印记基因SNRPN与不明原因复发性流产的相关性研究

Correlation Study of Imprinted Gene SNRPN and Unexplained Recurrent Miscarriage

摘要: 目的：探讨印记基因SNRPN的表达、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)及其启动子区甲基化状态与不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion ,URSA)的相关性。方法：选择2021年7月至2023年2月本院31例不明原因复发性流产患者绒毛组织(URSA组)和34例正常妊娠自愿流产患者的绒毛组织(对照组)为研究对象。采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测两组绒毛组织中SNRPN的mRNA表达水平；通过一代(Sanger)测序分析SNRPN多个SNP位点的差异；利用甲基化转化试剂盒结合PyroMark Q96实时定量焦磷酸系列分析仪检测SNRPN基因启动子区的甲基化状态。结果：1) URSA组绒毛组织中SNRPN的相对表达量显著高于对照组(0.55 ± 0.81 vs. 0.17 ± 0.16，P < 0.05)。2) URSA组和对照组的SNRPN基因rs220030位点基因型、等位基因分布差异有统计学意义(P < 0.05)，而rs7164989、rs12905653、rs705位点差异无统计学意义(P > 0.05)。3) 甲基化检测结果显示，URSA组SNRPN基因启动子区的甲基化水平显著低于对照组(P < 0.05)，低甲基化状态可能通过增加SNRPN基因的表达水平，进而促进URSA的发生。结论：URSA患者绒毛组织中SNRPN基因的高表达可能与其启动子区低甲基化状态有关，而rs220030位点的单核苷酸多态性可能与URSA的发生密切相关。这些发现为URSA的发病机制提供了新的视角，并为临床诊断和治疗提供了潜在的生物标志物。

Abstract: Purpose: To explore the expression of the imprinted gene SNRPN and single nucleotide polymorphism the correlation between SNP and the methylation status of its promoter region and unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA). Methods: The chorionic villus tissues of 31 patients with unexplained recurrent miscarriage (URSA group) and 34 patients with normal pregnancy and voluntary miscarriage (control group) in our hospital from July 2021 to February 2023 were selected as the research subjects. The mRNA expression levels of SNRPN in the villus tissues of the two groups were detected by real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR). The differences of multiple SNP loci of SNRPN were analyzed through first-generation (Sanger) sequencing; The methylation status of the promoter region of the SNRPN gene was detected by using the methylation conversion kit combined with the PyroMark Q96 real-time quantitative pyrophosphate series analyzer. Results: 1) The relative expression level of SNRPN in the villous tissue of the URSA group was significantly higher than that of the control group (0.55 ± 0.81 vs. 0.17 ± 0.16, P < 0.05). 2) There was a statistically significant difference in the genotype and allele distribution of the SNRPN gene at the rs220030 locus between the URSA group and the control group (P < 0.05), while there was no statistically significant difference at the rs7164989, rs12905653, and rs705 loci (P > 0.05). 3) The methylation detection results showed that the methylation level in the promoter region of the SNRPN gene in the URSA group was significantly lower than that in the control group (P < 0.05). The hypomethylation state might promote the occurrence of URSA by increasing the expression level of the SNRPN gene. Conclusion: The high expression of the SNRPN gene in the villous tissues of patients with URSA may be related to the hypomethylation status of its promoter region, while the single nucleotide polymorphism at the rs220030 locus may be closely related to the occurrence of URSA. These findings provide a new perspective on the pathogenesis of URSA and offer potential biomarkers for clinical diagnosis and treatment.

1. 引言

自然流产是早期妊娠中常见的并发症，其发生率约为15%~25% [1]。当妊娠早期连续发生三次或以上自然流产时，被定义为复发性流产(recurrent spontaneous abortion, RSA) [2]。RSA的发生风险随着流产次数的增加和孕妇年龄的增长而显著上升[3]。RSA的病因复杂多样，涉及染色体或基因异常、生殖系统解剖结构异常(包括先天性和获得性)、自身免疫性疾病、血栓前状态(遗传性和获得性)、内分泌紊乱、感染因素等[4]-[6]。尽管如此，仍有相当一部分RSA患者的病因尚不明确，排除上述已知因素后的RSA被称为不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA) [7] [8]。URSA的发病机制一直是生殖医学领域的研究热点和难点，其复杂性在于多种潜在因素可能相互作用，导致胚胎无法正常发育，最终引发流产[9] [10]。

近年来，表观遗传学的快速发展为理解URSA的发病机制提供了新的视角[11]。表观遗传修饰，尤其是DNA甲基化，作为一种可遗传的基因表达调控机制，能够在不改变DNA序列的情况下，通过化学修饰影响基因的转录活性[12]-[14]。DNA甲基化主要发生在CpG岛区域，通常情况下，高甲基化状态会抑制基因的表达，而低甲基化则可能导致基因表达的上调[15] [16]。这种表观遗传调控在胚胎发育过程中尤为重要，因为它可以精细地调节基因的时空表达，确保胚胎正常发育[17] [18]。

印记基因是一类在基因组中表现出亲本特异性表达的基因，即来自父本和母本的等位基因在功能上存在差异，只有来自特定亲本的等位基因能够表达，而另一个等位基因则被沉默[19]。这种独特的表达模式对于胚胎和胎盘的正常发育至关重要[20] [21]。SNRPN (small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N)基因是一个典型的印记基因，属于母源印记、父源表达基因[22] [23]。它编码的小核糖核蛋白多肽N在细胞分化、增殖、胚胎发育以及精神行为调控中发挥重要作用[24] [25]。研究表明，SNRPN基因的异常表达和印记功能紊乱可能导致胚胎发育异常，进而引发流产[26] [27]。此外，SNRPN基因的表达受到DNA甲基化的严格调控，其启动子区的甲基化状态变化可能直接影响基因的表达水平[28] [29]。

本研究旨在通过综合检测SNRPN基因在URSA患者和正常妊娠者的绒毛组织中的表达水平、单核苷酸多态性(SNP)以及启动子区的甲基化状态，深入探讨其在URSA发病机制中的潜在作用。通过qRT-PCR法检测SNRPN基因的mRNA表达水平，利用一代(Sanger)测序法分析多个SNP位点的差异，并采用甲基化测序技术检测启动子区的甲基化状态，以期为URSA的临床诊断和治疗提供新的生物标志物和潜在的干预靶点。这一研究不仅有助于揭示URSA的分子机制，还可能为预防和治疗这一复杂的生殖医学问题提供新的思路和方法。

2. 材料与方法

2.1. 研究对象与分组

选择2021年7月至2023年2月在青岛大学附属医院就诊的URSA患者31例为研究组，同期因计划外妊娠要求行人工流产术的正常妊娠患者34例为对照组，留取两组的绒毛组织。

研究组纳入标准：① 符合URSA诊断标准，且为单胎妊娠，20岁 ≤ 年龄 ≤ 40岁，流产时间在妊娠12周内；② 夫妻双方均为汉族人，绒毛染色体检查均正常，无家族遗传病史；③ 女性为生育期妇女，无基础疾病，如慢性高血压、糖尿病或肾脏、心血管与甲状腺疾病，无自身免疫性疾病；行内分泌、抗心磷脂抗体、抗子宫内膜抗体检测均阴性，检查前1月内未患感染性疾病，且未服用过任何药物；④ 男性精液检查结果正常。

对照组纳入标准：① 按照年龄和停经时间进行匹配，选择同期在我院妇产科就诊的健康生育期妇女，自愿要求终止妊娠，无上述基础疾病，无不良妊娠史；② 既往正常分娩1胎及以上；③ 经盆腔B超证实宫内早孕且为单胎妊娠；④ 无妊娠高危因素，孕期内未患感染性疾病，亦未服用过任何药物。

本实验研究经青岛大学附属医院伦理委员会批准，并且研究对象均签署知情同意书。

2.2. 研究方法

2.2.1. 标本采集

于负压吸引人工流产术时留取绒毛组织，使用生理盐水漂洗后分两份收集，一份用于基因组DNA提取，一份加入RNA store后于−80℃冰箱保存直至实验开始。

2.2.2. RT-PCR检测

以绒毛组织为研究对象，采用RNA提取液对其中的总mRNA进行提取，确保获取高质量的mRNA样本。随后，借助SweScript All-in-One SuperMix试剂，将提取的绒毛mRNA精准反转录为cDNA，为后续的基因表达分析奠定基础。在实时荧光定量PCR环节，选用SYBR Green qPCR Master Mix (None ROX)作为反应体系，以GAPDH作为内参照基因，以确保实验结果的准确性与可靠性。使用CFX Connect实时定量PCR系统进行实时荧光定量PCR反应，PCR反应条件为：95℃ 30 s预变性；95℃ 15 s、60℃ 30s，总共40个循环；65℃→95℃，每升温0.5℃，采集一次荧光信号。通过DDCT法计算靶基因的相对表达量。为了确保实验结果的可靠性，所有实验均重复3次，并采用双尾t检验进行统计分析。

2.2.3. 组织总蛋白提取

组织标本用预冷的PBS洗涤2~3次，去除血污，剪成小块置于匀浆管中，加入2颗4 mm的匀浆珠，加入10倍组织体积的裂解液，设置匀浆程序进行匀浆；将匀浆完成的匀浆管取出，放置冰上裂解液30 min，每隔5 min震荡一次确保组织完全裂解；12000 rpm，4℃，离心10 min，收集上清，即为总蛋白溶液。

2.2.4. Western Blot检测

首先采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。随后将蛋白样品加入5 × 蛋白还原型上样缓冲液(货号G2075-100ML)，沸水浴变性15分钟，取适量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。将分离后的蛋白转至PVDF膜上，转膜条件为300 mA恒流，30分钟。转膜后用5%脱脂奶粉封闭膜，室温孵育1小时。加入抗SNRPN一抗(稀释比例1:500)，4℃孵育过夜。加入二抗(稀释比例1:5000)，室温孵育1小时。最后使用化学发光仪曝光，分析条带灰度值。

2.2.5. SNRPN基因型分析

利用一代(Sanger)测序的方法，对SNRPN基因rs220030、rs7164989、rs12905653、rs705进行了基因分型。设计引物软件用Primer 5设计，并由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及长度(见表1)。将1 ul基因组DNA、1ul dNTP、2.5 ul Taq Buffer、0.2 ul Taq酶以及双蒸水混合，得到25 ul的反应混合物；按照如下程序扩增：95℃ 5 min；94℃ 30 s，63℃ (−0.5℃/循环) 30 s，72℃ 30 s，10个循环；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 10 min。使用美国ABI公司生产的3730XL测序仪对PCR产物进行测序，并用sequence analysis软件进行分析。

Table 1. Primer sequences of SNRPN dots

表1. SNRPN 各位点引物序列

位点	引物序列(5'-3')	片段长度(bp)
rs7164989	F:TCGGTTATTTTGTGCGTCTC
rs7164989	R:TCCAACATTAACAGGGAAAACAC	289
rs12905653	F:ACATGAGGAGGCAGGAGAAG
rs12905653	R:TTCTTTGCCCCTTTTCACTC	293
rs220030	F:GGGATATTTTCTTTTGGAAGGATTT
rs220030	R:GAAACCATAAGCAACCTGGGATC	252
rs705	F:TTTTGAACGTGTCTGTCATAGTG
rs705	R:AGCACATTTCAACCCTCAGC	282

2.2.6. DNA提取

使用TIANamp Genomic DNA Kit基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，根据使用说明，从先前获取的绒毛组织中提取基因组DNA，置−20℃冰箱保存备用。

2.2.7. SNP检测

将提取后的DNA用紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度。根据SNRPN基因的SNP位点设计特异性引物，进行PCR扩增。反应体系为：10 × PCR Buffer 5 μL，dNTP 3 μL，引物F和R各2 μL，Taq酶0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O补至50 μL。反应条件为：95℃ 3~5分钟预变性，94℃ 30秒变性，55~60℃ 25~30秒退火，72℃ 30~50秒延伸，共35个循环，最后72℃延伸5~8分钟。随后将PCR产物进行纯化后，送至测序公司进行测序分析。

2.2.8. 甲基化测序

利用提取的绒毛组织DNA，用甲基化转化试剂盒(EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit)对DNA样本进行转化。以转化后的DNA样本为模板，进行PCR扩增。取15~20 μL PCR产物上PyroMark Q96实时定量焦磷酸系列分析仪进行测序分析。

2.2.9. 统计分析

采用GraphPad Prism统计软件进行统计分析。计量资料以均数 ± 标准差表示，组间比较采用t检验，Hardy-Weinberg遗传平衡及组间计数资料采用χ²检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2.2.10. 数据可用性声明

本研究中使用的原始数据可在作者处获取，用于进一步分析和验证。所有数据均经过匿名处理，以保护患者隐私。

3. 结果

在本研究中，我们首先对不明原因复发性流产(URSA)组和正常妊娠对照组的基础指标进行了比较，以确保两组在年龄、孕周和体重指数(BMI)等基本特征上具有可比性(见表2)。结果显示，两组在这些指标上无显著差异(P > 0.05)，表明两组具有可比性，为后续的基因表达和单核苷酸多态性分析提供了合理的基础。

Table 2. Comparison of basic conditions between the two groups ($\overline{x}\pm s$ )

表2. 两组基本情况比较($\overline{x}\pm s$ )

	URSA组	对照组	P值
样本量	31	34	-
年龄(岁)	31.97 ± 5.48	33.97 ± 4.06	0.14
孕周	8.18 ± 1.19	7.90 ± 1.04	0.32
BMI(Kg/m^2)	23.81 ± 3.0	24.27 ± 3.66	0.50
既往自然流产数(次)	3.68 ± 0.82	0	0
既往自然流产孕龄(周)	8.57 ± 1.45	0	0

注：BMI (Body Mass Index)：体重指数。

3.1. SNRPN基因在URSA患者绒毛组织中的mRNA水平高表达

本研究通过实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测了SNRPN基因在URSA患者绒毛组织中的mRNA表达水平。结果显示，与正常妊娠的对照组相比，URSA组绒毛组织中SNRPN基因的mRNA相对表达量显著升高，差异具有统计学意义(P < 0.05)。具体而言，URSA组的mRNA相对表达量为(0.55 ± 0.81)，而对照组为(0.17 ± 0.16) (图1)。这一结果表明，在不明原因复发性流产患者中，SNRPN基因在mRNA水平上呈现高表达状态，提示其可能在URSA的发生和发展过程中发挥重要作用。

Figure 1. Shows that the mRNA level of SNRPN gene is highly expressed in the villous tissues of URSA patients. The expression of SNRPN mRNA in the villous tissues of the two groups of patients

图1. SNRPN基因在URSA患者绒毛组织中的mRNA水平高表达。两组患者绒毛组织SNRPN mRNA表达情况

3.2. SNRPN基因在URSA患者绒毛组织中的蛋白水平高表达

为了进一步论证SNRPN基因在URSA患者绒毛组织中的作用，我们通过Western Blot检测结果进一步验证了SNRPN基因在蛋白水平的表达情况。与正常妊娠的对照组相比，URSA组绒毛组织中SNRPN蛋白的表达水平显著升高，差异具有统计学意义(P < 0.05) (图2(A)~(C))。这一结果与mRNA水平的检测结果一致，进一步支持了SNRPN基因在不明原因复发性流产患者绒毛组织中高表达的结论，提示其可能在URSA的发生和发展过程中发挥重要作用。

Figure 2. The SNRPN gene is highly expressed at the protein level in the villus tissues of URSA patients. (A) (B) The protein expression of SNRPN in the villus tissues of the two groups of patients; (C) Quantitative bar chart of protein expression

图2. SNRPN基因在URSA患者绒毛组织中的蛋白水平高表达。(A) (B) 两组患者绒毛组织SNRPN蛋白表达情况；(C) 蛋白表达量化柱状图

3.3. SNRPN基因SNP位点与URSA的相关性分析

本研究对两组研究对象的SNRPN基因rs220030、rs7164989、rs12905653、rs705位点进行了深入分析。检测结果显示，两组在这些位点的检测均符合Hardy-Weinberg平衡定律，差异无统计学意义(P > 0.05)，这充分证明了研究对象的样本具有良好的代表性，为后续分析奠定了可靠基础。URSA组SNRPN基因rs220030位点TT基因型频率为48.4%，高于对照组17.6%，T等位基因频率为67.7%，高于对照组50%。两组人群中该位点基因型、等位基因分布差异有统计学意义(P < 0.05)，SNRPN基因的rs7164989位点、rs12905653位点及rs705位点的基因型及等位基因分布情况差异无统计学意义(P > 0.05) (见表3)。

Table 3. Comparison of genotype and allele frequencies of SNRPN gene SNP loci in the two groups

表3. 两组SNRPN基因SNP位点基因型及等位基因型频率的比较

基因	位点	GT/AT	URSA组 例数/频率%	对照组 例数/频率%	χ^2	P值
SNRPN基因	rs220030	CC	4 (12.9)	6 (17.6)	7.06	0.029
		TC	12 (38.7)	22 (64.7)
		TT	15 (48.4)	6 (17.6)
		C	20 (32.3)	34 (50.0)	4.2	0.04
		T	42 (67.7)	34 (50.0)
SNRPN基因	rs7164989	AA	6 (19.4)	9 (26.4)	4.42	0.11
		AG	22 (71.0)	16 (47.0)
		GG	3 (9.7)	9 (26.4)
		G	34 (54.8)	34 (50.0)	0.30	0.58
		A	28 (45.2)	34 (50.0)
SNRPN基因	rs12905653	CC	29 (93.5)	31 (91.2)	0.18	0.67
		TC	2 (6.5)	3 (8.8)
		TT	0	0
		C	60 (96.8)	65 (95.6)	0.12	0.73
		T	2 (6.5)	3 (4.4)
SNRPN基因	rs705	CC	9 (29.0)	8 (23.5)	4.05	0.13
		TC	12 (38.7)	21 (61.8)
		TT	10 (32.3)	5 (14.7)
		C	30 (48.4)	37 (54.4)	0.47	0.49
		T	32 (51.6)	31 (45.6)

3.4. SNRPN基因启动子区甲基化状态与URSA的相关性

我们采用NGS (Next-Generation Sequencing)甲基化检测技术结合BSP (Bisulfite Sequencing PCR)技术，对两组样本的SNRPN基因启动子区的甲基化状态进行了检测。具体检测的MNA238-1基因片段中含有21个CpG位点，位置分别为：2，15，21，23，27，43，45，57，69，79，90，99，111，115，118，131，148，158，160，168，187。检测结果显示，URSA组在多个CpG位点的甲基化率普遍低于对照组，差异具有统计学意义(P < 0.05)。此外，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证，条带单一、大小正确，表明扩增成功。甲基化检测的点状图和热图也直观反映了两组样本在各个CpG位点的甲基化状态差异(图3(A)~(B))。综合以上结果，表明SNRPN基因在URSA患者中呈现低甲基化状态(P < 0.05)。

(A)

(B)

Figure 3. Correlation between the methylation status of the SNRPN gene promoter region and URSA.A Dot plot and quantitative data of methylation detection; B Heat map of methylation detection

图3. SNRPN基因启动子区甲基化状态与URSA的相关性。(A) 甲基化检测点状图及量化数据；(B) 甲基化检测热图

4. 讨论

4.1. SNRPN在URSA中异常高表达的生物学意义

本研究通过qRT-PCR与Western blot双重验证，首次在蛋白与转录两个层面同时发现：不明原因复发性流产(URSA)患者绒毛组织中SNRPN的表达量显著高于同期自愿终止妊娠的健康对照。该结果不仅提示SNRPN在URSA的发生发展中可能扮演重要角色，也为我们理解印记基因在胎盘–胚胎对话中的精细调控打开了一扇新的窗口。从功能学角度看，SNRPN编码的小核糖核蛋白多肽N是剪接体的核心组分，其过量表达可能扰乱滋养层细胞关键基因的可变剪接[30] [31]。已有研究指出，滋养层侵袭能力高度依赖于HLA-G、MMP-2/9、VEGF 等分子的正确剪接体[32] [33]；因此推测一旦剪接失衡，滋养层细胞便难以有效的完成子宫螺旋动脉重塑，随之发生胎盘灌注不足。此外，SNRPN所在的15q11-q13印记区域并非“孤岛”，而是与UBE3A、MAGEL2、NDN等多个印记基因形成的协同调控网络[34]-[36]。推测SNRPN的异常高表达可能通过长程染色质的交互作用，放大整个印记区域的功能紊乱，进而诱发胎盘发育不全[37] [38]。

值得注意的是，临床病理也观察到URSA患者绒毛结构稀疏、血管腔狭窄、合体滋养层变薄等典型改变[39]，提示与SNRPN过表达所导致的“滋养层功能抑制”表型高度吻合。更进一步的机制研究提示，SNRPN过表达可上调p53/Bax凋亡轴并下调Bcl-2抑制凋亡基因，促使绒毛细胞凋亡加速[40]。虽然本研究尚未直接检测凋亡指数，但从组织学到分子生物学的多重证据链已初步勾勒出“SNRPN上调→剪接紊乱/凋亡增加→胎盘发育障碍→流产”这一合乎逻辑的病理路径，为后续功能实验提供了明确靶点。

4.2. rs220030位点多态性与URSA的遗传易感性

为了探索SNRPN过表达的原因，我们聚焦于遗传学层面，以阐释SNRPN的过表达机制。在四个候选SNP位点中，仅rs220030显示出与URSA的显著关联：URSA组TT基因型频率高达48.4%，而对照组仅17.6%；T等位基因频率亦从50.0%跃升至67.7%，这一差异绝非统计学上的偶然。rs220030恰好坐落于SNRPN启动子区近端，且位于CTCF结合峰的核心序列[41]。CTCF不仅是染色质三维结构的“建筑师”，更是维持印记区域绝缘子功能的核心执行者[42]。推测当该位点表现为T等位基因时，CTCF结合亲和力显著下降，染色质环化结构松弛，原本被严格抑制的母源等位基因便发生“泄漏表达”，从而打破印记平衡[43]。更有意思的是，我们在亚组分析中观察到，携带T等位基因的个体，其启动子区甲基化水平较CC/CT型进一步降低。这提示rs220030可能通过“遗传–表观遗传协同”双轨机制放大风险：一方面削弱CTCF的绝缘功能，另一方面可能干扰DNMT3A的招募，使局部CpG岛持续低甲基化[44]。这种“SNP引导甲基化”现象在IGF2/H19区域已有先例[45]，本研究首次将其延伸到SNRPN-URSA轴。未来，借助CRISPR-SAM或CRISPRi系统在滋养层干细胞中定向引入不同的等位基因，并结合CUT&RUN、Hi-C等多维技术，有望精确描绘rs220030如何通过三维基因组重构影响SNRPN表达，从而验证这一因果链条。

4.3. 启动子区低甲基化驱动SNRPN过表达的表观遗传机制

低甲基化本身构成了我们讨论的第三重维度。焦磷酸测序结果显示，URSA组SNRPN启动子区21个CpG位点中有17个位点的甲基化水平显著低于对照，且甲基化程度与mRNA表达呈显著负相关[46]。这一发现提示低甲基化可能与基因过表达相关，但仍需功能实验证实其因果关系。低甲基化意味着该区域失去了“关闭”基因表达的化学标签，转录抑制复合物(MeCP2-HDAC-Sin3A)难以驻留，而激活因子(Sp1、RNA Pol II)则更易占据启动子，形成开放染色质状态[47]。然而，低甲基化并非凭空出现，它往往有迹可循：其一，URSA患者常伴随高同型半胱氨酸血症，后者通过抑制S-腺苷甲硫氨酸合成全面削弱DNMT1/3A活性；其二，氧化应激可激活 TET1/2 双加氧酶，催化5mC→5hmC→未甲基化C，使启动子区甲基化标记被动稀释；其三，动物实验提示，母代低甲基化状态可经卵母细胞跨代传递，造成子代URSA易感性增加[48]-[50]。虽然本研究尚未采集母体血清代谢与氧化应激指标，也未能追踪多代家系，但已为后续“环境因素–表观遗传–疾病”整合研究提供了路线图。更值得憧憬的是，低甲基化提供了可逆干预窗口，叶酸、甜菜碱等甲基供体补充可在一定程度上恢复DNMT活性，逆转关键区域低甲基化。未来，可在滋养层干细胞或URSA小鼠模型中，测试甲基化酶抑制剂或甲基供体补充对SNRPN表达及胎盘表型的拯救效应，为临床表观遗传治疗奠定实验依据。

4.4. 研究局限性

尽管本研究为URSA的病因学提供了新的线索，但其结论仍需在更严谨的框架下加以审视。首先，65例的小样本量限制了统计功效，既可能夸大rs220030的效应，也易把真实但微弱的关联误判为阴性，例如rs7164989位点AG基因型在URSA组71.0%与对照组47.0%的差异因样本不足而未达显著(P = 0.11)，提示其潜在风险或被掩盖，需更大样本加以验证。其次，病例–对照的横断面设计只能提示关联而无法证实因果：SNRPN表达升高究竟是流产的触发因素，还是胚胎发育异常的继发表现，尚难定论。第三，研究缺乏功能验证，基因编辑或甲基化干预实验的缺位使我们无法直接证明“低甲基化→SNRPN上调→胎盘功能障碍”这一链条的因果顺序。此外，叶酸摄入、氧化应激水平、生活方式等潜在混杂因素未被系统记录，人群又局限于同一地区的汉族育龄妇女，结果的外推性仍需审慎。未来工作应在多中心、多种族队列中扩大样本量，借助前瞻性随访明确时间顺序；同时，在滋养层干细胞或URSA动物模型中，通过CRISPR-dCas9介导的甲基化编辑或SNRPN表达干预，检验表观遗传修饰与妊娠结局之间的因果关系；并同步收集母体代谢及环境暴露数据，以控制混杂，最终为URSA的精准预警和个体化干预提供更具说服力的证据。

5. 结论

综上，本研究以“表达–遗传–表观遗传”三重奏的视角，首次系统阐释了SNRPN在不明原因复发性流产中的核心作用。启动子区低甲基化是“开关”，rs220030位点多态性是“调节旋钮”，两者协同导致SNRPN过度表达，进而通过剪接紊乱、凋亡激活、印记网络失衡等多重路径诱发胎盘功能障碍与流产。这一发现不仅填补了印记基因与URSA关联的知识空白，也为临床提供了可操作的生物标志物组合(甲基化水平 + rs220030分型)与潜在的表观遗传干预靶点。随着单细胞甲基化测序、类器官胎盘模型和基因编辑技术的成熟，我们有望绘制更加精细的“胎盘表观遗传地图”，最终实现URSA的精准预警与个体化治疗。

致 谢

感谢徐金娥教授对本研究的指导和稿件的编辑。我们感谢本研究的所有作者的贡献。

作者贡献

徐金娥设计并构思了这项研究。张雪蕾、刘倩倩、常靖进行了实验并分析了数据。徐志彦、谷前伟、姚丽莎、提供了建议和技术援助。张雪蕾起草了手稿并修改了手稿。所有作者均已为最终稿件做出贡献并批准了最终稿件。

数据可用性声明

实验期间生成的数据可在通讯作者的合理要求提供。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

临床伦理声明

我们的研究是根据赫尔辛基宣言的原则进行的，并获得了青岛大学附属医院伦理审查委员会的批准。临床样本信息从患者记录中获得，所有数据都是匿名的，并经过患者同意。

NOTES

^*通讯作者。