HPLC法测定盐酸多奈哌齐原料药及有关物质含量

Determination of Donepezil Hydrochloride and Related Substances by HPLC

摘要: 目的：建立HPLC法同时测定盐酸多奈哌齐原料药中6个有关物质A、B、C、D、G、H。方法：采用NanoChrom C₁₈ (4.6 × 250 mm, 5 μm)色谱柱，以20 mmol/L乙酸铵水溶液为水相，以乙腈为有机相，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为35℃，检测波长为271 nm，进样体积为10 μL。结果：对照品盐酸多奈哌齐与6个有关物质的色谱峰均能有较好的分离，各成分线性关系良好。盐酸多奈哌齐有关物质相对校正因子分别为1.170、0.820、2.310、1.820、1.020、0.840，平均回收率分别为95.81%、97.46%、94.29%、105.4%、102.5%、94.18%。三批盐酸多奈哌齐原料药测定结果为最大单杂含量小于0.044%，最大总杂含量小于0.30%。结论：该方法灵敏度高，重复性好，专属性强，可区分不同批次盐酸多奈哌齐原料药的质量，可准确有效地测定盐酸多奈哌齐原料药中的有关物质。

Abstract: Objective: To establish an HPLC method for the simultaneous determination of 6 related substances A, B, C, D, G and H in Donepezil hydrochloride. Methods: NanoChrom C₁₈ (4.6 × 250 mm, 5 μm) column was used with 20 mmol/L ammonium acetate aqueous solution and acetonitrile as mobile phase at 1.0 mL/min flow rate. The column temperature was 35˚C, the detection wavelength was set at 271 nm, and the sample volume was 10 μL. Results: The chromatographic peaks of Donepezil hydrochloride and 6 related substances A, B, C, D, G and H were well separated. The control substance Donepezil hydrochloride and the related substances had a good linear relationship in the mass concentration range. The relative correction factors were 1.170, 0.820, 2.310, 1.820, 1.020 and 0.840. The average recoveries of related substances A, B, C, D, G and H were 95.81%, 97.46%, 94.29%, 105.4%, 102.5% and 94.18%, respectively. The results of three batches of Donepezil hydrochloride were that the maximum single impurity content was less than 0.044% and the maximum total impurity content was less than 0.30%. Conclusion: The method has high sensitivity, strong specificity and good repeatability. It can distinguish the quality of different batches of Donepezil hydrochloride, and can accurately and effectively determine the related substances in Donepezil hydrochloride.

1. 引言

阿尔兹海默症是一种以进行性认知功能障碍和记忆能力损害为特征的中枢神经系统退行性疾病[1]，多发于老年人。目前阿尔兹海默症尚无确切有效的治疗方法，临床上主要以药物来缓解和控制病情的进程，已上市的治疗药物主要包含胆碱酯酶抑制剂、抗氧化剂、促智药物、麦角生物碱等[2]。盐酸多奈哌齐(Donepezil Hydrochloride，(±)-2-[(1-苄基-4-哌啶基)甲基]-5,6-二甲氧基-1-茚酮盐酸盐)是由日本卫材制药公司开发的第二代乙酰胆碱酯酶抑制剂[3]，通过可逆非竞争性抑制乙酰胆碱酯酶，增加突触间隙中乙酰胆碱的浓度，起到治疗阿尔兹海默症的作用[4] [5]，具有使用剂量小、耐受性好且作用时间长等优势，多奈哌齐人体药动学试验显示，健康年轻受试者单剂量口服时半衰期可达50 h，多剂量口服时在2周后达到稳态；老年人t_1/2几乎延长2倍，T_max延长[6] [7]，是目前临床上的首选药物，与其它药物联合用药可提高对阿尔兹海默症的治疗效果[8]。

《中国人民共和国药典》2020年版(ChP2020)中规定盐酸多奈哌齐的存储条件为遮光、密封、阴凉处保存[9]，其存储条件较为苛刻，但未具体说明盐酸多奈哌齐的特定杂质，且未收载其特定杂质的标准，目前仅以单杂和总杂限度的标准进行控制有关物质检查项。《欧洲药典》11.0 (EP11.0) [10]和《美国药典》(USP)现行版[11]中均有收载盐酸多奈哌齐质量标准。目前已报道的盐酸多奈哌齐制剂质量控制研究主要包括其片剂、分散片、缓释片[12] [13] [14]，崩解片与美金刚等混合制剂等的含量测定[15] [16]及有关物质研究[17]。

盐酸多奈哌齐在国内外的使用量较大，用药的持续安全性与药物质量显得尤为重要，因此对其进行进一步的有关物质的研究极其重要，建立HPLC法测定盐酸多奈哌齐原料药与6种有关物质(图1)含量的测定方法，实现对盐酸多奈哌齐原料药有关物质进行准确、有效控制，从而有助于其原料药和相关制剂的质量控制和评价。

Figure 1. Structural formula of donepezil hydrochloride and impurities

图1. 盐酸多奈哌齐及杂质的结构

2. 仪器与试剂

2.1. 仪器

LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Waters e2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；UitiMate 3000高效液相色谱仪(美国电热公司)；KQ-500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SW23振荡水浴槽(德国Julabo公司)；S20K酸度计(梅特勒托利多科技有限公司)；MS205DU电子天平(梅特勒托利多科技有限公司)；KBF240恒温恒湿箱(德国BINDER公司)；UN110恒温干燥箱(德国Memmert公司)；Milli-Q Acsdemic超纯水仪(法国Millipore公司)。

2.2. 试剂试药

盐酸多奈哌齐原料药(迪嘉药业股份有限公司，批号：DE220802)；盐酸多奈哌齐对照品(批号：100650-201703)、盐酸多奈哌齐杂质A (批号：430059-202201)、盐酸多奈哌齐杂质B (批号：430072-202201)、盐酸多奈哌齐杂质C (批号：430074-202201)、盐酸多奈哌齐杂质D (批号：430069-202201)、盐酸多奈哌齐杂质G (批号：430075-202201)、盐酸多奈哌齐杂质H (批号：430073-202201)均购于中国食品药品检定研究院；乙腈(上海星可高纯溶剂有限公司，色谱级)；氢氧化钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分析纯)；乙酸铵(美国Acros Organics公司，分析纯)；乙酸(永华化学股份有限公司，分析纯)；硝酸、30% H₂O₂过氧化氢(广东广试试剂科技有限公司，分析纯)。

3. 方法与结果

3.1. 液相条件

NanoChrom C₁₈ (4.6 × 250 mm, 5 μm)色谱柱，柱温为35℃，流动相A为20 mmol/L乙酸铵水溶液(pH值用乙酸调至4.50)，流动相B为乙腈，梯度洗脱(表1)，流速1 mL/min，波长271 nm，进样量10 μL。

Table 1. Gradient elution program of liquid phase

表1. 液相梯度洗脱程序

时间/min	流动相A/%	流动相B/%
0	85	15
18	82	18
28	77	23
38	77	23
46	60	40
55	25	75
60	25	75
60.1	85	15
70	85	15

3.2. 溶液配制

稀释剂：乙腈–水(2:8, v:v)。

盐酸多奈哌齐供试品储备液：取盐酸多奈哌齐原料药，精密称定约2 g，置于200 mL量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

盐酸多奈哌齐供试品溶液：精密量取供试品储备液1 mL，置于10 mL量瓶，稀释至刻度后摇匀。

盐酸多奈哌齐对照品溶液：精密称取盐酸多奈哌齐对照品约20 mg，置于20 mL量瓶，稀释至刻度后摇匀。

杂质对照品储备液：分别精密称取杂质A、B、C、D、G、H对照品约1 mg，分别置于10 mL量瓶，稀释至刻度，摇匀，即为各杂质对照品储备液。

混合对照品溶液：分别精密量取各杂质对照品储备液1 mL，及盐酸多奈哌齐对照品溶液0.05 mL，置于10 mL量瓶，稀释至刻度后摇匀。

降解溶液的制备：氧化破坏，精密量取盐酸多奈哌齐供试品储备液1 mL置于试管中，加入30% H₂O₂溶液1 mL，60℃水浴加热2 h，冷却后置10 mL量瓶，稀释至刻度，摇匀。高温破坏，精密量取盐酸多奈哌齐供试品储备液1 mL置于试管中，100℃水浴加热60 min，冷却，置于量瓶，稀释后摇匀。高湿破坏，精密量取盐酸多奈哌齐供试品储备液1 mL置于试管中，置于恒温恒湿箱(55℃, RH 75%)中放置30 d天，置于量瓶，稀释后摇匀。酸破坏，精密量取盐酸多奈哌齐供试品储备液1 mL置于试管中，加入1 mol/L硝酸溶液1 mL，90℃水浴加热60 min，冷却，用等浓度的氢氧化钠溶液调pH至中性，置于量瓶，稀释后摇匀。碱破坏，精密量取盐酸多奈哌齐供试品储备液1 mL置于试管中，加入1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL，90℃水浴加热30 min，冷却，用等浓度的盐酸溶液调pH至中性，置于量瓶，稀释后摇匀。光照破坏，精密量取盐酸多奈哌齐供试品储备液1 mL置于试管中，置于光照箱(25℃, RH 25%)中白光照射(4500 ± 500 Lux) 30 d，置于量瓶，稀释后摇匀。

3.3. 系统适用性试验

精密量取0.01 mg/mL的混合对照品溶液10 μL注入岛津高效液相色谱仪，记录色图谱(图2)，结果显示，各杂质峰之间、且与主成分峰均可实现完全分离，分离度(R)大于1.5，其中杂质A与API的分离度为2.375。

3.4. 专属性试验

以稀释剂为空白溶液，制备未被破坏的盐酸多奈哌齐供试品溶液，记录各降解溶液色谱图(图2)，结果表明，在上述破坏降解条件下，盐酸多奈哌齐原料药对碱、高温和恒温恒湿较为稳定，在碱破坏下无特定杂质产生，高温破坏下产生了杂质C和D，恒温恒湿破坏下产生了杂质C，对氧化、酸和光照敏感，氧化破坏下产生杂质B、C、D、G、H，酸破坏下产生了杂质A、B、C、D、G，光照破坏下产生了杂质B、C、G、H。在该系统中，空白溶液、杂质峰、主成分峰均能完全分离，空白溶液无干扰，可有效测定各杂质的含量。

Figure 2. Chromatograms of donepezil hydrochloride and impurities

图2. 盐酸多奈哌齐及杂质在各降解样品中的色谱图

3.5. 线性关系、校正因子、检测限及定量限考察

精密量取盐酸多奈哌齐对照品溶液和各杂质对照品储备液，配制成系列对照品溶液。记录各峰面积，以质量浓度x (单位：µg/mL)为横坐标，峰面积y (单位：A/mAU)为纵坐标，计算各线性回归方程，各成分线性关系良好。用待测物对照品的质量浓度乘以内参物盐酸多奈哌齐峰面积，再除以内参物盐酸多奈哌齐的质量浓度和待测物对照品峰面积计算各待测物相对校正因子(RCF)，逐步稀释混合对照品溶液，以信噪比S/N ≥ 3时的质量浓度为检测限，S/N ≥ 10为定量限，结果见表2。

Table 2. Linear relationship, RCF, LOD and LOQ of donepezil hydrochloride and impurities

表2. 盐酸多奈哌齐和杂质的线性关系、RCF、检测限、定量限数据

化合物	回归方程	线性范围 (µg/mL)	r	RCF	检测限 (µg/mL)	定量限 (µg/mL)
盐酸多奈哌齐	y = 1.669 × 10^4x − 1.420 × 10^4	1.239~1996	1.000	1.000	0.5500	1.200
杂质A	y = 1.607 × 10^4x − 2.780 × 10^4	2.556~123.4	0.9998	1.170	0.5000	1.000
杂质B	y = 1.994 × 10^4x − 5.924 × 10^3	0.6342~100.1	0.9997	0.820	0.3000	0.7500
杂质C	y = 1.180 × 10^4x − 3.549 × 10^3	0.4536~40.22	0.9997	2.308	0.3000	0.950
杂质D	y = 1.011 × 10^4x − 1.230 × 10^4	1.527~174.6	0.9999	1.819	0.7000	1.300
杂质G	y = 1.488 × 10^4x − 6.766 × 10^3	0.7216~87.4	0.9999	1.019	0.2000	0.5500
杂质H	y = 1.954 × 10^4x − 1.154 × 10^2	0.1388~9.59	0.9999	0.840	0.3300	0.900

3.6. 精密度、重复性、稳定性

取0.01 mg/mL的混合对照品溶液，连续进样6次，记录色谱图，按各峰面积计算相对标准偏差(RSD)，各峰面积的RSD值均小于1.3%，方法精密度良好。平行制备6份氧化和酸破坏溶液，记录色谱图，以盐酸多奈哌齐原料药为对照，乘以各相对校正因子计算各物质的含量。6份盐酸多奈哌齐降解溶液中，盐酸多奈哌齐、杂质A、B、C、D、G、H的平均含量分别为482.8、9.21、17.24、0.6588、2.980、47.70和0.5424 µg/mL，RSD值均小于2.3%，方法重复性较为良好。取盐酸多奈哌齐对照品溶液和各杂质对照品溶液，考察室温放置0、6、12、24、48 h后杂质峰面积的变化，在48 h内，盐酸多奈哌齐、杂质A、B、C、D、G、H的峰面积RSD值均小于1.1%，盐酸多奈哌齐及各杂质在48 h内稳定。

3.7. 回收率

精密移取1 mL降解溶液置2 mL容量瓶中，分别精密加入杂质对照品储备液稀释成与降解溶液中特定杂质相同浓度的0.8、1.0和1.2 mL各6份，配制成80%、100%和120% (低、中、高) 3个浓度水平的回收率溶液。按各杂质外标法和校正因子法计算各份样品中加入的杂质的回收率，结果见表3，2种方法计算杂质回收率结果基本一致。

Table 3. The average recovery of Donepezil hydrochloride and impurities

表3. 盐酸多奈哌齐和有关物质的回收率

化合物	外标法				校正因子法
	平均回收率/% (n = 6)			RSD/% (n = 18)	平均回收率/% (n = 6)			RSD/% (n = 18)
	低浓度	中浓度	高浓度		低浓度	中浓度	高浓度
盐酸多奈哌齐	105.6	100.9	107.7	2.0	106.0	100.9	107.7	2.0
杂质A	105.3	102.0	103.3	1.1	93.24	94.69	99.49	1.4
杂质B	102.3	99.87	104.1	1.7	97.10	95.30	99.97	1.8
杂质C	92.98	104.9	103.2	2.1	90.58	96.69	95.61	1.9
杂质D	104.4	102.6	99.04	1.9	103.6	102.3	110.4	0.008
杂质G	99.58	94.05	102.3	1.5	105.1	103.8	98.55	1.1
杂质H	95.92	92.24	90.15	0.08	90.13	96.59	95.82	0.035

3.8. 耐用性

考察同一型号不同序列号的色谱柱(21538-004191、21538-004193及21538-004194)，不同型号的高效液相色谱仪(LC-20A、Waters e2695及UitiMate 3000)，流速(0.8、1.0及1.2 mL/min)，柱温(30、35及40℃)，取混合对照品溶液，各成分分离度，结果见表4，实验结果表示，柱温、流速对杂质A、B、C、D的保留时间(RRT)及分离度影响较大。因此，规定柱温35 ± 1℃、流速±0.05 mL/min以保证各峰的保留时间与试验标准的相对保留时间一致，3根不同批号的色谱柱各杂质峰的重现性均较好，不同型号的高效液相色谱仪各杂质峰的峰相对位置均一致。

Table 4. Results of separation degree of durability test

表4. 耐用性实验分离度结果

化合物	色谱柱			仪器			流速/(mL/min)			柱温/℃
	1	2	3	Waters	Shimadzu	Thermo	0.8	1.0	1.2	30	35	40
盐酸多奈哌齐	2.391	2.375	2.405	2.347	2.375	8.09	2.399	2.375	2.326	2.523	2.375	2.415
杂质A	22.79	22.93	23.18	26.21	22.93	20.22	26.10	22.93	24.45	23.81	22.93	21.99
杂质B	43.38	38.46	43.93	42.31	38.46	2.560	44.89	38.46	42.87	44.58	38.46	42.66
杂质C	14.40	14.34	13.88	15.98	14.34	9.43	12.99	14.34	16.75	14.70	14.34	15.48
杂质D	14.96	13.62	13.77	17.18	13.62	17.62	13.53	13.62	12.09	13.32	13.62	12.69
杂质G	7.471	7.624	7.620	8.23	7.624	7.198	7.918	7.624	12.28	8.16	7.624	11.01
杂质H	39.29	38.42	40.87	42.43	38.42	20.26	40.55	38.42	41.78	38.36	38.42	44.48

3.9. 样品测定

配制取3批盐酸多奈哌齐供试品溶液和各降解溶液，按校正因子法计算各杂质含量(见表5)，结果表明，传统采用最大单杂作为限度标准过于局限，采用校正因子法计算更为准确，在原料药中，仅检测出杂质C，且含量均小于0.03%，其他杂质均未检出，符合药典规定，可用于杂质控制。在各强制降解样品中可发现氧化、酸破坏易造成多奈哌齐的降解，其降解产物占比最高为杂质G，为吡啶环上N位氧化结合O原子。在氧化破坏中，占比高达60%，酸破坏中约42%。其次，酸破坏所产生较多的杂质B为连接在哌啶的氮上苄基基团丢失，占比超15%。

Table 5. Results of determination of donepezil hydrochloride impurities (%)

表5. 盐酸多奈哌齐杂质的含量测定(%)

杂质	API			强制降解
	第一批	第二批	第三批	氧化	酸	碱	高温	高湿	光照
杂质A	/	/	/	/	8.66	/	/	/	/
杂质B	/	/	/	2.92	16.21	/	/	/	2.85
杂质C	0.021	0.026	0.019	0.29	0.42	/	0.21	0.19	0.18
杂质D	/	/	/	0.26	1.96	/	0.44	/	/
杂质G	/	/	/	60.68	41.65	/	/	/	1.57
杂质H	/	/	/	0.88	/	/	/	/	0.18

4. 讨论

实验中考察了水、不同比例乙腈(20%、40%、80%、100%)水溶液对降解溶液的影响，发现盐酸多奈哌齐及杂质在乙腈–水(2:8, v:v)中的峰信号响应最高且溶解度更好。流动相分别考察了甲酸、乙酸、甲酸铵和乙酸铵缓冲盐与乙腈的体系，以及10、15、20和25 mmol/L乙酸铵水溶液，结果显示盐酸多奈哌齐及各杂质在20 mmol/L乙酸铵–乙腈体系中的分离度较好，改善峰对称性；考察pH 4.3、4.5、4.7条件下对降解分离的影响，结果pH为4.5时主峰与相邻杂质的分离度较好。在230、271和316 nm处，盐酸多奈哌齐有最大吸收峰，而杂质峰主要在271 nm波长处出现，峰形良好，基线稳定，故选择271 nm为检测波长。采用高效液相色谱法，以梯度洗脱方法、以主成分自身对照法可有效测定盐酸多奈哌齐原料中的有关物质，方法简便、可靠。

杂质A在酸破坏条件下产生，杂质B在酸破坏、氧化破坏和光照条件下均有产生，杂质C在恒温恒湿破坏、高温破坏、酸性破坏、氧化破坏和光照破坏条件下均有产生，杂质D在高温破坏、酸性破坏和氧化破坏条件下均匀产生，杂质G在酸性破坏、氧化破坏和光照破坏条件下均有产生，杂质H在氧化破坏和光照破坏条件下均有产生。由上述杂质产生的条件情况可知，在碱环境、高温、高湿条件下产生的杂质较少，但在酸、氧化和光照条件下产生的杂质较多，应引起重视，杂质C在三批原料药含量测定时均有出现，应重点关注。在进行处方筛选时，要注意辅料的性质，应避免药物与具有酸性或氧化性的辅料发生相互作用；在工艺设计时，要注意药物在进行压片时会因挤压产生瞬时高温[18]，且控制在适宜的温湿度范围内，也需考虑辅料和包材的相容性。储存时，应避免长时间在空气中敞开放置，且要在遮光、阴凉条件下储存，而临床配伍使用时，同样需要避免药物间的相互作用导致的活性成分降解。

5. 结论

本文建立了HPLC法测定盐酸多奈哌齐原料药及有关物质，通过方法学验证，表明该方法灵敏度高，专属性强，可有效地同时盐酸多奈哌齐及其6种有关物质A、B、C、D、G、H，为完善和统一现行众多的国家标准提供支持，可用于盐酸多奈哌齐原料药及其制剂的质量控制，为盐酸多奈哌齐系列的品种质量标准提高提供重要依据，对其有关物质进行准确地定性、定量分析至关重要，为工艺研究、质量研究以及质量标准的制定奠定了一定的基础，也可为盐酸多奈哌齐原料药的贮藏、制剂工艺及临床配伍使用提供参考依据。

基金项目

国家“重大新药创制”科技重大专项(No. 2017zx09101001/03/04)，国家药品监督管理局药品审评检查大湾区分中心监管科学课题(GBA-JGKX-001)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。