单硝酸异山梨酯择时释放渗透泵片在家兔体内的药动学研究

Pharmacokinetics Study of Timed- and Controlled-Release Osmotic Pump System of Isosorbide Mononitrate in Rabbits

摘要: 目的：考察单硝酸异山梨酯择时释放渗透泵控释片在家兔体内的药动学。方法：采用双周期交叉试验设计对所制备的单硝酸异山梨酯择时微孔渗透泵片和市售缓释片进行了家兔体内药动学考察。结果：两制剂T_max分别为9.67 ± 0.31 h和2.68 ± 0.34 h，C_max分别为178.23 ± 17.22 ng/ml和323.67 ± 35.75 ng/ml，MRT分别为12.25 ± 0.66 h和7.58 ± 0.80 h。结论：表明所制备的单硝酸异山梨酯择时释放渗透泵控释片的血药浓度较为平稳，时滞约4 h，能够较好的符合心血管疾病的发病规律。

Abstract: Objective: To study the pharmacokinetics of isosorbide mononitrate timing microporous osmotic pump tablets in rabbits. Methods: Pharmacokinetics of isosorbide mononitrate timing microporous osmotic pump tablets and marked sustained release tablets were evaluated in rabbits through two period cross-over design. Results: The pharmacokinetic parameters of the test and reference formulation are as below: T_max 9.67 ± 0.31 and 2.68 ± 0.34 h; C_max 178.23 ± 17.22 and 323.67 ± 35.75 ng/ml; MRT 12.25 ± 0.66 and 7.58 ± 0.80 h, respectively. Conclusion: The results showed that the prepared isosorbide mononitrate timing microporous osmotic pump tablets with a lag time of about 4 h and a steady drug concentration, and it better complied with the circadian rhythms of cardiovascular diseases.

1. 引言

单硝酸异山梨酯(isosorbide 5-mononitrate, 1)是硝酸异山梨酯(isosorbide dinitrate)的主要生物活性代谢物，主要用于心绞痛的预防以及心肌梗死后持续心绞痛的治疗。其主要药理作用是释放NO，松弛血管平滑肌，降低心脏的前后负荷，从而使心肌耗氧量减少，供氧量增多，心绞痛得以缓解[1]。

据时辰药理学研究发现，心绞痛具有明显的昼夜节律性，其在清晨发生的机率极高，不仅使症状加重甚至可导致死亡。因此，传统的零级或一级释药系统已经无法满足临床治疗的需要[2]。一个理想的心绞痛的治疗药物应该能够根据时辰药理学来释放药物，既能使药物在作用期间恒速释放而保持平稳的血药浓度、减小副作用的产生，也能使药物在清晨醒来后体内浓度达到峰值，可有效控制清晨醒来后心绞痛的突发，从而最终达到优化疗效的目的。本文为了考察自制制剂[3] [4] (在体外释药实验中产生4 h时滞并在时滞后平稳释放药物)在体内是否具有与体外相似的释药特征，以自制1择时释放渗透泵控释片为对象，市售1的缓释片为参比制剂，考察了其在家兔体内的释药过程，并计算了其在体内的各种药动学参数。

2. 材料与方法

2.1. 材料

LC-10AP高效液相色谱仪(日本岛津分析仪器公司)；SPD-10Avp紫外检测器(日本岛津分析仪器公司)；N-2000双通道色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所)；TGL-16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；HH-2数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；XW-80A漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)；台式离心机(上海医疗器械(集团)有限公司)；受试制剂：1择时释放渗透泵控释片(自制，40 mg)；参比制剂：1缓释片(鲁南贝特制药有限公司，40 mg，批号29130911)；1原药(山东方明药业集团股份有限公司，纯度98%，批号20210929)；茶碱(2，内标物，北京精华耀邦医药科技有限公司)；肝素钠(中国医药集团上海试剂公司)；乙腈(德国默克，色谱纯)；乙酸乙酯(南京化学试剂有限公司)；碳酸钾(南京化学试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯；SPF级家兔6只，雌雄各半，体重约为2 kg，实验前一周未服用其它药物，精神状态良好，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，合格证号：SCXK2012-0008。

2.2. 实验方法

2.2.1. 对照品溶液的制备

精密称取1原料药10 mg，置100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容得1浓度为100 μg/ml的1贮备液。精密量取1贮备液适量，用甲醇稀释得浓度分别为125 ng/ml、250 ng/ml、500 ng/ml、1000 ng/ml、1500 ng/ml、2500 ng/ml、5000 ng/ml的一系列浓度的1标准溶液。

2.2.2. 内标溶液的制备

精密称取2内标10 mg置10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得浓度为1000 mg/l的内标贮备液。精密量取内标贮备液适量，用甲醇稀释得浓度为10 mg/l的内标工作液。

2.2.3. 家兔血浆的处理

精密吸取血浆样品500 μl，置于10 ml的离心管中，加入内标(2溶液2 μg/ml) 50 μl，加入饱和碳酸钾100 μl，涡旋振荡1 min，再加入3 ml乙酸乙酯，涡旋振荡5 min，离心(4000 r/min) 20 min，取上层清液置另一离心管中，50℃水浴下氮气吹干，加入流动相100 μl溶解，离心(15,000 r/min) 10 min后，取上清液，备测。

2.2.4. 1的血药浓度测定

色谱条件[2]：色谱柱：BDS HYPERSIL C₁₈ (250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈–水(10:90, v/v)；检测波长：210 nm；流速：1.0 ml/min。柱温：35℃；检测灵敏度：0.005 AUFS；进样量：20 μl。

2.2.5. 给药方案与样品采集

采用单剂量给药方法。6只家兔随机分为2组，分别给予供试制剂1择时释放渗透泵控释片和参比制剂1缓释片，给药剂量均为40 mg。给药前禁食12 h (自由饮水)，于规定时间内在家兔耳缘静脉处采血2 ml，置涂有肝素的离心管中，4000 r/min离心10 min，分离血浆后于−20℃冰箱保存，待用。测定时按“2.2.3”项下的方法处理后，再按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。经过一周的清洗期后，分别交叉给予另一制剂，并按同样方法处理并测定。取血时间：供试制剂于给药后1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、24、28、32 h取血，参比制剂于给药后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、16、24、28、32 h取血。

2.2.6. 数据处理

血药浓度数据用Kinetica^® (Ver4.4)程序处理[5]，得出相关的药动学参数。供试制剂和参比制剂的药动学过程均为单室模型，以权重系数为1/c²计算1在家兔体内的药动学参数。

3. 结果

3.1. 专属性试验

在“2.2.4”项下色谱条件下，取兔空白血浆，在空白血浆中加入一定浓度1和2制成的模拟血浆样品以及受试家兔服药后采集的血浆样品，按照“2.2.3”项下方法处理样品。精密上清液20 μl，按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果如图1。结果表明，因图1(a)空白血浆中无1和2的色谱峰，所以内源性物质及代谢产物不干扰药物和内标的测定。

3.2. 线性关系与定量限考察

取兔空白血浆500 μL，分别加入适量不同浓度的1标准溶液，配制成相当于1浓度为25、50、100、200、300、500、1000 ng/ml的模拟血浆样品，按照“2.2.3”项下方法处理样品。精密上清液20 μl，按“1.2.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以1样品峰面积As和2内标峰面积Ai之比R为纵坐标，浓度C (ng/ml)为横坐标，采用加权(1/x²)最小二乘法进行回归运算，得回归方程：R = 0.0013C − 0.0019 (r = 0.997)，表明1在血浆中在25~1000 ng/ml的范围内线性良好。最低定量限为25 ng/ml。

(a)

(b)

(c)

Figure 1. (a) Blank plasma, (b) Blank plasma + 1 + 2, (c) Plasma sample after taking drug

图1. (a) 空白血浆，(b) 空白血浆 + 1 + 2，(c) 服药后的血浆样品

3.3. 精密度试验

取空白血浆，按“2.2.1”项下方法制备低、中、高浓度(25、200和500 ng/ml)的质控样品，各6份，按“2.2.3”项下的方法处理后，再按“2.2.4”项下色谱条件进样分析，连续3 d测定。代入当日的标准曲线计算样品的浓度，求得日内、日间RSD。结果日内RSD (%，n = 6)分别为0.87、4.05和1.42，日间RSD (%，n = 3)分别为5.91、5.03和4.96。

3.4. 回收率试验

3.4.1. 提取回收率

取空白血浆，除不加“2”外，均按“2.2.1”项下方法制备低、中、高浓度(25、200和500 ng/ml)的质控样品，各6份，分别按照“2.2.3”项下方法处理后，再按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积为A。取空白血浆，除不加“2”外，均按“2.2.3”项下方法处理至“50℃水浴下氮气吹干”，在所得剩余物中加入相应浓度的1标准溶液100 μl，50℃水浴下氮气吹干，再加入流动相100 μl溶解，离心(15,000 r/min) 10 min后取上清液20 μl，按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积B。计算得低、中、高浓度质控样品中1的提取回收率结果(A/B × 100%，n = 6)见表1，结果表明，低中高浓度药物的提取回收率大于80%，说明该提取方法准确可靠。

Table 1. Extract recovery rate results (n = 6)

表1. 提取回收率结果(n = 6)

C (ng/ml)	Recovery (%)	RSD (%)
50	83.21 ± 0.93	1.57
200	86.46 ± 0.79	1.63
500	80.18 ± 1.71	2.76

3.4.2. 方法回收率

取空白血浆，按“2.2.1”项下方法制备低、中、高浓度(25、200和500 ng/ml)的质控样品，各6份，分别按“2.2.3”项下方法处理后，再按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，代入回归方程计算回收率。结果，低、中、高浓度质控样品中1的方法回收率(n = 6)结果见表2，结果表明，样品的方法回收率大于85%，低中高浓度的RSD均小于10%，表明该方法准确性良好，符合生物样品分析要求。

Table 2. Method recovery rate results

表2. 方法回收率结果 (n = 6)

C (ng/ml)	Recovery (%)	RSD (%)
50	95.01 ± 1.36	5.29
200	103.22 ± 1.60	6.42
500	99.67 ± 2.11	3.38

3.5. 血药浓度–时间曲线

受试家兔口服1择时释放渗透泵控释片及缓释片后，血浆中1的平均血药浓度–时间曲线见图2，各主要药动学参数结果见表3。

Figure 2. Profile of drug mean concentration-time after taking self-made tablets and reference tablets

图2. 自制制剂和参比制剂的平均血药浓度–时间曲线

Table 3. Pharmacokinetic parameters of self-made tablets and reference tablets (x ± s, n = 6)

表3. 自制制剂与参比制剂的主要药动学参数(x ± s, n = 6)

Parameters	Self-made tablets	Reference tablets
Ka (1/h)	0.176 ± 0.011	0.728 ± 0.114
Ke (1/h)	0.144 ± 0.007	0.166 ± 0.017
Cmax (ng/ml)	178.23 ± 17.22	323.67 ± 35.75
Tmax (h)	9.67 ± 0.31	2.68 ± 0.34
AUC0→t (ng/ml∙h)	2864.46 ± 329.92	2988.41 ± 290.31
AUC0→∞ (ng/ml∙h)	2966.96 ± 354.36	3074.19 ± 317.98
MRT (h)	12.25 ± 0.66	7.58 ± 0.80
T1/2 (h)	4.81 ± 0.22	4.16 ± 0.44

由表3的结果可知，自制1择时释放渗透泵控释片的C_max较参比制剂1缓释片有所降低，降低了毒副作用；消除半衰期(T_1/2)从4.16 h延长到4.81 h，消除速率常数(Ke)从0.166降到了0.144，平均滞留时间从7.58 h延长到了12.25 h，提高了药物在体内的存留时间。由图2可知，单硝酸异山梨酯经口给药后，在前4 h内几乎没有吸收，接着在体内有一定的血药浓度，并逐渐升高，T_max约为9.67 h。因此本自制制剂在夜晚10点左右服药，经历约4 h时滞(即服药后4小时内药物几乎没有释放)，以避免生理低潮期(即心绞痛发病低潮期)药物产生作用而带来的不良反应；随后，药物开始缓慢释放，并在服药后约10 h (次日6点到10点左右)达到体内药物的最大浓度，以满足患者早晨醒后需要抵抗心绞痛疾病的治疗需求。在凌晨6点至12点之间心绞痛的发病率比其他时段高，而自制片的血药浓度可以维持接近峰值约6~8 h，因此达到抗心绞痛的目的。

3.6. 相对生物利用度

生物利用度是衡量药物吸收速度和程度的综合参数，是评价药物制剂质量的重要指标。相对生物利用度的计算公式为[6]：

$F=\frac{AU{C}_{0\to \infty }\left(T\right)}{AU{C}_{0\to \infty }\left(R\right)}\times 100\%$

上式中，$AU{C}_{0\to \infty }\left(T\right)$ ，$AU{C}_{0\to \infty }\left(R\right)$ 分别为自制的单硝酸异山梨酯择时释放渗透泵控释片和参比制剂的血药浓度–时间曲线下面积。结果表明，与市售参比制剂相比，自制1择时释放渗透泵控释片的相对生物利用度为(97.64 ± 18.63)%，在80%~120%的范围内，说明自制受试制剂与参比制剂吸收程度生物等效。

3.7. 体内外相关性

缓控释制剂要求进行体内外相关性研究，只有当体内外具有良好的相关性，才有可能通过体外释放曲线预测体内情况，即用体外释放试验结果作为制剂产品体内生物利用度特性的指标。体内实验各时间

点的吸收百分数F_a用Wagner Nelson [7]法求得：

$F_a\left(\%\right)=\frac{C_t+kAU{C}_{0\to t}}{kAU{C}_{0\to \infty }}\times 100\%$ ，

C_t为t时间的血药浓度，k为消除速率常数。根据上述公式求得1择时释放渗透泵控释片4、5、6、8、10、12、14和16 h的吸收百分数。具体数据如下表4。

Table 4. Comparison of in vitro accumulative release and in vivo absorption fraction

表4. 体外累积释放百分数与体内吸收百分数的比较

时间(h)	F (%)	Fa (%)
4	9.2321465	9.855809
5	21.041496	17.5805
6	31.606977	25.40026
8	65.658718	38.48094
10	85.300308	60.33296
12	97.240561	73.12583
14	102.76665	81.82528
16	94.949362	91.127

以吸收百分数(F_a)与相应时间体外释药百分数(F)进行回归分析，回归方程为F_a = 1.1657F + 5.5211，r = 0.925。根据相关系数与临界相关系数(自由度 = 8 − 2 = 6，P < 0.01时的临界值为0.834)比较可以判定体内外是否相关。当r (0.925) > r_α (α = 0.01，6) = 0.878时，说明回归方程线性关系良好，即表明1择时释放渗透泵控释片具有良好的体内外相关性。

4. 讨论

据文献报道，在血浆中测定1浓度的方法有GC-ECD [8]，GC-MS，HPLC，LC-MS/MS [9]，HPLC-MS [10]法等。但其中有些方法对仪器的要求较高，且操作比较繁琐。本实验采用了相对简便且普及的HPLC法测定1在体内的血药浓度，血样中的内源性物质及代谢产物不干扰药物的测定，且该方法灵敏、准确，能满足血药浓度测定的要求。

血浆中1的提取方法有固相萃取[11]、乙酸乙酯[12] [13]、乙腈[14] [15]等进行液–液提取法。本实验改进了血浆样品的处理方法，先加入饱和碳酸钾溶液沉淀蛋白，再进行乙酸乙酯液液萃取，结果血浆内源性成分的干扰较少，且提取回收率较高。

根据体内药动学实验结果，与1缓释片相比，自制1择时释放渗透泵控释片在体内能延迟释药，且在体内释药较平稳，因此能良好地符合生物节律，并达到时辰治疗的目的，同时，其还具有传统渗透泵制剂血药浓度比较平稳，释药行为不受食物效应及胃肠道pH的影响等优点，达到了实验预期的设计目的。

基金项目

湖南省自然科学基金项目(2022JJ60049)，湖南省自然科学基金(2023JJ60205)，2022年度湖南省教育厅科学研究项目(22C0909)，2023年度湖南省教育厅科学研究项目(23C0628)，衡阳市2020年指导性项目(2020jh042671)。

NOTES

^*通讯作者。