HIPK3在肿瘤学中的研究进展

Research Progress of HIPK3 in Oncology

摘要: 在癌症治疗和研究领域，激酶起着至关重要的作用。HIPK3广泛存在于人类和哺乳动物组织中。其参与的磷酸化调节、miRNA调控等是真核细胞凋亡、增殖、分化调节的重要一环，与多种疾病的发生、发展甚至肿瘤的耐药性亦存在着密切联系。本文拟对HIPK3的概念及其研究概况进行阐述，重点对其在肿瘤疾病的进展中发挥的生物学功能做一综述。

Abstract: In the field of cancer treatment and research, kinases play a crucial role. HIPK3 is widely found in human and mammalian tissues. Phosphorylation regulation and miRNA regulation are an important part of eukaryotic cell apoptosis, proliferation and differentiation regulation, and are closely related to the occurrence and development of many diseases and even drug resistance of tumors. In this paper, the concept and research status of HIPK3 are described, and the biological functions of HIPK3 in the progression of tumor diseases are reviewed.

1. 简介

癌症种类繁多，其不受控制的细胞生长和扩散，严重威胁着人类的健康安全。根据美国癌症协会报道，2022年全球约有2000万例新诊断癌症病例，970万人死于癌症。到2050年，仅根据预计的人口增长，癌症病例数预计将增加到3500万。每10万人/年的总癌症发病率和死亡率为男性213例，死亡110例，女性186例，死亡77例。癌症已经成为全世界第二大死亡原因，也是112个国家过早死亡(70岁以前)的主要原因。因此，对于癌症相关的探索研究从未有过停歇。

同源结构域相互作用蛋白激酶(HIPK)家族是近年来持续研究的热门，它包括四种核丝氨酸–苏氨酸激酶(HIPK1、HIPK2、HIPK3和HIPK4)，它们与酵母蛋白YAK1和双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶(DYRK)有关[1] [2]。一些研究发现，HIPKs的表达主要位于细胞核内，并增强了自然杀伤(NK)蛋白家族的抑制活性[3]。Kim等人的研究发现HIPKs参与多种细胞过程，并通过介导几种重要蛋白质分子的磷酸化发挥作用。它们代表了一个高度保守的激酶家族，并参与细胞过程，包括细胞凋亡、增殖和分化的调节[4]。此外，据报道，这些激酶参与调节细胞对DNA损伤的反应HIPK家族不仅调控细胞核内的其他蛋白，还调控细胞质和细胞膜内的蛋白，并通过影响相应蛋白的磷酸化参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程[5] [6]。

HIPK3作为同源结构域相互作用蛋白激酶大家族中的一员，也受到了格外的关注和研究。在近些年的研究中发现，HIPK3是多种miR-RNA的靶标，密切参与癌症细胞的分化、增殖迁移和凋亡，更有发现HIPK3同部分肿瘤耐药性的形成也有一定关系。

2. HIPK3分子结构

1998年，Kim等人[4]首次报道了HIPK3, HIPK3mRNA广泛存在于人类和哺乳动物组织中。Northern blot分析显示，HIPK3以约7.5 kb的tRNA表达，而在人类中，HIPK3在7号染色体上还包含一个额外的4.4 kb转录本。Young等[7]用绿色荧光蛋白(GFP)标记HIPK3蛋白，并在活细胞中观察。GFP斑点为首先在细胞核中观察到，后来在细胞质中观察到，表明HIPK3蛋白首先作为核蛋白激酶存在于细胞核中。HIPK蛋白家族在细胞凋亡过程中被高度磷酸化，而纯化后的HIPK3可以磷酸化NK结构域同源转录因子，表明其家族是一组同源的结构域转化磷酸化激酶。由于NK细胞是Fas介导细胞凋亡的主要参与细胞之一，HIPK3是Fas介导细胞凋亡的重要因子，是一种肿瘤抑制基因。Veronique等[8]克隆了小鼠与人的HIPK3全长同源性，发现90%的氨基酸序列相同。一项基因研究发现，一个完整的HIPK3蛋白分子由一个-NH2末端激酶结构域和一个保守的PEST序列组成，其cooh末端可能与FAS上的FADD结构域重合。HIPK3结构详见图1。

3. HIPK3表达的调控机制

3.1. 磷酸化作用

真核生物蛋白激酶通过将ATP上的磷酸转移到蛋白质底物如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸上，而被磷酸化的蛋白质则会改变其特性，包括酶活性、半衰期、定位和伴侣结合[9]。通常因此影响蛋白质的构象状态，并因此影响下游信号事件。

Fas (APO-1/CD95)是TNFR家族的一员，与Fas配体(FasL)交联可诱导细胞凋亡[10]。Fas-FasL系统在免疫系统中具有重要作用。瑞士洛桑大学生物化学研究所发现HIPK3与Fas受体相互作用，并通过磷酸化FADD (双分子Fas相关死亡结构域)促进HIPK3-FADD-Fas的相互作用，从而诱导死亡信号复合物中相邻的caspase-8分子通过蛋白水解相互激活，并通过随后的下游效应caspase (caspase-3、-6和-7)的切割启动细胞凋亡[11]。

Figure 1. Structure of the HIPK3 gene

图1. HIPK3的基因结构

3.2. miRNA依赖性调控

MiRNAs是约19~25个核苷酸的非编码单链RNA，在转录后水平负调控基因表达[12]。miRNA 5’端2-7’位置的核苷酸构成了所谓的“种子序列”，它对于与目标mRNA的3’非翻译区(UTR)结合至关重要。miRNA-mRNA相互作用稳定了含有Argonaute蛋白的RNA诱导沉默复合体(RISC)的结合。RISC介导靶mRNA的翻译和/或降解的抑制。每个miRNA能够靶向几种mRNA，并且miRNA的几个靶点通常参与相同的细胞途径。由于靶mRNA的差异表达，miRNA的生物学功能严格依赖于细胞环境。miRNAs与许多生物过程有关，因此它们的失调与几种疾病有关[13]。详见表1。

Table 1. miRNAs that target HIPK3

表1. 靶向HIPK3的miRNAs

靶向HIPK蛋白	miRNAs	参与生理或病理学过程	参考文献
HIPK3	miR-363	急性髓性白血病的化疗耐药	[14]
	miR-378	卵巢癌	[15]
	miR-382	骨肉瘤的化疗耐药性	[16]
	miR-106a；miR-20b；miR-19b-2；miR-92-2	T细胞白血病	[17]
	miR-187	糖尿病/胰岛素分泌	[18]
	miR-106a-5p	胃癌	[19]
	miR-200b	子宫颈癌	[20]

4. HIPK3与各系统肿瘤

4.1. 肝细胞癌

有学者[21]利用生信分析发现HIPK3在肝细胞癌(HCC)内的癌症组织中低表达。并采用Western blot、RT-qPCR对HCC细胞系(Hep-3B、HCC-LM3)与肝细胞(QSG-7701)进行分析也验证了HIPK3在HCC中的表达低于邻近组织。Kaplan-Meier Plotter数据库的生存分析显示，HIPK3低表达水平意味着HCC患者的总生存期(OS)、无复发生存期(RFS)和疾病特异性生存期(DSS)较短。而HCC来源的外泌体miR-3174作为HIPK3上游靶基因促进HUVECs的血管生成并增加其通透性。实验验证了外泌体miR-3174通过抑制HIPK3/p53和HIPK3/Fas信号通路促进HCC的血管生成和转移。

4.2. 骨肉瘤

2014年徐成雄博士团队研究了过表达miR-382通过HIPk3靶向途径抑制骨肉瘤(OS)细胞生长和化疗耐药性。在U2OS与MG63骨肉瘤细胞系中miR-382高表达抑制OS细胞生长，低表达刺激OS细胞生长。分别添加骨肉瘤常见化疗药顺铂(CDDP)、阿霉素、甲氨蝶呤(MTX)后Western blotting结果显示，miR-382过表达增强了化疗药物诱导OS细胞凋亡，而沉默miR-382可以保护OS细胞免受这些药物的影响。HIPK3作为miR-382下游靶点，成负性相关。miR-382的异位过表达在mRNA和蛋白质水平上显著降低了HIPK3的表达。相反抑制miR-382在mRNA和蛋白水平上增加了HIPK3的表达。采用荧光素酶报告基因实验表明，miR-382直接靶向HIPK3的3’UTR。将缺乏3’UTR的HIPK3构建体转染到稳定过表达miR-382 (MNNG/HOS)的细胞中。在过表达mir-382的MNNG/HOS细胞异种移植模型中，过表达的HIPK3显著刺激肿瘤化疗耐药。相比之下，在miR-382敲低的MNNG/HOS细胞异种移植模型中HIPK3的敲低增强了对化疗药物的敏感性，证明了HIPK3是miR-382的主要下游功能参与者[16]。

4.3. 甲状腺癌

有学者[22]利用微阵列分析了PTC (甲状腺乳头状癌)中差异表达的LncRNAs。在这些失调的LncRNAs中，LincRNA02471有着最高的折叠变化，通过对PTC细胞系KTC1和K1分析，LincRNA02471显著上调。通过CCK-8以及Transwell实验发现LincRNA02471载体高表达促进KTC1细胞和K1细胞的增殖、侵袭和迁移。对LincRNA02471下游靶基因miR-758及其靶点HIPK3进行实验分析后得出LincRNA02471在甲状腺乳头状癌中负向调节miR-758。还预测并验证了HIPK3是miR-758的直接靶点，并进一步论证了LincRNA02471作为miR-758分子海绵正调控HIPK3从而调控PTC的进展。

4.4. 结直肠癌

有学者[23]研究在两种结直肠癌细胞系中，抑制101-3p可减缓细胞生长，延缓细胞在体内的迁移。靶标分析显示，同源域相互作用蛋白激酶HIPK3是miR-101-3p的靶标。稳定过表达HIPK3的HCT116和SW480细胞系中磷酸化FADD水平升高，细胞生长、迁移迟缓，对5-FU的敏感性增加。经JC-1染色显示，HIPK3过表达后，线粒体膜电位增加，活性氧产生增加，线粒体数量增加，呼吸复合物表达增加。糖酵解参数和酶的测量显示，在这两种细胞系中，HIPK3过表达后糖酵解水平降低。在5-FU处理12 h后使用细胞色素c染色，结果显示凋亡标志物的表达和释放升高，进一步筛选表明，促进细胞色素C释放的成孔蛋白VDAC1表达的增加是细胞色素C释放增加的原因。VDAC1形成mPTPs，细胞色素C在细胞凋亡时通过其释放。VDAC1表达的增加对应于线粒体膜上mPTPs的增加，因此质子泄漏增加，物质通过线粒体膜的通量增加。当细胞凋亡发生时，mPTPs数量增加导致细胞色素c易于释放，这是HIPK3过表达细胞对5-FU敏感性增加的直接原因。异种移植模型进一步证实，与单独使用5-FU相比，5-FU和101-3p抑制剂联合使用的协同治疗效果大大提高。101-3p对HIPK3的抑制与结直肠癌中糖酵解能力呈正相关。这种关系可能通过磷酸化的FADD (pFADD)架起了桥梁。在结直肠癌中，HIPK3的过表达捕获了一种代谢重编程状态，其代谢从糖酵解转变为氧化磷酸化。在临床上，这种由HIPK3过表达引起的代谢转变会削弱肿瘤并使其对化疗变得敏感。

4.5. 乳腺癌

有学者[24]研究发现，circRNA-0001283在乳腺癌组织和细胞中显著减少，circRNA-0001283的过表达高度抑制乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞的生长以及侵袭能力，并且显著提高了乳腺癌细胞的凋亡率。miR-187是circRNA-0001283的候选靶点。与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比，miR-187在乳腺癌细胞中表达上调。过表达circRNA-0001283显著降低miR-187的表达。通过荧光素酶报告基因测定，转染miR-187后，野生型HIPK3 3’UTR的荧光素酶活性显著降低，在乳腺癌细胞中检测到HIPK3 mRNA和蛋白表达显著降低。miR-187模拟物消除了circRNA-001283对HIPK3表达的增强效应。此外，在MCF-7细胞中检测到HIPK3的功能活性。结果表明，HIPK3过表达可显著抑制MCF-7细胞的迁移。而且HIPK3的异位表达减少了miR-187增加的细胞迁。学者们还发现circRNA-0001283的异位表达降低了p65和p50的水平，而转染miR-187则高度增加了p65和p50的水平[24]。最终得出circRNA-0001283可能通过miR-187/HIPK3级联调节NF-kB信号传导。circRNA-0001283通过调节miR-187的表达[25]抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭。circRNA-0001283/miR-187/HIKP3也可作为治疗乳腺癌的潜在通路。

4.6. 胃癌

有学者[26]研究发现，胃癌(GC)细胞中HIPK3表达的降低与铂耐药相关，并促进了体外和体内GC的进展。HIPK3是肌细胞增强因子2C (MEF2C)的直接转录靶点。HIPK3通过促进泛素化直接下调形态发生调节剂微管相关蛋白MAP7。消除MAP7可抑制HIPK3不足导致的增殖和转移。此外，作为一种激酶，HIPK3抑制mTOR和Wnt通路的激活，这两种通路分别是细胞增殖和运动的关键调节因子。并行实验验证了奥沙利铂联合mTOR和Wnt抑制剂可有效克服HIPK3低表达诱导的铂耐药。

4.7. 小细胞肺癌

有学者[27]利用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blotting方法证实HIPK3在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达较正常肺组织明显下调。通过敲低非小细胞肺癌A549、HCC827细胞系中HIPK3蛋白水平，Western blot分析显示HIPK3沉默促进了NSCLC的侵袭和转移。免疫组化分析结果显示，低HIPK3蛋白表达与NSCLC患者的病理分级、TNM分期、淋巴结转移、Ki-67表达和5年生存率显著相关。多变量分析显示，HIPK3、肿瘤大小、TNM分期、Ki-67表达和年龄对NSCLC患者的总生存有独立的预后影响。Kaplan-Meier生存曲线显示HIPK3蛋白表达较高的NSCLC患者预后较好。从而证明HIPK3可能被用作预测NSCLC患者预后的有价值的生物标志物。然而，HIPK3在NSCLC进展中是如何发挥影响作用任有待研究。

4.8. 前列腺癌

Curtin等[28]研究了HIPK3在前列腺癌细胞DU-145凋亡中的作用。将JNK抑制剂SP600125加入到DU-145中，通过Western blotting和流式细胞术检测，他们发现随着JNK水平的降低，HIPK3和fas介导的细胞凋亡也减少。去除JNK抑制剂后，fas介导的细胞凋亡明显增加，HIPK3表达也增加，Caspase-3表达水平发生变化。这些结果表明，HIPK3与fas介导的细胞凋亡有关。

5. 小结

HIPK3作为一种蛋白激酶通过参与磷酸化转录调控因子和染色质修饰因子，在细胞增殖、细胞凋亡、DNA损伤反应、氧化应激和发育等细胞过程中发挥着重要作用。并且越来越多的miRNA被发现同HIPK3存在条件关系。相信随着研究的不断深入，HIPK3在各种疾病的功能和作用会被更多地揭示。HIPK3作为一个潜在治疗靶点，在这个基础上可以开发和研究出更有效的方法，用于肿瘤的诊断与治疗。