1. 引言
SHP2是由PTPN11基因编码的非受体蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)，在多种组织的细胞质中广泛表达，特异性地催化细胞质中磷酸酪氨酸的去磷酸化过程。SHP2是PTP家族中首个被证实的原癌蛋白，是生长因子和免疫检查点相关信号通路的关键节点和调节因子，参与Ras/Raf/MEK/ERK、JAK/STAT、PI3K/AKT/mTOR和PD-1/PD-L1等多条信号通路的调控[1]。SHP2功能异常与多种肿瘤的发生和发展密切相关，因此成为肿瘤治疗的潜在靶点[2]。早期靶向SHP2的药物研发主要集中在正构抑制剂，但由于PTP活性位点的高度保守、高极性和带电环境，导致靶向催化域的抑制剂存在效力弱、选择性低和透膜性差等不足[3]。直到2016年，诺华公司报道了首个SHP2变构抑制剂SHP099 [4]，改变了以往针对PTP催化域的设计策略，为SHP2抑制剂的研发带来了曙光。随后该公司在SHP099的基础上进行结构优化，得到第一个进入临床开发的SHP2变构抑制剂TNO155 [5]。诺华公司的开创性工作吸引了多家药企跟进。其中，加科思公司以TNO155为模板进行结构优化，获得了两款候选变构抑制剂JAB-3068和JAB-3312 [6]，近期JAB-3312与KRASG12C抑制剂戈来雷塞联合用药正在启动III期临床试验，成为首个进入III期开发的SHP2变构抑制剂。总而言之，TNO155的发现为SHP2变构抑制剂的研究提供了新的思路(图1)。
Figure 1. Structures of representative SHP2 allosteric inhibitors
图1. 代表性SHP2变构抑制剂的结构
2. 目标化合物的设计与合成
2.1. 目标化合物的设计
诺华公司通过高通量筛选和结构改造得到SHP099 [4]，但是该化合物具有光毒性和hERG抑制作用，为此研发人员对其进行优化得到候选药物TNO155 [5]。X-射线共晶结构(PDB ID: 7JVM)显示，TNO155处于SHP2隧道状变构口袋中。其中，吡嗪环上的N原子与Arg111形成氢键相互作用，环上的氨基与Glu250形成氢键相互作用；吡啶环与Arg111形成阳离子-π堆积作用，环上的氨基通过周围的水分子间接与Lys492形成相互作用；而螺环片段则处在隧道状变构口袋末端的极性区域，其环上的氨基经质子化后分别与Thr108、Glu110和Phe113形成关键性氢键网络。然而，螺环片段的合成难度大，并且可供改造的空间小，同时考虑到碱性脂肪伯胺往往会导致较高的hERG抑制作用，从而带来心脏毒性风险[4]。因此，我们尝试对螺环片段进行改造，拟采用羧基及其衍生化基团替代螺环胺基，同时改变氮杂脂肪环的大小和羧基取代的位置，为此设计并合成了A~C系列目标化合物(图2)。
Figure 2. Design of target compounds A, B and C
图2. A、B和C系列目标化合物的设计策略
A系列目标化合物的合成：2-氨基-3-溴-6-氯吡嗪作为起始原料，在Pd2(dba)3/Xantphos催化下与3-巯基丙酸-2-乙己酯偶联制得硫醚1，在碱性条件下经逆Michael反应生成中间体2。2与3-氯-4-碘-2-吡啶胺偶联得到3，然后与L-脯氨酸甲酯偶联得到中间体4，最后4经水解制得A-1，A-1经酰胺化制得A-2。4与水合肼反应得到A-3 (图3)。
Reagents and conditions: (a) 2-octyl-3-mercaptopropionate, Pd2(dba)3, Xantphos, DIEA, 1,4-dioxane, 105˚C, 4 h; (b) t-BuOK, EtOH, 0˚C, 1 h; (c) 3-chloro-4-iodopyridin-2-amine, Pd2(dba)3, Xantphos, DIEA, 1,4-dioxane, 75˚C, 10 h; (d) (3S)-(-)-amino- pyrrolidine, DIEA, 1,4-dioxane, 120˚C, 6 h; (e) LiOH, H2O, THF, r.t., 2 h; (f) NH4Cl, HATU, DIEA, DMF, r.t., 4 h; (j) hydrazinium hydroxide, MeOH, r.t.
Figure 3. Synthetic route for target compounds A-1~A-3
图3. 目标化合物A-1~A-3的合成路线
B系列目标化合物的合成：以3为原料，在Pd2(dba)3/Xantphos催化下与3-哌啶甲酯制得中间体5，经LiOH水解制得B-1，B-1经酰胺化制得B-2。B-1与N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺反应制得中间体6，6脱Boc保护得到B-3。3与3-(Boc-氨基)哌啶偶联制得中间体7，7脱Boc保护得到B-4 (图4)。
C系列目标化合物的合成：以3为原料，在Pd2(dba)3/Xantphos催化下与4-哌啶甲酸甲酯制得中间体8，经水解制得C-1，C-1经酰胺化得到C-2。3与4-Boc-氨基哌啶偶联得到中间体9，经三氟乙酸脱Boc保护后制得C-3。3与4-(Boc-氨甲基)哌啶偶联得到中间体10，经三氟乙酸脱Boc保护后制得C-4 (图5)。
Reagents and conditions: (a) methyl piperidine-3-carboxylate, Pd2(dba)3, Xantphos, DIEA, 1,4-dioxane, 120˚C, 6 h; (b) LiOH, H2O, THF, r.t., 2 h; (c) NH4Cl, HATU, DIEA, DMF, r.t., 4 h; (d) N-Boc-ethylenediamine, HATU, DIEA, DMF, r.t., 4 h; (e) TFA, DCM, r.t., 1 h. (f) 3-(Boc-amino)piperidine, Pd2(dba)3, Xantphos, DIEA, 1,4-dioxane, 120˚C, 6 h; (j) TFA, DCM, r.t., 1 h.
Figure 4. Synthetic route for target compounds B-1~B-4
图4. 目标化合物B-1~B-4的合成路线
Reagents and conditions: (a) methyl isonipecotate, Pd2(dba)3, Xantphos, DIEA, 1,4-dioxane, 120˚C, 6 h; (b) LiOH, H2O, THF, r.t., 2 h; (c) NH4Cl, HATU, DIEA, DMF, r.t., 4 h; (d) 4-Boc-aminopiperidine, Pd2(dba)3, Xantphos, DIEA, 1,4-dioxane, 120˚C, 6 h; (e) TFA, DCM, r.t., 1 h; (f) 4-(Boc-aminomethyl)piperidine, Pd2(dba)3, Xantphos, DIEA, 1,4-dioxane, 120˚C, 6 h.
Figure 5. Synthetic route for target compounds C-1~C-4
图5. 目标化合物C-1~C-4的合成路线
2.2. 目标化合物的合成
化合物熔点采用RY-1型熔点仪测定；1H-NMR使用ACF-300 MHz核磁共振仪测定，TMS为内标；ESI-MS使用Agilent 1100 Series LC/MSD Trap (SL)质谱仪测定。所有试剂未经特别说明均为市售化学纯或分析纯产品。
2.2.1. 目标化合物A1~A4的合成
将2-氨基-3-溴-6-氯吡嗪(1.00 g, 4.80 mmol)溶于1,4-二氧六环(12 mL)中，加入3-巯基丙酸-2-乙己酯(1.10 g, 5.04 mmol)、Xantphos (56 mg, 0.10 mmol)、Pd2(dba)3 (44 mg, 0.05 mmol)和DIEA (1.24 g, 9.59 mmol)，在氮气氛围下105℃搅拌4 h。减压浓缩，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到黄色油状液1 (1.60 g，收率96.4%)。MS (ESI) m/z：346.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.71 (s, 1H)，6.78 (s, 2H)，4.07~4.00 (m, 2H)，3.96~3.93 (m, 2H)，3.31 (t, J = 5.1 Hz, 2H)，2.72 (t, J = 5.1 Hz, 2H)，1.57~1.46 (m, 1H)，1.35~1.19 (m, 8H)，0.88~0.81 (m, 6H)。
将化合物1 (1.60 g, 4.63 mmol)溶于无水乙醇(8 mL)中，氮气氛围中于0℃下加入叔丁醇钾(1.04 g, 9.25 mmol)，继续于冰浴下搅拌1 h，减压浓缩得到化合物2后立即投入下步反应。
将化合物2 (0.92 g, 4.63 mmol)溶于1,4-二氧六环(14 mL)中，分别加入3-氯-4-碘-2-吡啶胺(1.18 g, 4.36 mmol)、Xantphos (54 mg, 0.10 mmol)、Pd2(dba)3 (42 mg, 0.05 mmol)和DIEA (1.20 g, 9.25 mmol)，在氮气氛围下75℃搅拌10 h。减压浓缩，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到黄色固体3 (1.1 g，收率80.3%)。MS (ESI) m/z：288.0 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.88 (s, 1H)，7.70 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.15 (s, 2H)，6.37 (s, 2H)，5.97 (d, J = 5.4 Hz, 1H)。
将化合物3 (0.15 g, 0.52 mmol)溶于1,4-二氧六环(1 mL)中，加入L-脯氨酸甲酯盐酸盐(0.13 g, 0.78 mmol)和DIEA (2 mL)，氮气氛围下120℃反应6 h。冷却，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到浅粉色固体4 (0.10 g，收率50.4%)。MS (ESI) m/z：288.0 [M + H]+。
将化合物4 (100 mg, 0.26 mmol)溶于四氢呋喃(1.5 mL)中，加入氢氧化锂(13 mg, 0.53 mmol)的水溶液(0.5 mL)，室温搅拌2 h。浓缩后加入5 mL水，浓盐酸调pH至4，用异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体A-1 (83 mg，收率86.3%)，mp. 174.6℃~176.4℃。MS (ESI) m/z：367.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 12.54 (s, 1H)，7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.31 (s, 1H)，6.25 (s, 2H)，6.08 (s, 2H)，5.72 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.48 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, 1H)，3.54 (dt, J = 15.9, 9.6 Hz, 2H)，2.34~1.96 (m, 4H)。
将化合物A-1 (47 mg, 0.13 mmol)溶于DMF (1 mL)中，加入HATU (73 mg, 0.19 mmol)和DIEA (33 mg, 0.32 mmol)，室温搅拌0.5 h。加入氯化铵(69 mg, 1.28 mmol)，继续反应3.5 h。加入水，异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到白色固体A-2 (32 mg，收率68.3%)，mp. 177.9℃~179.3℃。MS (ESI) m/z：366.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.43 (s, 1H)，7.25 (s, 1H)，7.06 (s, 1H)，6.27 (s, 2H)，6.11 (s, 2H)，5.73 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.31 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, 1H)，3.65 (dt, J = 15.9, 9.6 Hz, 2H)，2.25~1.91 (m, 4H)。
将化合物4 (70 mg, 0.18 mmol)溶于无水甲醇(1.5 mL)中，加入水合肼(138 mg, 2.76 mmol)，室温搅拌12 h。减压浓缩，用异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体A-3 (45 mg，收率64.3%)，mp. 173.6℃~175.2℃。MS (ESI) m/z：381.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 9.16 (s, 1H)，7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.26 (s, 1H)，6.27 (s, 2H)，6.11 (s, 2H)，5.74 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.45~4.20 (m, 3H)，3.70~3.50 (m, 2H)，2.22~1.84 (m, 4H)。
2.2.2. 目标化合物B1~B4的合成
将化合物3 (0.35 g, 1.21 mmol)溶于1,4-二氧六环(1 mL)中，加入哌啶-3-羧酸甲酯(0.26 g, 1.82 mmol)和DIEA (2 mL)，氮气氛围下120℃反应6 h。冷却，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到浅粉色固体5 (0.33 g，收率68.8%)。MS (ESI) m/z：395.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.63 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.60 (s, 1H)，6.22 (s, 2H)，6.14 (s, 2H)，5.74 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.39~4.34 (m, 1H)，4.05~4.00 (m, 1H)，3.63 (s, 3H)，3.22~3.08 (m, 3H)，2.05~1.40 (m, 4H)。
将化合物5 (300 mg, 0.76 mmol)溶于四氢呋喃(3 mL)中，加入氢氧化锂(36 mg, 1.52 mmol)的水溶液(1 mL)，室温搅拌2 h。浓缩后加入5 mL水，浓盐酸调pH至4，异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体B-1 (220 mg，收率76.0%)，mp. 175.3℃~176.9℃。MS (ESI) m/z：381.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 12.33 (s, 1H)，7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.62 (s, 1H)，6.23 (s, 2H)，6.14 (s, 2H)，5.75 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.40~4.35 (m, 1H)，4.06~4.02 (m, 1H)，3.15~2.99 (m, 2H)，2.46~2.41 (m, 1H)，2.01~1.97 (m, 1H)，1.76~1.40 (m, 3H)。
将化合物B-1 (60 mg, 0.16 mmol)溶于DMF (1 mL)中，加入HATU (90 mg, 0.24 mmol)和DIEA (41 mg, 0.32 mmol)，室温搅拌0.5 h。随后加入氯化铵(84 mg, 1.58 mmol)，继续反应3.5 h。异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到白色固体B-2 (46 mg，收率76.9%)，mp. 179.6℃~181.3℃。MS (ESI) m/z：380.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，7.37 (s, 1H)，6.87 (s, 1H)，6.23 (s, 2H)，6.14 (s, 2H)，5.74 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.40 (d, J = 13.2 Hz, 1H)，4.26 (d, J = 13.2 Hz, 1H)，2.95~2.83 (m, 2H)，2.35~2.25 (m, 1H)，1.95~1.85 (m, 1H)，1.80~1.70 (m, 1H)，1.65~1.40 (m, 2H)。
将化合物B-1 (90 mg, 0.24 mmol)溶于DMF (1 mL)中，加入HATU (108 mg, 0.28 mmol)和DIEA (61 mg, 0.47 mmol)，室温搅拌0.5 h。随后加入N-Boc-1,2-乙二胺(45 mg, 0.28 mmol)，继续反应3.5 h。乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到粉色固体6 (60 mg，收率48.5%)。MS (ESI) m/z：523.2 [M + H]+。
将化合物6 (60 mg, 0.12 mmol)溶于无水二氯甲烷(1 mL)中，加入三氟乙酸(0.5 mL)，室温搅拌1 h。减压浓缩，碳酸氢钠调pH至8，异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体B-3 (25 mg，收率51.5%)，mp. 203.4℃~205.0℃。MS (ESI) m/z：423.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 8.07 (s, 1H)，7.65 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，6.20 (s, 2H)，6.13 (s, 2H)，5.73 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.34 (t, J = 16.5 Hz, 2H)，3.03~2.74 (m, 5H)，2.40~2.30 (m, 1H)，1.95~1.90 (m, 1H)，1.81~1.56 (m, 2H)，1.50~1.35 (m, 2H)，1.24 (s, 2H)。
将化合物3 (50 mg, 0.17 mmol)溶于1,4-二氧六环(0.5 mL)中，加入3-(Boc-氨基)哌啶(52 mg, 0.26 mmol)和DIEA (1 mL)，氮气氛围下120℃反应6 h。冷却，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到粉色固体7 (48 mg，收率61.2%)。MS (ESI) m/z：452.2 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，6.24 (s, 2H)，6.10 (s, 2H)，5.75 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.19~4.05 (m, 2H)，3.01~2.94 (m, 2H)，2.85~2.82 (m, 1H)，1.94~1.90 (m, 1H)，1.75~1.71 (m, 1H)，1.50~1.42 (m, 2H)，1.40 (s, 9H)。
将化合物7 (45 mg, 0.10 mmol)溶于无水二氯甲烷(1 mL)中，加入三氟乙酸(0.5 mL)，室温搅拌1 h。减压浓缩，碳酸氢钠调pH至8，用异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到白色固体B-4 (32 mg，收率91.3%)，mp. 182.7℃~184.4℃。MS (ESI) m/z：352.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，6.24 (s, 2H)，6.10 (s, 2H)，5.75 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.19~4.05 (m, 2H)，3.01~2.94 (m, 2H)，2.85~2.82 (m, 1H)，1.94~1.90 (m, 1H)，1.75~1.71 (m, 1H)，1.48~1.40 (m, 2H)，1.23 (s, 2H)。
2.2.3. 目标化合物C1~C4的合成
将化合物3 (100 mg, 0.35 mmol)溶于1,4-二氧六环(0.6 mL)中，加入哌啶-4-羧酸甲酯(75 mg, 0.52 mmol)和DIEA (1.2 mL)，氮气氛围下120℃反应6 h。冷却，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到粉色固体8 (89 mg，收率64.9%)，MS (ESI) m/z：395.1 [M + H]+。
将化合物8 (89 mg, 0.23 mmol)溶于四氢呋喃(1.5 mL)中，加入氢氧化锂(11 mg, 0.45 mmol)的水溶液(0.5 mL)，室温搅拌2 h。浓缩，浓盐酸调pH至4，用异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体C-1 (64 mg，收率74.6%)，mp. 178.4℃~180.1℃。MS (ESI) m/z：381.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.1 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，6.24 (s, 2H)，6.14 (s, 2H)，5.76 (d, J = 5.1 Hz, 1H)，4.24 (d, J = 13.2 Hz, 2H)，3.10~2.95 (m, 2H)，1.94~1.88 (m, 2H)，1.65~1.45 (m, 2H)，1.25~1.20 (m, 1H)。
将化合物C-1 (52 mg, 0.14 mmol)溶于DMF (1 mL)中，加入HATU (78 mg, 0.21 mmol)和DIEA (35 mg, 0.27 mmol)，室温搅拌0.5 h。随后加入氯化铵(73 mg, 1.37 mmol)，继续反应3.5 h。异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，浓缩滤液，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体C-2 (22 mg，收率42.4%)，mp. 182.6℃~184.4℃。MS (ESI) m/z：380.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H),7.63 (s, 1H)，7.30 (s, 1H)，6.80 (s, 1H)，6.25 (s, 2H)，6.12 (s, 2H)，5.75 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.34 (d, J = 13.2 Hz, 2H)，2.95~2.86 (m, 2H)，1.83~1.75 (m, 2H)，1.60~1.45 (m, 2H)，1.26~1.22 (m, 1H)。
将化合物3 (50 mg, 0.17 mmol)溶于1,4-二氧六环(0.5 mL)中，加入4-(Boc-氨基)哌啶(52 mg, 0.26 mmol)和DIEA (1 mL)，氮气氛围下120℃反应6 h。冷却，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到粉色固体9 (48 mg，收率61.2%)。MS (ESI) m/z：452.2 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，6.23 (s, 2H)，6.10 (s, 2H)，5.74 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.24~4.19 (m, 2H)，3.01~2.93 (m, 2H)，2.90~2.83 (m, 1H)，1.87~1.70 (m, 2H)，1.39 (s, 9H)，1.36~1.29 (m, 2H)。
将化合物9 (55 mg, 0.12 mmol)溶于无水二氯甲烷(1 mL)中，加入三氟乙酸(0.5 mL)，室温搅拌1 h。减压浓缩，碳酸氢钠调pH至8，异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，浓缩，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体C-3 (40 mg，收率93.4%)，mp. 185.2℃~187.0℃。MS (ESI) m/z：352.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，6.23 (s, 2H)，6.10 (s, 2H)，5.74 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.24~4.19 (m, 2H)，3.01~2.93 (m, 2H)，2.90~2.84 (m, 1H)，1.87~1.70 (m, 2H)，1.36~1.14 (m, 4H)。
将化合物3 (135 mg, 0.47 mmol)溶于1,4-二氧六环(1 mL)中，加入3-(Boc-氨甲基)哌啶(100 mg, 0.47 mmol)和DIEA (2 mL)，氮气氛围下120℃反应6 h。反应液冷却至室温后加入水，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，以饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯 = 1:1)，得到酒红色固体10 (165 mg，收率75.9%) MS (ESI) m/z：466.2 [M + H]+。
将化合物10 (165 mg, 0.35 mmol)溶于无水二氯甲烷(2 mL)中，加入三氟乙酸(1 mL)，室温搅拌1 h。浓缩，碳酸氢钠调pH至8，异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，浓缩，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体C-4 (68 mg，收率52.5%)，mp. 191.8℃~193.3℃。MS (ESI) m/z：366.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.65 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，6.26 (s, 2H)，6.11 (s, 2H)，5.75 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.23 (td, J = 11.1, 10.1, 4.8 Hz, 2H)，3.01~2.86 (m, 2H)，2.80~2.63 (m, 2H)，1.90~1.60 (m, 3H)，1.53~1.41 (m, 2H)，1.25 (s, 2H)。
3. 生物活性评价
SHP2通过双磷酸化酪氨酸(pTyr)肽与其SH2结构域结合而被变构激活。此激活步骤导致SHP2蛋白的自抑制构象发生改变，从而使N-SH2域与PTP域分离而暴露出催化位点，暴露的催化位点能够与底物识别并催化其发生去磷酸化反应[1]。SHP2的催化活性可采用快速荧光分析方法，通过替代底物DiFMUP的去磷酸化程度进行监测。该磷酸酶反应于37℃下在384孔黑色聚苯乙烯板、平底、低凸缘、非结合表面中进行，最终反应体积为100 μL，并采用60 mM HEPES (pH = 7.2)、75 nM NaCl、75 nM KCl、1 nM EDTA、0.05% P-20、5 mM DTT 作为分析缓冲条件。用100% DMSO将受试化合物配制为一系列浓度梯度的溶液，实验设置最大组(SHP2 + IRS1 + DiFMUP)、最小组(SHP2 + DiFMUP)、测试组(SHP2 + IRS1 + DiFMUP + 受试化合物)和对照组(SHP2 + DiFMUP + 受试化合物)阳性对照组为TNO155。将受试化合物与0.5 nM的SHP2和1 μM的激活肽IRS1-pY1172在室温下于反应液中共同孵育1小时，随后将10 μM替代底物DiFMUP添加到反应液中，并继续在室温下孵育30分钟。采用Tecan多功能酶标仪340 nm激发波长和450 nm激发波长的监测反应液的荧光信号，根据荧光比值计算化合物对蛋白结合的抑制率。实验结果如表1所示。
Table 1. Inhibitory activity of target compounds A-1~A-3, B-1~B-4 and C-1~C-4 against SHP2
表1. 目标化合物A-1~A-3，B-1~B-4和C-1~C-4对SHP2的抑制活性
Compound |
R |
Inhibition rate (%) at 10 μmol/L |
SHP2 IC50 (μM) |
A-1 |
|
13.74 |
ND |
A-2 |
|
5.57 |
ND |
A-3 |
|
14.91 |
ND |
B-1 |
|
37.20 |
ND |
B-2 |
|
13.95 |
ND |
B-3 |
|
59.18 |
2.21 |
B-4 |
|
23.09 |
ND |
C-1 |
|
12.18 |
ND |
C-2 |
|
52.81 |
3.74 |
C-3 |
|
86.80 |
0.10 |
C-4 |
|
78.59 |
0.51 |
TNO155 |
|
97.98 |
0.032 |
ND：未检测。
4. 结果与讨论
本文设计并合成了11个未见文献报道的吡嗪类目标化合物，其结构均经1H-NMR和ESI-MS确证。从表1的活性数据可以看出，目标化合物在10 μmol/L浓度下对SHP2蛋白的作用均显示不同程度的抑制活性，其中C-3和C-4的活性相对突出，其IC50值分别为0.10 μM和0.51 μM，值得进一步研究。
从表1的数据可以获得以下构效关系规律：1) 从整体来看，C系列目标化合物的活性整体优于A系列和B系列(e.g. A-2 vs B-4 vs C-3)；2) A系列目标的羧基、氨基、酰胺基取代化合物活性均不高(e.g. A-1 vs B-1和A-2 vs C-3)；3) B系列化合物中氨基取代类活性较好，提示氨基质子化后能够与蛋白形成稳定的相互作用(e.g. B-1 vs B-2 vs B-4)；4) 从B、C系列化合物中，不难看出取代基位置与化合物活性强弱有关，提示氨基构象影响其与蛋白之间相互作用(e.g. B-2 vs C-2和B-4 vs C-3)。
为了进一步说明目标化合物的构效关系，我们通过Maestro和PyMOL，选取了活性最好的C-3进行分子对接实验。结果如图6所示，C-3处于SHP2蛋白的变构口袋中，其中哌啶环上的氨基质子化后，能够与Thr108、Glu110和Phe113形成氢键相互作用网络，Arg111与吡嗪环的阳离子-π堆积作用以及Arg111与吡嗪环上的N原子形成氢键作用力仍然存在，吡嗪环上的氨基同样与Glu250形成氢键。在对比C-3和B-4对接结果时，发现B-4化合物右侧氨基的构象阻碍右侧氨基与Phe113氢键作用的形成，证明了Phe113是活性必需氨基酸。综上所述C-3与靶蛋白的结合模式和TNO155相似，这些相互作用力的存在，可能是C-3活性较其他化合物活性高的原因。
Figure 6. Binding modes of C-3 and B-4 with target proteins (PDB ID: 7JVM)
图6. C-3和B-4与靶蛋白的结合模式(PDB ID: 7JVM)
5. 结论
本文拓展了SHP2变构抑制剂结构的多样性，采用拼接策略设计并合成了11个吡嗪类化合物，所有化合物对SHP2都有一定的抑制作用，其中3-((2-氨基-3-氯吡啶-4-基)硫代)-6-(4-氨基哌啶-1-基)吡嗪-2-胺(C-3)表现出较好的抑制活性，遗憾的是，该化合物不如阳性化合物TNO155活性高。在分析化合物的构效关系后，发现右侧片段上的氨基能够影响化合物的生物活性，表明该结构是活性所必需的，为后续针对左侧结构优化的研究提供更多理论支持。
基金项目
国家自然科学基金项目(22277142)。
NOTES
*通讯作者。