Rh-bFGF重组大肠杆菌的发酵工艺优化

Optimisation of the Fermentation Process of Rh-bFGF Recombinant Escherichia coli

摘要: Rh-bFGF重组大肠杆菌发酵工艺优化，根据培养基的组成成分，以菌体生长密度为检测值对重组大肠杆菌发酵条件所需碳源、有机氮源、无机氮源、无机盐离子、pH值、接种量进行单因素法和响应面法优化，得到最适发酵条件为：酵母粉3% (W/V)、豆粕0.5% (W/V)、氯化钠0.5% (W/V)、尿素0.5% (W/V)、pH 6.2、接种量5% (V/V)。当装液量为100 mL时，菌体生长密度OD₆₀₀能达到2.66，相较于LB (OD₆₀₀ = 1.5)培养基提升约77%，大大缩短发酵时间，达到节约成本的目的。

Abstract: Optimisation of fermentation process of rh-bFGF recombinant E. coli. rh-bFGF recombinant E. coli fermentation process was optimised by one-way and response surface methods based on the composition of the medium, and the carbon source, organic nitrogen source, inorganic nitrogen source, inorganic salt ions, pH, and the amount of inoculum required for the fermentation conditions of the recombinant E. coli, according to the composition of the medium, with the growth density of the bacterium as the assay, and the optimal fermentation conditions were obtained as follows: 3% yeast powder (W/V), 0.5% soybean meal (W/V), NaCl 0.5% (W/V), urea 0.5% (W/V), pH 6.2, and inoculum 5% (V/V). When the volume of liquid is 100 mL, the density of bacterial growth OD₆₀₀ can reach 2.66, compared with LB (OD₆₀₀ = 1.5) medium to improve about 77%, greatly shorten the fermentation time, to achieve the purpose of cost savings.

1. 引言

近年来国内对于bFGF因促进细胞分裂作用产生的生物学效应产生了巨大吸引力，bFGF的生物学效应主要为体内部分，体内作用十分强烈，对骨细胞、血管内皮细胞、髓质细胞、神经元和神经胶质细胞等具有很强的促细胞分裂增殖活性。目前均采用基因工程技术来制备高产量、高活性的bFGF。通过采用基因组编辑工具，化学DNA合成和DNA组装技术的组合来构建设计细胞，从而实现合成生物学的实际目标，即从各个部分构建活细胞，这些部分有目的地组装以产生功能实体[1]。尽管重组蛋白可以在原核和真核系统中表达，但大肠杆菌是工业规模生产非糖基化重组蛋白的首选，因为它易于复制，成本低，简单，并且被美国食品和药物管理局(FDA)批准为安全的基因工程受体生物。重组蛋白的生产是一个简单的过程，即将目的基因克隆到表达质粒载体中，随后将其插入表达宿主中[2]。从基因功能研究到治疗性蛋白质的工业化生产，分子克隆和重组蛋白表达对于许多分子生物学研究和转化应用至关重要。蛋白质编码基因首先插入载体骨架中。然后将组装好的构建体引入适当的宿主生物体，其中重组DNA与宿主细胞同时复制。在达到所需的生长后，在这些细胞中诱导蛋白质表达[3]。设计蛋白质生产的最终构建体通常包括两部分：检查感兴趣的编码序列(CDS)和选择合适的表达载体来克隆CDS [4]。pET系列是广泛使用的表达载体，含有T7启动子。质粒成为载体，作为运输工具，用于在宿主细胞内传递和操纵外来DNA，开启了分子生物学的新时代[5] [6]。

美国国家生物技术信息中心(NCBI)为生物学制作了各种在线信息资源，包括GenBank®核酸序列数据库和PubMed数据库，其中包含在生命科学期刊上发表的引文和摘要。NCBI为来自35个不同数据库的大部分数据提供搜索和检索操作[7]。生物信息学是一个跨学科领域，涵盖了广泛的研究领域，包括生物学、计算机科学、信息科学和统计学领域。DNA和基因数据测序，编码，修饰和结构分析是生物信息学的主要领域[8]。蛋白质组学是在生物学和医学研究中不断扩大的应用组学技术之一，旨在蛋白质鉴定和定量、蛋白质-蛋白质相互作用、结构和动力学表征。所生成数据的异构性增加了所需数据分析的复杂性。计算和生物信息学资源为所需的数据整合提供了工具，考虑到对复杂现象的全面解释现在需要比较和整合来自不同层次的基因组学(基因表达、蛋白质表达和蛋白质功能)、生物医学领域以及生物技术和农业食品研究的知识[9]。

hbFGF是促有丝分裂的多肽，通过与靶细胞上的受体结合而发生作用，其主要生物学作用有：促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生和神经再生等[10]-[12]。hbFGF生物活性的多效性使其在临床应用上具有光明前景。但其天然含量极低且提取费用昂贵，现利用重组技术生产所需hbFGF [13]。本研究目的在于对所构建的Rh-bFGF高效表达载体进行培养基发酵工艺优化，以达到节约时间和降低成本，包括对培养条件进行单因素和响应面优化得到培养Rh-bFGF的最佳条件。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

2.1.1. 菌株

DNA序列由东北林业大学设计，杭州华安生物技术有限公司构建。

2.1.2. 主要试剂

硫酸铵、氯化铵、尿素、牛肉粉、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、蛋白胨和豆粕提取物均来自天津市致远化学试剂有限公司；可溶性淀粉来自无锡市晶科化工有限公司；硝酸铵来自广东翁江化学试剂有限公司；氨水来自济南孟乔化工有限公司；甘油来自上海升月国际贸易有限公司；以上试剂均为分析纯。

2.1.3. 主要仪器

电子分析天平(BSA124S-CW)来自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；蒸汽灭菌锅(LDZF-75L-I)来自浙江新丰医疗器械有限公司；恒温加热水浴锅(HH-S8)来自哈尔滨市香坊区启程仪器经销处；高速离心机(AXTG16G)盐城市安信实验仪器有限公司；立式培养振荡器(TS-100C)哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；pH计(PHSJ-5)来自上海科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计(UV-8000)上海安亭科学仪器厂；蛋白质电泳仪(DYCZ-24DN)北京六一生物科技有限公司；超声波清洗机(GT SONIC-R20)深圳市得康洗净电器有限公司。

2.2. 方法

2.2.1. 培养基发酵条件的筛选和单因素实验设计

在LB培养基的基础上，根据培养基成分组成有碳源、有机氮源、无机氮源、无机盐离子和发酵条件pH值、接种量，设置6个因素，以菌体生长密度OD₆₀₀为监测值，筛选出最佳培养基成分。

变异系数(CV)是反映数据离散程度的绝对值，其定义是标准差与平均值之比。变异系数越大表示其离散程度的测度值越大，该因素对实验结果的影响较大。通过比较变异系数筛选出4个主要因素用于接下来的响应面实验。

2.2.2. 响应面实验设计

为进一步优化培养基的成分组成，采用响应面法(RSM)对筛选出对实验结果影响较大的条件进行优化。本实验设计了4因素3水平的响应面实验。以菌体生长密度OD₆₀₀ (Y)为响应值，以豆粕(A)、尿素(B)、NaCl (C)、接种量(D)为因素。4因素3水平设计见表1。

Table 1. Factors and levels used in response surface analysis

表1. 响应面分析的因素水平设计

因素Factor	水平Level
	-1	0	1
豆粕(A, g)	0.5	1.0	1.5
尿素(B, g)	0.5	1.0	1.5
NaCl (C, g)	0.5	1.0	1.5
接种量(D, %)	3	4	5

采用Design Expert 11软件进行响应面分析。F检验显示回归系数有统计学意义，并进行方差分析(ANOVA)、拟合系数、决定系数(R²)及F值缺失的评定。

2.2.3. 响应面实验设计

为了既可以得到较高的生物量，又能获得更高的Rh-bFGF表达量，所以对不同OD₆₀₀时间段加入诱导剂、诱导剂浓度、诱导时间进行优化，利用Image J软件对蛋白表达结果条带进行条带灰度分析，以得到最高Rh-bFGF表达率。

在2.2.2的优化培养基基础上，分别在菌体OD₆₀₀ (0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.8)加入1 mmol/L的诱导剂IPTG 37℃震荡培养4 h，诱导结束后电泳测定蛋白表达量。

在最佳菌体生长密度OD₆₀₀基础上，分别加入诱导剂至终浓度为0.2 mmol/L、0.6 mmol/L 、1.0 mmol/L、1.4 mmol/L、1.8 mmol/L 37℃震荡培养4 h，诱导结束后电泳测定蛋白表达量。

在最佳诱导浓度基础上，分别诱导震荡培养2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h，诱导结束后电泳测定蛋白表达量。

3. 结果与讨论

3.1. 单因素优化及变异系数筛选

3.1.1. 碳源对重组大肠杆菌生长密度的影响

碳源对重组大肠杆菌生长密度的影响为图1所示。图1(a)是不同种类的碳源的单因素筛选，根据折线图可以看出酵母粉的菌体生长密度最高，所以选用酵母粉做碳源。图1(b)是不同浓度的酵母粉优化，从图中可以看出生长密度随酵母粉添加量基本上成线性上升，酵母粉的添加量在3% (W/V)以上时生长密度增加极少，当大肠杆菌培养9 h，酵母粉的3%添加量此时OD₆₀₀达1.85相对于对照组的0.5%添加量生长密度提高了23%，所以考虑选取酵母粉添加量为3% (W/V)。

Figure 1. Effect of carbon source on growth density of recombinant Escherichia coli

图1. 碳源对重组大肠杆菌生长密度的影响

3.1.2. 有机氮源对重组大肠杆菌生长密度的影响

有机氮源对重组大肠杆菌生长密度的影响为图2所示。图2(a)反映了常见的有机氮源对重组大肠杆菌生长密度的影响，选择豆粕为有机氮源并且对豆粕浓度进行优化，图2(b)可以看出1% (W/V)的豆粕添加量效果最好此时OD₆₀₀达2.8，豆粕添加太多或者太少菌体生长密度都不太高。所以选取豆粕添加量为1% (W/V)。

Figure 2. Effect of organic nitrogen source on growth density of recombinant Escherichia coli

图2. 有机氮源对重组大肠杆菌生长密度的影响

3.1.3. 无机氮源对重组大肠杆菌生长密度的影响

无机氮源对重组大肠杆菌生长密度的影响为图3所示。有机氮源会被菌体快速利用而无机氮源被缓慢利用对延长次级代谢产物的分泌期、提高产物的产量有好处。图3(a)，图3(b)选择尿素来作为无机氮源，1% (W/V)的尿素添加量此时OD₆₀₀达2.79，相对不加尿素生长密度提升了3%。故本研究选取1% (W/V)的尿素作为无机氮源。

Figure 3. Effect of inorganic nitrogen source on growth density of recombinant Escherichia coli

图3. 无机氮源对重组大肠杆菌生长密度的影响

3.1.4. 氯化钠对重组大肠杆菌生长密度的影响

氯化钠对重组大肠杆菌生长密度的影响为图4所示。虽然钠离子不参与细胞的组成，但是钠离子与维持细胞渗透压有关，它是微生物发酵培养基的必要成分故在培养基中常加入少量的钠盐，但添加量不能太高，否则会抑制微生物的生长。从图中可以看出氯化钠的添加量在1% (W/V)时菌体生长密度最高，此时OD₆₀₀达2.64，氯化钠添加太多或者太少菌体生长密度都不太高，所以选择氯化钠添加量在1% (W/V)。

Figure 4. Effect of sodium chloride on the growth density of recombinant Escherichia coli

图4. 氯化钠对重组大肠杆菌生长密度的影响

3.1.5. 培养基初始pH值对重组大肠杆菌生长密度的影响

培养基初始pH值对重组大肠杆菌生长密度的影响为图5所示。本章研究了不同pH值对大肠杆菌生长密度的影响，图中pH值为6.2是培养基未经过调节的原始pH值，可以看出不调节pH对菌体生长效果最好，培养基初始pH过酸会抑制菌体生长，pH过碱甚至会致菌体凋亡所以变异系数数据处理不添加碱性结果。所以本研究中的培养基不进行pH调节，此时OD₆₀₀达2.65。

Figure 5. Effect of initial pH value of medium on growth density of recombinant Escherichia coli

图5. 培养基初始pH值对重组大肠杆菌生长密度的影响

3.1.6. 接种量对重组大肠杆菌生长密度的影响

接种量对重组大肠杆菌生长密度的影响为图6所示。种子液中含有大量能促进菌体快速分解利用底物的胞外水解酶 ，接种量的增加使这些酶的量也相应增加，所以在营养物质充足的条件下，提升接种量能强化菌体对新环境的适应能力，从而缩短延滞期，增强菌体活力，提高生长、产酸效率，为菌体的高密度培养打下良好基础。但当接种量过高时会使营养物质提前消耗干净从而导致菌体提前进入衰亡期而降低菌体产量。综上所述，本研究通过实验选取最适接种量为4% (V/V)，此时菌体生长密度最高OD₆₀₀达2.67。

Figure 6. Effect of inoculation amount on growth density of recombinant Escherichia coli

图6. 接种量对重组大肠杆菌生长密度的影响

3.1.7. 变异系数筛选结果

变异系数结果为图7所示。变异系数结果值越大代表该因素对实验结果的影响越大。下图比较了6个因素数据的变异系数值，大小对比如下：NaCl > 尿素 > 豆粕 > 接种量 > 酵母粉 > pH。所以采用前4个因素作为主要因素去开展响应面优化实验。分别是NaCl、尿素、豆粕、接种量。

Figure 7. The coefficient of variation (CV) of six factors

图7. 六个因素的变异系数(CV)

3.2. 响应面优化结果

使用Design Expert 11软件，以(Y)，以豆粕(A)、尿素(B)、氯化钠(C)、接种量(D)为影响因素，OD₆₀₀为响应值。根据BBD进行响应面实验，如表2所示。二次多项式回归方程拟合如式(1)所示：

$\begin{array}{l}\text{Y}=2.45-0.160\text{A}-0.0607\text{B}-0.1068\text{C}+0.0528\text{D}-0.0082\text{AB}-0.0565\text{AC}-0.0363\text{AD}\\ -0.0530\text{BC}+0.0607\text{BD}-0.0267\text{CD}-0.0310{\text{A}}^2-0.0275{\text{B}}^2+0.0084{\text{C}}^2-0.0109{\text{D}}^2\end{array}$ (1)

Table 2. BBD and response values of response surface experiment (n = 3)

表2. BBD与响应面实验的响应值(n = 3)

Run	Factor 1	Factor 2	Factor 3	Factor 4	Response Y
	A：豆粕	B：尿素	C：氯化钠	D：接种量	OD600	Predicted
1	1	1.5	1	5	2.489 ± 0.011	2.47
2	1	1.5	1	3	2.216 ± 0.015	2.24
3	1	1	1	4	2.48 ± 0.021	2.45
4	0.5	1	0.5	4	2.668 ± 0.009	2.65
5	1.5	1.5	1	4	2.18 ± 0.012	2.16
6	1	1	0.5	5	2.629 ± 0.007	2.64
7	1	1	1	4	2.46 ± 0.005	2.45
8	1.5	1	1	3	2.225 ± 0.003	2.23
9	1.5	1	1.5	4	2.086 ± 0.017	2.11
10	1	0.5	1	3	2.468 ± 0.012	2.49
11	0.5	0.5	1	4	2.619 ± 0.003	2.61
12	1	0.5	0.5	4	2.518 ± 0.022	2.55
13	1	0.5	1.5	4	2.44 ± 0.005	2.44
14	0.5	1	1.5	4	2.524 ± 0.011	2.54
15	1	1	0.5	3	2.498 ± 0.006	2.48
16	1	0.5	1	5	2.498 ± 0.013	2.47
17	1	1	1	4	2.434 ± 0.008	2.45
18	1.5	0.5	1	4	2.318 ± 0.006	2.30
19	0.5	1	1	5	2.648 ± 0.010	2.66
20	0.5	1	1	3	2.488 ± 0.004	2.49
21	0.5	1.5	1	4	2.514 ± 0.003	2.51
22	1	1	1	4	2.442 ± 0.006	2.45
23	1	1.5	0.5	4	2.512 ± 0.012	2.53
24	1.5	1	0.5	4	2.456 ± 0.011	2.43
25	1	1	1.5	5	2.376 ± 0.008	2.37
26	1.5	1	1	5	2.24 ± 0.016	2.27
27	1	1.5	1.5	4	2.222 ± 0.006	2.22
28	1	1	1	4	2.454 ± 0.009	2.45
29	1	1	1.5	3	2.352 ± 0.018	2.32

重组大肠杆菌发酵条件优化回归模型的方差分析如表3所示，模型F = 57.24表明该模型是显著的。p值小于0.0500表示模型项显著，值大于0.1000表示模型项不显著。在本实验中，A、B、C、D、AC、AD、BC、BD、A²、B²是重要的模拟项表现出显著差异。F = 2.40 > 0.05意味着失拟项相对于纯误差不显著表明拟合性较好。二次回归模型的决定系数(R²)为0.9828，调整后的R²为0.9657反映回归模型对样本数据的拟合程度高。CV低(1.12%)，标准差为0.0272，表明实验数据可靠且模型稳定。Adep精度为28.5974 > 4表示信号充足且具有足够强的信号用于优化。

Table 3. ANOVA for quadratic model

表3. 二次模拟的方差分析

Source	Sum of Squares	df	Mean Square	F-value	p-value
Model	0.5919	14	0.0423	57.24	<0.0001
A	0.3188	1	0.3188	431.60	<0.0001
B	0.0442	1	0.0442	59.79	<0.0001
C	0.1367	1	0.1367	185.11	<0.0001
D	0.0334	1	0.0334	45.20	<0.0001
AB	0.0003	1	0.0003	0.3685	0.5535
AC	0.0128	1	0.0128	17.29	0.0010
AD	0.0053	1	0.0053	7.12	0.0184
BC	0.0112	1	0.0112	15.21	0.0016
BD	0.0148	1	0.0148	19.98	0.0005
CD	0.0029	1	0.0029	3.87	0.0691
Residual	0.0062	1	0.0062	8.43	0.0116
Lack of Fit	0.0049	1	0.0049	6.63	0.0220
Pure Error	0.0005	1	0.0005	0.6183	0.4448

因此，该模型可用于分析和预测重组大肠杆菌培养基的生长密度和四个因素的相互作用。正态概率图8(a)是一条直线，表示残差服从正态分布。预测响应值与实际响应值均在模型仿真范围内，呈现良好的线性关系图8(b)。图8(c)显示了残差与上升的预测响应值之间的关系，这是一个随机散点图。

利用三维响应面图分析了个因素之间的相互作用强度。如图8(d)~(i)所示，各因素之间存在相互作用。

图8(d)可看出，当氯化钠浓度和接种量值不变时，菌体生长密度最高OD₆₀₀值是在尿素添加量为0.5%时，随着豆粕从0.5%增长到1.5%时，菌体生长密度OD₆₀₀反而降低，当豆粕和尿素添加量为0.5%时，此时OD₆₀₀值最高为2.619。对于重组大肠杆菌生长状况来说，高浓度的尿素和豆粕反而抑制其生长。

当尿素添加量为1%，接种量值为4%时，图8(e)可看出随着豆粕浓度减少，菌体生长密度OD₆₀₀增加，当氯化钠在0.5%~10%范围内，OD₆₀₀随氯化钠浓度增加而减少，在10%~1.5%范围内，OD₆₀₀随氯化钠浓度增加而增加。

图8(f)所示当尿素为1%，氯化钠为1%时，豆粕和接种量交互作用对重组大肠杆菌生长密度OD₆₀₀影响的3D响应面图。从图中可以看出，整体趋势为随着豆粕浓度减小和接种量的增加，OD₆₀₀值增加。

尿素浓度和氯化钠浓度的交互作用对菌体生长密度OD₆₀₀的影响如图8(g)所示。当豆粕为1%，接种量为4%时，尿素添加量在0.9%~1.1%范围内，OD₆₀₀随氯化钠减少而增加。

图8(h)显示是尿素和接种量交互作用对菌体生长密度OD₆₀₀的影响。这时豆粕为1%，氯化钠为1%。当接种量在3%~4%范围内，随着尿素增加OD₆₀₀值减少，但当接种量在4%~5%范围内，尿素变化影响不大，此时OD₆₀₀值较高在2.5左右。

图8(i)显示是氯化钠和接种量交互作用对菌体生长密度的影响。当豆粕为1%，尿素为1%时，OD₆₀₀整体趋势是随氯化钠减少和接种量增加而增加。当氯化钠为0.5%，接种量为5%是时OD₆₀₀值最高为2.629。

Figure 8. Diagnostic (a)~(c) and 3D response surface plots (d)~(i)

图8. 诊断图(a)~(c)和三维响应面图(d)~(i)

由软件优化出的重组大肠杆菌培养基的最佳成分配比是：豆粕的添加量是0.5% (W/V)，尿素的添加量是0.5% (W/V)，氯化钠的添加量是0.5% (W/V)，预测重组大肠杆菌生长密度OD₆₀₀为2.662。为确保实验结果准确性进行三次最优条件的重复实验，实际实验结果中重组但肠杆菌菌体的生长密度OD₆₀₀是2.646 ± 0.012，与预测的OD₆₀₀基本一致。表明此发酵方法稳定性好，重复性高。

4. 结论

统计多元优化(SMO) [14]是一种优化技术，其中使用实验设计(DOE)，特别是响应面方法(RSM)通过统计分析获得最佳响应。首先，进行每个因素的单因素实验得到最优条件，在使用变异系数值得到影响实验的关键因素。接下来，使用Box-Behnken设计(BBD)进一步优化关键因素，以达到最佳生产重组蛋白的最佳因素水平。SMO考虑了因素之间的相互作用，因此，它在达到最优点和预测这些因素的范围方面具有优势。

本研究为了实现重组大肠杆菌Rh-bFGF最高的生产率，了解了不同参数的影响。对重组大肠杆菌的6个发酵条件进行单因素优化，选出4个影响因素最大进行响应面优化，得到最适大肠杆菌发酵条件为：3% (W/V)酵母粉、0.5% (W/V)氯化钠、0.5% (W/V)尿素、0.5% (W/V)豆粕、接种量5% (V/V)、培养基初始pH6.2，此条件下当装液量为100 mL时，重组大肠杆菌的OD₆₀₀预测值为2.662，实际实验结果OD₆₀₀是2.646 ± 0.18，表明该模型是可靠的。相对于LB (OD₆₀₀ = 1.5)培养基，此优化培养基的菌体生长密度提升了约77%，且发酵时间由之前的过夜培养缩短至整个流程不到9h，极大节约时间和成本。

基金项目

中央高校基本科研业务费项目(2572022CG04)。

NOTES

^*通讯作者。