cells/ul)分析患者1年内OS率的差异性

	1年存活	1年死亡	χ²	P
NK60 ≤ 129.5	9 (56.3%)	7 (43.8%)	3.889	0.049
NK60 > 129.5	35 (81.4%)	8 (18.6%)

根据移植后+90天时NK细胞截断值，分为高NK90组(n = 44)和低NK90 (n = 20)，对比两组之间患者总体OS率、1年OS率和3年OS率，结果提示高NK90组患者1年OS率90.9% (40/44)高于低NK90组70.00% (14/20) (χ² = 4.56, P = 0.033)，见表13。

Table 13. Analysis of differences in 1-year OS rates based on the cut-off value of 137.5 cells/μl at +90 days post-transplantation

表13. 根据移植后+90天cut-off值(137.5 cells/ul)分析患者1年内OS率的差异性

90天NK细胞和GVHD	1年存活	1年死亡	χ²	P
NK90 ≤ 137.5	14 (70.0%)	6 (30.0%)	4.56	0.033
NK90 > 137.5	40 (90.9%)	4 (9.1%)

4. 讨论

NK细胞的细胞毒性作用通过一系列表面激活受体(如天然细胞毒性受体NCR)和抑制受体(如抑制性杀伤性免疫球蛋白样受体KIR)的平衡调节功能杀伤异常肿瘤细胞或病毒。同时NK细胞的激活也可以由其他免疫细胞(如巨噬细胞和树突状细胞DC)诱导，通过直接的细胞间接触或释放细胞因子(如IL-12、IL-15、IL-18和IFN-ɑ/β)，促进NK细胞的细胞毒性和IFN-γ的产生[4]。而GVHD的发生依赖于供体αβ-T细胞识别宿主MHC分子并激活免疫反应，在allo-HSCT后，供体NK细胞的抑制性KIR无法识别宿主HLA分子时，NK细胞被激活，从而发挥GVL效应。在国外研究中[5]提到NK细胞可以通过分泌IL-10等细胞因子调节免疫微环境，或直接杀伤活化的αβ-T细胞，从而减轻GVHD。

NK细胞是GVL的有效效应器，越来越多的证据[6]表明移植后早期NK细胞恢复的预后价值。在本研究中，我们关注早期NK细胞恢复，并证明NK细胞在移植后+60天和+90天的计数水平与血液病患者在异基因造血干细胞移植后的疾病生存相关，这一发现可以为临床早期识别aGVHD提供帮助，也提示NK细胞可能成为aGVHD防治的新靶点。

NK细胞是受者体内抗肿瘤的重要介质，是先天免疫系统的重要的部分，在HSCT后早期免疫重建中发挥重要作用。有研究报道[7]，供者NK细胞在体内激活后可灭活受者体内抗原递呈细胞，阻断aGVHD 的起始环节，发挥抗aGVHD的作用。Dunbar [8]等学者通过检测167例患者发现，移植后60天接受具有高NK细胞水平的移植后患者在1年时具有显著更高的存活率；Ando团队研究显示[9]，移植后早期NK细胞重建较高的患者累积复发率较低，NK细胞重建延迟和较低的患者结局较差。在Mushtaq等人的研究发现[10]，较高的NK细胞重建与较好的2年OS相关。Shannon等人[11]使用PTCy作为预防GVHD的方案，发现NK细胞的早期恢复是良好预后的保护性因素，早期达到较高水平NK细胞计数，可显著提高总生存率，降低复发率和非复发死亡率。在本研究中显示，移植后+60天和+90天的较高水平的NK细胞和移植后1年高OS率相关，这与上述文章中结论相似。

目前已有多个中心研究NK细胞和GVHD的相关性，Ullrich团队研究表明[12] aGVHD的发生率和严重程度与CD 56 high NK细胞亚群重建延迟相关，但同时NK细胞重建还受到干细胞来源和预处理条件等影响。Podgorny [13]等人调查了一个大型患者队列，并观察到aGVHD期间总NK细胞和细胞毒性NK细胞的数量减少。本研究结果显示，发生aGVHD患者的NK细胞计数低于未发生aGVHD的患者，且Ⅱ~Ⅳ度aGVHD低于0~Ⅰ度aGVHD患者，NK细胞计数与aGVHD发病呈中度负相关，这与上述研究基本相符。同时本研究针对患者移植后各月份NK细胞的影响因素做分析，发现移植后NK细胞重建还受到预处理方案影响。

另外，NK细胞是防御感染的重要屏障，Clausen等人研究表明，[14]较高的NK细胞重建降低了CMV再激活率，并可以改善CMV再激活患者的结局。在Auger [15]等人的研究中，EB病毒再激活患者的NK细胞中位数增加了，这表明NK细胞在控制EB病毒感染以及改善患者预后方面可能起着重要作用。在一项1期临床研究中[16]，通过输注NK细胞，对比未输注的对照组发现，治疗组的复发率和病毒感染率均低于对照组。

影响移植后NK细胞重建的因素很多，国内中心研究中[17] [18]发现移植后血液中NK细胞计数与移植物中CD34⁺细胞数量密切相关。在一项儿童血液病移植研究中[19]，与HLA相匹配的造血干细胞移植相比，接受PTcy单倍体造血干细胞移植的儿童患者的免疫重建可能会延迟，这提示PTcy的使用可能对移植后免疫重建产生影响。在一篇前瞻性研究中[20]，比较非亲缘供体移植后淋巴细胞的重建，发现减低强度预处理(RIC)与早期的NK细胞重建相关，而ATG的使用显著影响移植后早期NK细胞的数量恢复。在另一篇前瞻性研究中[21]，将同时使用PTcy和ATG分组，发现相比对照组，这一组的NK细胞重建速度和成熟度均高于对照组。在本研究中，我们发现NK细胞计数的重建可能与预处理方案使用ATG有关(移植后+30天单因素分析显示ATG与NK细胞数相关，P = 0.026)，但多元回归中未达显著，这可能与同时发生GVHD和供者类型存在交互作用，掩盖了真实关联。同时使用PTcy对NK细胞免疫重建可能会产生影响(移植后+60天分析中显示与NK细胞数相关，β = −66.676，P = 0.039)，但在PTcy的使用可能与供者类型产生多重共线性，影响分析准确性。

然而，由于本研究基于单中心研究，回顾性分析受限于样本来源单一，且患者基础疾病类型、预处理方案及免疫抑制剂使用存在差异，可能影响结论。另外，本研究仅分析了NK细胞的整体重建趋势，对特定亚群(如CD56⁺CD16⁻调节性NK细胞)的功能变化缺乏深入探讨。此外，本研究由于时间跨度大，未能动态追踪NK细胞重建与GVHD发生的时序关系，难以明确二者的因果关联。

基于以上不足，未来研究还期待多中心或大样本研究进一步验证，并探索不同移植方案下的作用差异。总体而言，NK细胞重建与GVHD的关联研究为移植免疫领域开辟了新方向，未来有望通过多学科交叉探索，推动GVHD防治技术的革新。

5. 结论

综上，移植后NK细胞计数与aGVHD的发生和预后存在一定联系，可辅助临床早期识别aGVHD高危病人，也为防治aGVHD提供了新的治疗思路。

NOTES

^*通讯作者。