干细胞外泌体在帕金森综合症中的研究进展

Research Progress of Stem Cell Exosomes in Parkinson’s Disease

摘要: 帕金森综合症(Parkinson’s disease, PD)是一种常见的神经退行性疾病，发病机制复杂，至今尚未治愈方法。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)通过表达外泌体(Exosomes, Exos)发挥免疫调节清除炎症、诱导神经元分化、促血管生成和抑制肿瘤且具有驱动生物过程潜力；间充质干细胞来源的外泌体(mesenchymal stem cell-derived exosomes, MSC-Exos)加载特异RNA、蛋白质和小分子药物通过细胞通讯作用靶向受体细胞介导病理改变；经过修饰的Exos穿过血脑屏障(BBB)靶向神经元改善PD成为治疗候选者受到广泛关注。本文主要介绍PD病理特症、MSC-Exos的生物学特性及细胞通讯作用治疗PD，为攻克PD带来新曙光。目前，MSC-Exos对小胶质细胞表型转换促中枢神经系统起调节和保护作用机制仍缺乏深入而全面的总结，此外，我们结合研究阐述MSC-Exos增强PD功能策略。

Abstract: Parkinson’s disease (PD) is a common neurodegenerative disease with complex pathogenesis, and there is no cure so far. Mesenchymal stem cells (MSCs) play an immunomodulatory role in clearing inflammation, inducing neuronal differentiation, promoting angiogenesis and inhibiting tumors by expressing exosomes (Exos), and have the potential to drive biological processes. Mesenchymal stem cell-derived exosomes (MSC-Exos) loaded with specific RNA, protein and small molecule drugs target receptor cells to mediate pathological changes through cell communication. The modification of Exos across the blood-brain barrier (BBB) targeting neurons to improve PD has become a therapeutic candidate and has received widespread attention. This article mainly introduces the pathological characteristics of PD, the biological characteristics of MSC-Exos and the role of cell communication in the treatment of PD, which brings new dawn to overcome PD. At present, there is still a lack of in-depth and comprehensive summary of the mechanism of MSC-Exos in regulating and protecting the central nervous system by microglial phenotype transformation. In addition, we combined the research to explain the strategy of MSC-Exos to enhance PD function.

1. 引言

PD是老年人常见的神经退行性疾病，全球患病人数约600万[1]。研究数据显示[2]，我国PD患者普遍为65岁以上人群，且患病风险随年龄同步增长。PD的病理改变主要为中脑腹侧黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNpc)的多巴胺(Dopamine, DA)神经元胞质内α-突触共核蛋白(α-Synuclein, α-Syn)聚集，形成路易小体(Lewy body, LBs) [3]。LBs堆积影响正常DA神经元功能，DA神经元慢性丢失或患者黑质内尚存的DA能神经元异常聚集体，影响新生神经元形成[4]。其症状表现为运动迟缓、震颤、身体僵硬或强直、失去平衡能力及行走困难并伴随一些相应的非运动症状[5]，目前医疗手段无法完全逆转神经元死亡。MSC-Exos直径为50~150 nm，可透过血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)将活性成分(如蛋白、核酸、细胞因子、生长因子、信号脂质、信使RNA(mRNA)和非编码RNA(miRNA)等输送至中枢神经系统损伤区域发挥治疗作用[6] [7]；MSCs-Exos免疫调节、清除炎症和再生等突出表现备受学者青睐；MSC-Exos保留其起源细胞的治疗特性，包括遗传物质、脂质和蛋白质，成为神经系统疾病最有希望的治疗候选者。

本文综述MSC-Exos与PD的研究进展，MSCs-Exos的特性、细胞通讯作用及PD领域治疗应用，为PD的预防、早期诊断与治疗提供依据。揭示MSC-Exos的研究及其临床应用潜力，为PD治疗带来新的希望。

2. 帕金森综合症的研究进展

PD是一种临床综合症，发病原因至今不明，目前研究发现遗传、年龄、环境等是PD发病因素[8]。PD患者发病时间分为早发型(<45岁)和晚发型(≥60岁)，发病年龄 < 21岁为青少年型[9]。60岁以上人群PD患病率约为1%，70岁以上人群发病率达3%~5% [10]。

PD主要病理特征为中间区神经元退化导致纹状体中黑质－纹状体通路DA丧失；SNpc多巴胺能神经元相对选择性丧失导致纹状体DA含量降低；残存DA能神经元内形成以α-Syn为主要成分的嗜酸性包涵体-LBs [11]。LBs堆积影响正常DA神经元功能，与DA神经元凋亡密切相关，同时影响新生神经元形成。其发病机制涉及α-Syn异常聚集、氧化应激(oxidative stress, OS)、突触运输障碍、线粒体功能障碍、神经炎症及肠道菌群失调等[12]，这些病理条件导致DA能神经元死亡，引起运动障碍和非运动障碍[13]。

LBs形成是PD典型病理特征，SNCA编码的α-syn是LBs主要蛋白成分，以多种形式存在大脑中，例如可溶的、未展开的单低聚合形式[14]。α-Syn在环境毒素、细菌感染及病毒影响下发生错误折叠和异常过度聚集，对DA能神经元产生毒性，当其变性死亡超过50%，会导致PD [15]。Ma等[16]研究表明错误折叠的α-Syn具有“朊病毒样”的作用方式及扩散特性，通过模板化构象改变，从原始区域向邻近区域传播，导致黑质和纹状体神经元变性。OS由过量活性氧引起[17]，活性氧产生和消除处于平衡状态，一旦打破，引起OS，诱发PD等疾病[18]。后研究发现鱼藤酮通过OS途径使小鼠脑黑质中α-syn聚集，导致DA能神经元损伤；PD患者尸检结果显示，其黑质部位存在严重的OS，如游离铁离子增多，线粒体复合体Ⅰ功能受损。大量被氧化损伤的脂质、蛋白质和DNA是出现PD综合征的表现[19]。现研究多关注线粒体与PD的关系，发现线粒体异常会引起DA能神经元进行性缺失，出现PD症状[20]。柴原[21]等得出，PD患者脑黑质内线粒体呼吸链中复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ功能缺陷，导致自由基过多，引起腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)供给异常，破坏细胞内外电离子平衡，细胞膜通透性增加，释放细胞凋亡因子，造成脑黑质神经元死亡，引发PD。在感染流感病毒(嗜睡性脑炎)个体中首次观察到PD症状后，一直致力于研究炎症是否导致PD症状发生[22]。PAJARES M等[23]研究发现，在PD病理过程中，PD认知障碍主要影响因素是神经炎症，α-Syn大量聚集诱导适应性免疫和固有免疫，从中激活小胶质细胞。激活神经胶质细胞(小胶质细胞和星形胶质细胞)产生大量促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)、趋化因子和神经调节素等。在破坏影响BBB的同时，使神经元出现炎症反应，促进DA能神经元退行性变性和死亡，加重PD病理进程[24]。现研究表明，肠道菌群失调与PD等疾病具有密切关系[25]。Qian等[26]研究发现，在PD患者粪便中检测到多种致病菌属，如厌氧菌、水杆菌属、梭菌属等，上述结果指向胃肠道微生物与PD患者临床表现之间存在密切相关性。PD由多种因素如OS、神经炎性反应等共同作用导致，除上述机制外，引发PD的因素还有环境因素、遗传因素、钙稳态失衡等。有相关文献[27]指出，二甲苯类、丙酮类、重金属等化学物质也可能引发PD。

现今PD治疗主要采取减缓症状的方式，分为手术治疗和药物替代治疗，但无显著有效的药物[28]。现今多数药物属于DA受体激动剂与左旋多巴类制剂，但药物作用仅表现在症状治疗及体征缓解，无法抑制病情恶化，未从根本上解决病理特征[29]。左旋多巴是PD治疗的一线药物，为DA的前体，本身无药理活性，由多巴脱羧酶作用转化为DA，通过BBB进入中枢发挥药理作用，提高中枢神经DA浓度，增加脑神经之间传导与兴奋，改善黑质纹状体DA能神经系统功能，但长期应用会引起不良反应[30] [31]。DA受体激动剂起维持DA在脑中含量，减少向外周释放作用[32]。研究报道，DA受体激动剂的应用可减少左旋多巴制剂造成的不良反应[33]。目前药物及手术治疗能一定程度改善患者运动功能紊乱症状，但不能抑制中脑黑质DA神经元继续丢失，无法中断病情发展，PD仍是一种无法治愈的神经退行性疾病[34]。胥昕怡等[35]研究左旋多巴联合司来吉兰或普拉克索治疗PD药物剂量；陈鹏等[36]针对非运动症状对PD进行针灸治疗。有研究在体外通过诱导分化或提纯富集的方法获得神经干细胞用于治疗PD动物模型并取得效果[37]。当前纳米技术的进步一定程度缓解PD症状，却难以找到确切的治疗方式。各种细胞及组织释放的Exos有望成为一种新兴的神经退行性疾病纳米治疗剂，作为自然输送载体用于PD治疗。

3. 干细胞外泌体的生物学特性

Exos是直径约30~100 nm的双层磷脂膜囊泡小体，源于多囊泡体(multivesicular bodies, MVBs)中的腔内囊泡(intraluminal vesicles, ILVs) [38]，根据大小和生物发生依据，细胞外囊泡分为3类，即凋亡小体、微泡和外泌体[39]。Exos为细胞分泌组成员，是影响邻近细胞的旁分泌信使，也是血液循环中的全身信使[40]。Exos由各种不同细胞分泌，如小胶质细胞、淋巴细胞等，且稳定存在于体液中[41]；被视为特异性分泌的膜泡，携带蛋白质、脂质、基因载体功能性mRNA、大量非编码RNA (ncRNA)等其他生物活性物质[42]，可以清除细胞碎片、参与细胞间通讯、细胞间病原体转移、调节Exos膜与受体细胞融合[43]。Exos由多泡体和质膜结合形成纳米级小生物囊泡熔断并释放到周围体液中，通过膜融合方式释放至细胞外液，并以自分泌、旁分泌方式作用于临近细胞或进入血液系统流向远隔细胞，通过受体配体结合、内吞作用和胞浆膜融合等方式直接作用于靶细胞，参与复杂的细胞间物质交换及信息交流[44]。

MSCs是一种多组织来源的多能干细胞[45]，目前发现MSCs是分泌Exos能力最强的细胞[46]，主要通过旁分泌、Exos或者直接分化替代等方式对自身免疫性疾病，神经系统疾病，骨髓移植以及肿瘤等临床疾病具有良好治疗效应[47]，促进血管生成和组织修复等作用[48]。MSC-Exos含有生长因子、细胞因子、DNA、脂质、mRNA、miRNA和mtRNA (图1)。具有治疗特性，包括刺激细胞迁移和细胞外基质合成，抗凋亡、免疫调节和抗炎作用，刺激胶原蛋白沉积。这些治疗特点，使MSC-Exos具有治疗可行性。MSC-Exos通过两种方式治疗神经疾病：MSC-Exos富含miR-133b、miR-9、miR-21a等miRNA，直接用于疾病治疗；特异RNA、蛋白质和小分子药物加载至Exos中，经过修饰的Exos可靶向治疗神经系统疾病[49]。现有研究成功装载过氧化氢酶、DA、过氧化氢酶mRNA分子和siRNA分子用于PD治疗，疗效显著[50]。Hall等[51]将载有过氧化氢酶的Exos注入C57BL/6小鼠体内，显著降低CD11b生成，而游离过氧化氢酶不能减少对脑部神经元的损害，证明Exos可透过BBB，通过有效转运蛋白并发挥作用，是信息交流和物质交换的重要媒介。Exos具有低免疫原性、较长的半衰期及穿过BBB的能力，能参与脑损伤等发生后的血管新生、神经再生、突触可塑性等诸多病理过程，miRNA介导的信号网络在神经退行性疾病大脑修复过程中起到关键作用[52]，为PD等多种神经系统疾病治疗提供广阔前景。

Figure 1. Component structure of MSC-Exos

图1. MSC-Exos的组成结构

4. MSC-Exos在PD治疗中的作用和应用

4.1. MSC-Exos在PD治疗中的通讯作用

Exos具有作为PD生物标志物的细胞通讯特性，其表面特定分子包括细胞粘附蛋白，被特定受体细胞结合，将携带的物质分子从供体细胞转移到受体细胞，引发后者产生变化。此特性称为Exos的细胞通讯作用，该物质被认为参与细胞通讯并传递信息至另一受体细胞[53]。

Exos中含有mi-croRNA、核酸、蛋白质、脂质等多种物质，发挥靶向调节与细胞间通讯作用[54]，用经过修饰的Exos靶向治疗神经系统疾病。有研究狂犬病毒糖蛋白肽修饰过的Exos (RVG-exosome)装载具有抗α-syn功能的shRNA微环(shRNA-MCs)，尾静脉接种实验PD小鼠。得出小鼠脑内α-syn表达减少、聚集能力下降，且黑质致密部DA能神经元丢失减少，改善临床症状[55]。

MSCs具有自我更新、分化的能力[56]，可分泌具有抗炎、抗凋亡和营养活性的因子。现证实MSCs-Exos有助改善受损的神经系统功能和增强血管神经发生。研究发现脱落乳牙MSCs来源的Exos能抑制6-羟基多巴胺诱导的DA能神经元凋亡[57]。MSCs-Exos将成为PD治疗的新途径，为干细胞移植治疗神经退行性疾病提供一种有效的替代方法[58]。

MSC-Exos作为有效的药物载体，可透过BBB进入体液循环，靶向治疗PD [59]，具有成为无创诊断和治疗传递载体的巨大潜能。Peng等[60]开发一种自定向纳米载体与MSCs-Exos结合，在多个膜屏障上具有自我导向性，通过鼻内给药将药物释放到靶细胞的细胞质中，药效增强，减少α-syn聚集，恢复神经元功能。有研究发现MSC-Exos能抑制6-羟基多巴胺诱导的DA能神经元凋亡，在PD中起到抑制DA神经元凋亡、发挥神经保护的作用。TEIXEIRA等[61]探讨人骨髓MSCs-Exos对6-羟基多巴胺模型动物运动性能的影响，及酪氨酸羟化酶的表达对黑质和纹状体组织学参数的影响。发现人骨髓MSC-Exos能改善动物模型DA细胞存活和运动功能，同时结合人骨髓MSC-Exos的神经调节特征，候选可能用于治疗的生物活性分子，探讨其机制和途径。这一研究为MSCs释放的生物活性分子发挥神经保护和抗凋亡作用提供思路。

综上所述，Exos及 MSC-Exos具有在循环中长半衰期以及可携带小分子物质如miRNA和蛋白质等跨越BBB、低免疫原性、进行细胞间通讯、物质运输及作为药物载体等特点。MSC-Exos在中枢神经系统再生医学中有望成为新治疗策略的基础[62]。

4.2. MSC-Exos在PD中的应用

Exos可装载生物活性分子，满足个体化治疗需求；能通过BBB，传递药物进入中枢神经系统发挥作用；良好的生物相容性使其进入机体后免受免疫系统的伤害，以上特点决定Exos在PD治疗中的能力。目前MSC-Exos被认为是一种具有巨大潜力的PD治疗工具。

Exos细胞间通讯作用可作为PD的生物标志物，反映PD的病理情况并监测疾病进展。MANNA等[63]通过TaqMan测定33名健康对照者、40例PD病和20例进行性核上麻痹(Progressive Supranuclear Paralysis, PSP)患者的血清miRNA水平，筛选出miR-21-3p，miR-22-3p，miR-223-5p，miR-425-5p和miR-199a-5p这5个Exos miRNA可作为生物标志物区分PD和PSP。LUO等[64]开展治疗PD患者的临床试验，对治疗后血清Exos α-syn进行评估，结果显示有效治疗组的患者血清Exos α-syn明显降低，表明PD治疗的疗效可通过基于Exos α-syn水平测量的非侵入性分析来监测。

Exos通过携带蛋白质、mRNA或microRNA等成分影响受体细胞中基因表达和蛋白活性[65]，其细胞间通讯作用可靶向输送治疗物质和细胞因子，可能在PD临床治疗中发挥作用，改善其症状。HANEY 等[66]利用单核细胞和巨噬细胞开发一种负载过氧化氢酶的新Exos递送系统；在PD模型中，Exos被神经元摄取，积聚在大脑中的神经元和小胶质细胞中；过氧化氢酶为强效抗氧化剂，被摄取后释放可改善神经炎症并增加神经存活率，具有保护神经作用，缓解PD进展。

目前MSC-secretome能调节DA的存活，被认为是几种神经退行性疾病(如PD)的有希望的治疗手段；其中MSC-Exos与蛋白质部分一起构成重要的工具和治疗选择[67]。Mohamed Asmaa S等[68]选用40只雄性白化大鼠，分为对照组(Ⅰ组)、PD组(Ⅱ组)、PD-L-Dopa组(Ⅲ组)、PD-exosome组(Ⅳ组)，对脑组织进行运动测试、组织病理学检查和酪氨酸羟化酶免疫组化检测，探究骨髓MSCs-Exos对PD大鼠的影响，结果表明其对PD患者的神经退行性疾病抑制性增强，用于神经源性修复和功能恢复具有潜力。目前Exos工程方法会导致Exos形态和膜的损伤，无法满足疾病治疗的复杂需求。

综上，现多数研究致力探究PD的病理机制，探索有效的疾病修饰方法，利用MSCs-Exos内在的生物特性，运用到PD的临床治疗具有无限潜力。

5. 总结与展望

MSC-Exos在PD病理治疗中产生良好疗效，具有克服生物相容性、BBB穿透性、代谢稳定性、靶向特异性等优点，可作为药物载体发挥细胞通讯作用、传递治疗药物。研究表明，Exos纳米技术的快速发展给PD等神经系统疾病提供新的治疗策略，在PD的发生、发展、治疗中扮演重要角色。但Exos仍有许多问题需进一步探讨，例如Exos如何穿过BBB；同一细胞会分泌多少种不同的Exos；Exos包裹的物质如何被识别、卸载、靶向疾病，将其作为药物载体用于临床仍处于初期，我们应展望未来逐步探索解决上述临床中存在的问题，评估Exos安全性、有效性、副作用和诱发疾病等提高人类整体健康水平。伴随Exos纳米技术的进步，从细胞水平、实验动物逐渐过渡到大规模临床研究，进一步凸显MSC-Exos治疗PD的临床价值，为MSC-Exos应用提供科学的参考依据。

基金项目

国家级大学生创新训练项目(NO. 202313287018)；国家级大学生创新训练项目(NO. 202213287003)；大学生创新创业训练计划项目(2023CXCY98、2022CXCY22)。

NOTES

^*通讯作者。