基于叶绿体基因组变异位点的百合属(百合科)植物资源遗传多样性的分子鉴定新方法

A Novel Method for Molecular Identification of Genetic Diversity of Plant Resources in Lilium L. (Liliaceae) Based on Taxon-Specific Variable Nucleotide Characters from Whole Chloroplast Genome Sequences

摘要: 精准鉴定遗传多样性是植物资源利用和深入开展科学研究的基础。我们利用百合属7个种的叶绿体基因组序列中的物种特有的995个核苷酸变异位点作为分子性状编制分子鉴定检索表，供试样品得到成功鉴定。物种特有变异位点的数量和核苷酸构成存在种间差异。紫斑百合Lilium nepalense (791)的特有变异位点的数量最多，随后依次为台湾百合L. Formosanum (80)、竹叶百合L. Hansonii (47)、条叶百合L. callosum(28)、垂花百合L. Cernuum (21)、野百合L. brownii(19)和卷丹L. Lancifolium (9)。紫斑百合的特有变异位点中，A (27.05%)或T (32.24%)的比例明显高于C (19.97%)或G (20.73%)。台湾百合的特有变异位点中，A (26.25%)或T(31.25%)的比例也是多于C (22.50%)或G(20.00%)。竹叶百合的特有变异位点中，A的比例(42.55%)最高，是C (8.51%)的比例的5倍，是G(14.89%)的比例的2.8倍以上；T的比例(34.04%)是C(8.51%)的比例的4倍，是G(14.89%)的比例的2.2倍以上。条叶百合的特有变异位点中，A的比例(17.86%)低于T (25.00%)、C (28.57%)或G (28.57%)。垂花百合的特有变异位点中，T的比例(47.62%)为A (19.05%)、C (19.05%)或G (14.29%)的2倍以上。野百合的特有变异位点中，A的比例(47.62%)最高，是C (5.26%)的比例的约9倍，G (15.79%)或T (31.57%)的比例分别是C的比例的约3倍和6倍。卷丹的特有变异位点中，C的比例(44.44%)为G的比例(11.11%)的约4倍。结果显示，叶绿体基因组的单核苷酸变异位点信息，可用于百合属植物资源遗传多样性的分子鉴定。调查了中国过去120多年来百合属植物标本的收集现状，讨论了存在的问题与对策。本研究对于百合属植物的分类修订、种质资源的保护和利用具有重要价值。

Abstract: Accurate identification of genetic diversity is essential for utilization of plant resources and further scientific researches. In this paper, 995 taxon-specific variable nucleotide characters in the complete chloroplast genome of 7 species from the genus Lilium L. were used as molecular traits to identify the genetic resources of this plant genus and to compile a molecular classification key for the first time. There are differences in aspects of amount and base composition of variable nucleotide characters among the species. The amount of taxon-specific variable nucleotide characters in Lilium nepalense (791) is the highest, followed by L. formosanum (80), L. hansonii (47), L. callosum (28), L. cernuum (21), L. brownii (19) and L. lancifolium (9). The proportion of A (27.05%) or T (32.24%) is higher than that of C (19.97%) or G (20.73%) in Lilium nepalense. The proportion of A (26.25%) or T (31.25%) is also higher than that of C (22.50%) or G (20.00%) in L. formosanum. In L. hansonii, the highest proportion of A (42.55%) is 5 times that of C (8.51%) and above 2.8 times that of G (14.89%); the proportion of T (34.04%) is 4 times that of C, and more than 2.2 times that of G. The proportion of A (17.86%) is lower than that of T (25.00%), C (28.57%) or G (28.57%) in L. callosum. The proportion of T (47.62%) is more than 2 times that of A (19.05%) , C (19.05%) or G (14.29%) in L. cernuum. The highest proportion of A (47.62%) is 9 times the lowest value of C (5.26%), and the proportion of G (15.79%) or T (31.57%) is about 3 times or 6 times that of C in L. brownii. The proportion of C (44.44%) is about 4 times that of G (11.11%) in L. lancifolium. Our results indicated that taxon-specific variable nucleotide characters from the chloroplast genomes could be used for distinguishing different species successfully in the genus Lilium. The status of Lilium plant specimens collected in the past over 120 years in China is investigated and problems and possible strategies are discussed. This study is valuable for taxonomic revision, conservation and utilization of Lilium plant germplasm resources.Goutong KeywordsLiliaceae, Lilium L., Plant Resources, Complete Chloroplast Genome, Variable Nucleotide Character, Molecular Identification[-rId11-]Copyright © 2024 by author(s) and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/[-rId13-] [-rId14-]1. 引言百合属(Lilium L.)植物(百合科Liliaceae)是具有多年生地下鳞茎(球根)的单子叶草本植物，主要分布在北半球的温带地区。根据表型特征(即种子、叶片、叶柄、珠芽、鳞茎、鳞片数目和质地、花被、花药的着生方式、蜜腺、茎、柱头和茎生根、果实的形状等)进行分类，全球约有134种/亚种/变种[1] [2] [3]。食用的栽培百合品种，肉质鳞片的味道不苦，是蔬菜中的佳品，例如，兰州百合L. davidii var. willmottiae (E.H. Wilson) Raffill。名菜名吃有西芹百合、百合花煎鸡蛋、百合鸡片、百合粥等。美洲的印第安人挖取地下的百合鳞茎充饥。百合的花朵和鳞茎也用于酿酒或提取天然色素。花蕾可阴干剪碎泡茶，清香味美。百合的鳞片和花也是常用的中药材，例如，百合L. brownii F. E. Brown var. viridulum Baker、卷丹L. lancifolium Thunb.、山丹L. pumilum Redouté。“百合”的词意是指鳞茎由多数鳞片叠合而成，常用不同颜色的百合来表现纯洁、高贵、吉祥、祝福等寓意，许多民间传说、诗词歌赋、美术工艺品取材于百合。百合的花色艳丽、花姿独特，观赏价值高，是全球畅销的鲜切花。鳞片也可制成有机百合干、百合粉，具有很高的商业价值和开发前景。百合是药食同源和观赏兼用的植物，作为名药和蔬菜种植已有约3800年的历史[4]-[13]。在实际中，同名异物和同物异名导致资源名称混乱使用，制约着相关科研和产业发展。百合属植物资源多样性一直是研究的热点。随着新技术的出现，百合属植物的鉴定研究经历了形态学、细胞学、孢粉学、化学成分、RAPD、PCR-RFLP、AP-PCR、SSCP、SSR标记、DNA条形码技术等阶段，但是，都存在稳定性差、通用性不佳、信息量有限的问题[4]-[31]。近年，叶绿体全基因组序列数据提供的遗传变异位点稳定，信息量较大，实验成本较低、方法较简单，已广泛应用于植物的物种鉴定和系统发育研究[4]-[31]。为促进百合属植物的资源保护、可持续利用和相关产业发展，本文报道在分子水平上鉴定百合属植物资源遗传多样性的一种新方法。2. 材料与方法选取14份样品代表百合属的7个种。供试样品名称及其叶绿体基因组的序列号见表1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)。每个种取样2个体。利用MAFFT v7.055b软件[32](http://mafft.cbrc.jp/alignment/software)获得比对序列矩阵。比对后的序列矩阵的长度为154,418个核苷酸，由左向右，左端(5’-端)起的第1个核苷酸字母的位置编号为1，最右端的核苷酸字母的位置编号为154,418。用MEGA 7.0 [33]和DnaSP v6软件[34] (http://www.ub.edu/dnasp/)检测核苷酸变异位点(见图1，表2)。仅保留种间存在差异且种内个体间一致的变异位点代表物种的特有核苷酸变异位点，作为分子分类性状，利用本团队研发的方法[16]-[31]，编制百合属供试样品的分子分类检索表(见图1)。百合科的大百合Cardiocrinum cordatum Makino (大百合属Cardiocrinum (Endl.) Lindl.)和假百合Notholirion bulbuliferum (Lingelsh.) Stearn (假百合属Notholirion Wall. ex Voigt & Boiss.)为外类群(见表1和图2)，用MEGA 7.0软件的Tamura 3-parameter model参数模型推断系统发生关系(见图2)。[-rId18-][-rId19-][-rId20-][-rId21-][-rId22-]Figure 1. Molecular taxonomic key to seven species of the genus Lilium L. (Liliaceae) based on the species-specific variable nucleotide characters from the complete chloroplast genome图1. 基于叶绿体基因组的物种特有核苷酸变异位点的百合属7个种的分子分类检索表3. 结果百合属供试样品的质体基因组的长度为152,553 (MT261161.1, Lilium cernuum)~152,677 (KY748296.1, Lilium brownii)个核苷酸。在比对序列中，共检测到1583个核苷酸变异位点，占质体基因组序列全长的约1.04%。其中，各物种的特有核苷酸变异位点数目合计为995个核苷酸，占变异位点总数的62.86%。紫斑百合L. nepalense的特有变异位点的数量(791)最多，依次为台湾百合L. formosanum (80)、竹叶百合L. hansonii (47)、条叶百合L. callosum (28)、垂花百合L. cernuum (21)、野百合L. brownie (19)和卷丹Table 1. Samples and Genbank accession numbers of chloroplast genome sequences used in this study表1. 供试样品及叶绿体基因组序列号注：^*外类群。[-rId23-]Figure 2. Phylogenetic tree of the seven Lilium species based on complete chloroplast genome sequences using the neighbour-joining method with the Tamura 3-parameter model. The numbers near the branches are bootstrap support values (%) of 1000 replications 图2. 基于叶绿体基因组序列的百合属7个种的系统发生关系。分支图中的数字为1000次重复抽样的自展支持率L. lancifolium (9)。紫斑百合的特有变异位点中，A (27.05%)或T (32.24%)的比例明显高于C (19.97%)或G (20.73%)。台湾百合的特有变异位点中，A (26.25%)或T (31.25%)的比例也是多于C (22.50%)或G (20.00%)。竹叶百合的特有变异位点中，A的比例(42.55%)最高，是C (8.51%)的比例的5倍，是G (14.89%)的比例的2.8倍以上；T的比例(34.04%)是C (8.51%)的比例的4倍，是G (14.89%)的比例的2.2倍以上。条叶百合的特有变异位点中，A的比例(17.86%)低于T (25.00%)、C (28.57%)或G (28.57%)。垂花百合的特有变异位点中，T的比例(47.62%)为A (19.05%)、C (19.05%)或G (14.29%)的2倍以上。野百合的特有变异位点中，A的比例(47.62%)最高，是C (5.26%)的比例的约9倍，G (15.79%)或T (31.57%)的比例分别是C的比例的约3倍和6倍。卷丹的特有变异位点中，C的比例(44.44%)为G的比例(11.11%)的约4倍(见表2)。特有变异位点的数量和核苷酸构成存在种间差异。利用特有核苷酸变异位点，编制分子分类检索表，供试样品得到精准鉴定(见图1和图2)。供试样品的系统发生关系树状图中，紫斑百合位于较基部的位置(见图2)。Table 2. Base composition of variable nucleotide sites for classification of the seven species from the genus Lilium L. of the Liliaceae表2. 百合属植物7种的具有分类价值的核苷酸变异位点数目及碱基构成注：^*该列的序号与检索表内的序号对应；1a. 紫斑百合Lilium nepalense，2a.台湾百合Lilium formosanum，3a. 野百合Lilium brownii，4a. 竹叶百合Lilium hansonii，5a. 垂花百合Lilium cernuum，6a. 卷丹Lilium lancifolium，7a. 条叶百合Lilium callosum；^**核苷酸变异位点数(在4种碱基中的占比)；^***此列括号中，前一个数字是在物种特有变异位点总数(995个)中所占的比例；后一个数字是在全部核苷酸变异位点总数(1583个)中所占的比例。4. 讨论中国数字植物标本库(http://www.cvh.ac.cn/)的数据显示，百合属标本的采集记录最早是1901年，经过120多年的积累，来自国内外的百合属植物标本共计11,333份，108个种/亚种/变种/品种，含形态特征图片和文字描述，占百合属全球物种数量的约80%。存在同物异名和同名异物现象，例如，Lilium sempervivoideum subsp. amoenum (E.H. Wilson ex Sealy) S. Yun Liang是玫红百合Lilium amoenum E.H. Wilson ex Sealy的异名；Lilium lowii Baker是滇百合(原变种)Lilium bakerianum var. bakerianum的异名；Lilium delavayi Franch.是黄绿花滇百合(变种)Lilium bakerianum var. delavayi (Franch.) E.H. Wilson的异名；Lilium linceorum H. Lév. & Vaniot是紫红花滇百合(变种) Lilium bakerianum var. rubrum Stearn的异名；Lilium yunnanense Franch.是无斑滇百合(变种) Lilium bakerianum var. yunnanense (Franch.) Sealy ex Woodcock & Stearn的异名；Lilium nanum var. brevistylum S. Yun Liang是短柱小百合Lilium brevistylum (S. Yun Liang) S. Yun Liang的异名；Lilium australe Elwes、Lilium brownii var. australe (Stapf) Stearn是野百合Lilium brownii F.E. Br. ex Miellez的异名；Lilium wenshanense L.J. Peng & F.X. Li是野百合(原变种)Lilium brownii var. brownii的异名；Lilium aduncum Elwes、Lilium brownii var. colchesteri Van Houtte ex Stapf、Lilium brownii var. ferum Stapf ex Elwes、Lilium odorum Planch.是百合Lilium brownii var. viridulum Baker的异名；Lilium croceum Chaix是珠芽百合Lilium bulbiferum L.的异名；Lilium talanense Hayata是条叶百合(原变种)Lilium callosum var. callosum的异名；Lilium concolor var. luteum Regel、Lilium concolor var. sinicum (Lindl. & J. Paxton) Hook. f.是渥丹Lilium concolor Salisb.的异名；Lilium concolor var. coridion (Siebold & de Vriese) Baker是渥丹(原变种)Lilium concolor var. concolor的异名；Lilium megalanthum (F.T. Wang & Tang) Q.S. Sun是大花百合(变种)Lilium concolor var. megalanthum F.T. Wang & Tang的异名；Lilium buschianum G. Lodd.、Lilium pulchellum Fisch.是矮百合(变种)Lilium concolor var. partheneion (Siebold & de Vriese) Baker的异名；Lilium concolor var. buschianum (Lodd.) Baker是有斑百合(变种)Lilium concolor var. pulchellum (Fisch.) Baker的异名；Lilium sutchuenense Franch.、Lilium thayerae E.H. Wilson是川百合(原变种)Lilium davidii var. davidii的异名；Lilium willmottiae E.H. Wilson是兰州百合(变种)Lilium davidii var. willmottiae (E.H. Wilson) Raffill的异名；Lilium forrestii W.W. Sm.、Lilium duchartrei var. farreri (Turrill) K. Krause是宝兴百合Lilium duchartrei Franch.的异名；Lilium philippinense var. formosanum (Wallace) E.H. Wilson是台湾百合Lilium formosanum A. Wallace的异名；Lilium makinoi Koidz.是日本百合Lilium japonicum Thunb. ex Houtt.的异名；Lilium tigrinum Ker Gawl.是卷丹Lilium lancifolium Thunb.的异名；Lilium maximowiczii Regel、Lilium leichtlinii var. tigrinum (Regel) G. Nicholson、Lilium pseudotigrinum Carrière是大花卷丹(变种)Lilium leichtlinii var. maximowiczii (Regel) Baker的异名；Lilium brownii var. leucanthum Baker、Lilium leucanthum var. chloraster (Baker) E.H. Wilson、Lilium leucanthum var. leiostylum Stapf ex Elwes是宜昌百合Lilium leucanthum Baker的异名；Lilium huidongense J.M. Xu、Lilium ningnanense J.M. Xu是丽江百合Lilium lijiangense L.J. Peng的异名；Lilium lophophorum form wardii (Balf.f.) Sealy是尖被百合Lilium lophophorum Franch.的异名；Lilium lophophorum subsp. linearifolium Sealy是线叶百合(变种)Lilium lophophorum var. linearifolium (Sealy) S. Yun Liang的异名；Lilium avenaceum Fisch. ex Regel是浙江百合Lilium medeoloides A.Gray的异名；Lilium euxanthum (W.W. Sm. & W.E. Evans) Sealy是黄花小百合Lilium nanum var. flavidum (Rendle) Sealy的异名；Lilium parvum var. luteum Purdy是沙斯特百合Lilium pardalinum subsp. shastense (Eastw.) M.W. Skinner的异名；Lilium dahuricum hort. ex Reuthe.、Lilium dauricum Ker Gawl.、Lilium maculatum subsp. dauricum (Ker Gawl.) H. Hara、Lilium maculatum var. dauricum (Ker Gawl.) Ohwi是宾州百合Lilium pensylvanicum Ker Gawl.的异名；Lilium umbellatum Pursh是费城百合Lilium philadelphicum L.的异名；Lilium nepalense var. burmanicum W.W. Sm.是紫喉百合(变种)Lilium primulinum var. burmanicum (W.W. Sm.) Stearn的异名；Lilium nepalense var. ochraceum (Franch.) S. Yun Liang、Lilium ochraceum Franch.、Lilium tenii H. Lév.是川滇百合(变种)Lilium primulinum var. ochraceum (Franch.) Stearn的异名；Lilium linifolium Hornem.、Lilium tenuifolium Fisch.是山丹Lilium pumilum Redouté的异名；Lilium omeiense Z.Y. Zhu是通江百合Lilium sargentiae E.H. Wilson的异名；Lilium saccatum S. Yun Liang Table 3. Specimens of Lilium in the Chinese Virtual Herbarium表3. 中国数字植物标本库馆藏的百合属植物标本续表续表续表是紫花百合Lilium souliei (Franch.) Sealy的异名；Lilium speciosum form rubrum (Lem.) Mast.是美丽百合Lilium speciosum Thunb.的异名；Lilium habaense F.T. Wang & Tang、Lilium xanthellum F.T. Wang & Tang、Lilium xanthellum var. luteum S. Yun Liang是单花百合Lilium stewartianum Balf.f. & W.W. Sm.的异名；Lilium myriophyllum Franch.是淡黄花百合Lilium sulphureum Baker的异名；Lilium jinfushanense L. J. Peng & B.N. Wang是大理百合Lilium taliense Franch.的异名；Lilium carneum Nakai、Lilium miquelianum Makino是青岛百合Lilium tsingtauense Gilg的异名；有些名称实际上是百合科其它属的物种的异名，例如，Lilium cordifolium Thunb. Lilium cordatum (Thunb.) Koidz & Airy Shaw是大百合属的大百合Cardiocrinum cordatum Makino的异名；Lilium giganteum Wall.是大百合属的Cardiocrinum giganteum (Wall.) Makino的异名；Lilium giganteum var. yunnanense Leichtlin ex Elwes是大百合属云南大百合Cardiocrinum giganteum var. yunnanense (Elwes) Stearn的异名；Lilium cathayanum E.H. Wilson是大百合属的Cardiocrinum cathayanum (E.H. Wilson) Stearn的异名；Lilium hyacinthinum E.H. Wilson是假百合属的假百合Notholirion bulbuliferum (Lingelsh.) Stearn的异名；Lilium macrophyllum (D. Don) Voss是大叶假百合Notholirion macrophyllum Boiss.的异名。同名异物和同物异名造成了一定的混乱，制约着物种鉴定研究和相关学科领域的发展。53%以上的百合属植物标本的采集日期为50年以前，DNA保存质量较差。少数物种的标本数量较多，例如，山丹L. pumilum Redouté(1968份)、野百合L. brownii F.E. Br. ex Miellez(1375份)、百合(变种)L. brownii var. viridulum Baker(840份)等。3份(含)以上标本的物种有81种/亚种/变种。低于3份标本的物种有27种/亚种/变种/品种。现有的标本材料不足以支持全面研究百合属所有物种的分子鉴定和系统发生关系。在出现过的百合名称(181个)中，异名(73)占40.33%。很多文献仅限于局部区域的百合属植物资源调查和研究，存在物种鉴定不够准确或没有区分接受名和异名的问题。部分百合属植物的分类认识提升仅通过一个项目组很难彻底完成，原因是某些关键技术被其他研究团队掌握，但他们不一定熟悉资源，因此，各研究团队应该将供试样品的标本同时备份一套到国家植物标本馆，以降低分类混乱现象造成的不良影响。净化处理后产生的符合标准的再生水及泥土可提高百合种植业的产量。对21国40个植物标本馆的4500份标本的取样调查结果显示，50%以上的热带植物标本存在名称鉴定错误[35]。标本鉴定研究过程中，名称需要更正的现象较为普遍。自1753年建立百合属，已有270多年，现阶段的工作重点应该是补全科属内物种的标本，达到能够提供DNA提取服务的需求。公益性研究成果全球受益，各国标本馆之间互赠标本、互通有无，是降低采集成本、推动相关领域快速发展的捷径之一。植物鉴定研究与系统发生关系研究经常联动开展，全球取样和多学科联合攻关是今后研究的大趋势[36]-[39]。分子检索表中的具有分类价值的单核苷酸变异位点的产生机制有待利用化学和量子科学领域的新技术深入研究。5. 结论与展望本研究首次报道基于质体基因组变异位点的百合属植物分子分类检索表方法，与百合属植物的全球种类数量相比，目前产业化可利用的百合资源的种类相对有限。有必要在百合属130余个物种范围内进一步筛选和培育更多优质食用、药用和观赏类型。本研究可为百合属植物资源的保护和利用提供技术基础。本研究从叶绿体基因组大数据中提取有物种分类价值的关键特征数据，在应用人工智能监测和管理全球植物资源多样性方面可达到节省算力、提高运算速度的目的。 感 谢本研究得到天津市人力资源和社会保障局、天津市人力资源建设服务中心、上海市人力资源和社会保障局、上海计算技术培训中心、安徽省人力资源和社会保障厅、中国科学技术大学、江西省人力资源和社会保障厅、井冈山大学、北京市人力资源和社会保障局、北京城市排水集团有限责任公司以及人力资源社会保障部国家专业技术人才知识更新工程项目的热情支持。感谢曾明华老师和王进华老师的热情指导。徐秀萍老师和田宏参与了有意义的讨论。本调查得到国家植物标本资源库(National Plant Specimen Resource Center)平台的支持。 基金项目 国家自然科学基金项目(No. 31770744)。

NOTES

^*通讯作者。