基于生物信息学分析慢性阻塞性肺疾病中铁死亡相关生物标志物

Bioinformatics-Based Analysis of Ferroptosis-Related Biomarkers in Chronic Obstructive Pulmonary Disease

摘要: 目的：基于生物信息学分析慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)与铁死亡的功能富集通路以及关键基因，为COPD的预防和诊断提供新的方向。方法：通过GEO数据库获得COPD相关数据集GSE76925，筛选正常组织样本和COPD组织样本差异表达基因，从FerrDb下载铁死亡相关基因集，提取铁死亡相关基因在GSE76925数据集中的表达矩阵，获得铁死亡相关的差异表达基因，对差异基因进行GO和KEGG富集分析。通过SVM-RFE和LASSO确定COPD的特征基因，并绘制ROC曲线和计算AUC来评估特征基因的诊断效果。使用CIBERSORT对肿瘤微环境中的免疫细胞进行评估，并评估特征基因与免疫细胞浸润之间的关系。结果：得到4个铁死亡相关特征基因，NOX4、FBXW7、TIMM9、ARF6，ROC结果均显示出良好的诊断价值。特征基因与M0巨噬细胞、肥大细胞、浆细胞、树突状细胞等显著相关。结论：得到的4个关键基因NOX4、FBXW7、TIMM9、ARF6为COPD发病机制以及预防诊断提供新思路，从而指导疾病临床治疗。

Abstract: Objective: Bioinformatics-based analyses of functional enrichment pathways and key genes in chronic obstructive pulmonary disease and ferroptosis to provide new directions for COPD prevention and diagnosis. Methods: The COPD-related dataset GSE76925 was obtained from the GEO database, normal tissue samples and COPD tissue samples were screened for differentially expressed genes, the ferroptosis-related gene set was downloaded from FerrDb, and the expression matrices of the ferroptosis-related genes in the GSE76925 dataset were extracted to obtain the ferroptosis-related differentially expressed genes, and the differential genes were subjected to GO and KEGG enrichment Analysis. The signature genes of COPD were identified by SVM-RFE and LASSO, and the diagnostic efficacy of the signature genes was assessed by plotting ROC curves and AUC. Assessment of immune cells in the tumor microenvironment using CIBERSORT and characterization of the relationship between genes and immune cell infiltration. Results: Four ferroptosis-related signature genes, NOX4, FBXW7, TIMM9, and ARF6, were obtained and the ROC results showed good diagnostic value. Characterized genes were significantly associated with M0 macrophages, mast cells, plasma cells and dendritic cells. Conclusions: The four key genes obtained, NOX4, FBXW7, TIMM9, and ARF6, provide new ideas for COPD pathogenesis as well as preventive diagnosis, thus guiding clinical treatment of the disease.

1. 前言

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)，是由于吸烟、长期接触刺激性气体或有毒颗粒等引起的慢性气道炎症性疾病[1]，是世界第三大死亡原因。最新的研究数据表明，全世界有超过3亿人受到COPD的影响，随着环境污染、人口老龄化等问题的日趋严重，COPD发病率和死亡率逐年增加，给社会及经济造成严重负担[2]。COPD以慢性咳嗽、咳痰、气短或呼吸困难、喘息和胸闷为主要症状[3]，部分患者伴有呼吸衰竭、气胸、骨骼肌功能障碍、情绪异常等并发症[4]，严重危害人们的身体健康及生活质量。COPD的发病机制与许多因素有关[5]，如气道肺部炎症、氧化应激、气道重朔及气道黏液高分泌等[6]，但目前为止其具体发病机制尚不明确，故急需探索COPD的发病机制，明确影响COPD发展的因素，提供针对性治疗方法。

铁死亡是区别于传统的凋亡、坏死的程序性细胞死亡方式，是一种铁依赖性的、以细胞膜脂质过氧化产物的积累为主要特征的细胞死亡。其本质为细胞内铁离子的蓄积[7]，进一步加剧了脂质过氧化损伤，引起细胞膜破裂、细胞死亡[8] [9]。铁依赖的细胞死亡过程可导致线粒体的结构改变[10] [11]，表现为线粒体膜电位改变、线粒体收缩、线粒体嵴减少乃至消失[12]，同时伴随着抗氧化物质谷胱甘肽(glutathione, GSH)的耗竭，以及脂质活性氧(reactive oxygen species, ROS)的升高[13]。越来越多的证据表明，铁死亡在炎症和免疫疾病的发生发展中起关键作用[14]-[16]，其可释放炎症相关的损伤因子，并激活体内的免疫系统，诱导炎症反应参与了多种疾病的发病过程。虽然COPD的发病机制尚不完全清楚，但研究表明铁死亡在COPD的发病中起着重要作用。本研究拟通过生物信息学方法，从GEO数据库中下载相关COPD数据集，识别并验证铁死亡相关生物标志物，为COPD的预防和诊断提供新的方向。

2. 材料与方法

2.1. 数据收集

从基因表达总库(GEO)中收集正常样本及COPD样本信息，选取GSE76925数据集作为训练队列，其中有111个COPD样本、40个正常样本(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。本研究中使用的铁死亡相关基因(FRGs)下载于铁死亡基因数据库(FerrDb: http://www.zhounan.org/ferrdb/current/)。

2.2. 差异基因的提取与分析

从GSE76925中获得了正常样本及COPD样本中基因的表达数据。将下载的铁死亡相关基因与样本中的基因取交集，获得铁死亡相关基因的表达矩阵，对铁死亡相关基因进行差异表达筛选，筛选标准为P < 0.05。

2.3. 功能富集分析

使用了R语言软件包V4.2.0对差异富集的基因进行基因本体(GO)和KEGG富集分析，P < 0.05被认为结果具有统计学意义。

2.4. 识别COPD的特征基因

利用支持向量机递归特征消除(SVM-RFE)和最小绝对收缩年龄与选择算子(LASSO)确定了COPD的最佳特征基因。LASSO回归算法通过正则化提高预测准确性，使用“glmnet”Rpackage实现。用SVM软件包建立SVM-RFE模型，并使用平均误判率进行10倍交叉验证。这两种算法所揭示的重叠生物标志物被确定为COPD的最佳特征基因。通过绘制接收者操作特征曲线(ROC)和计算曲线下面积(AUC)来评估最佳标记基因的诊断效果。同时，利用“glm”R软件包建立了包含所有特征基因的逻辑回归模型，以区分GSE76925中的COPD样本和正常样本。ROC曲线用于评估该逻辑回归模型的诊断能力。

2.5. 免疫细胞浸润分析

在GSE76925数据集中，使用CIBERSORT对肿瘤微环境中的免疫细胞进行了评估。CIBERSORT确定的22种浸润免疫细胞的比例之和为1。分析生物标志物与免疫细胞浸润之间的关系。

2.6. 统计分析

所有样本的基因表达水平均在R V4.2.0 (https://www.r-project.org/)进行比较。所有统计分析和Venn图均使用R软件包进行。

3. 结果

3.1. FR-DEGs的鉴定

从GEO数据库下载GSE76925数据集，其中包含来自111个COPD样本和40个健康人类样本的数据。从FerrdB获得了728个与铁死亡有关的调节因子、标志物和疾病的数据库。然后，将GSE76925数据集和与铁死亡相关的基因FRGs进行了取交集，使用limma包进行差异表达分析，发现共有164个铁死亡相关的差异基因(P < 0.05)，与正常肺组织相比，其中111个基因上调，53个基因下调，如热图所示(图1)。

Figure 1. Heat map of differential genes

图1. 差异基因热图

3.2. 功能富集分析

对164个铁死亡相关差异基因进行GO和KEGG通路富集生信分析。GO生信分析结果表明，COPD组中的这些高表达基因主要与氧化应激、化学损伤、细胞代谢过程、DNA活化的转录因子结合等过程有关(图2(a))。差异基因的KEGG通路分析，基因主要富集在氧化应激、化学损伤、前提代谢物与能量的生成过程、自噬、脂肪酸代谢过程、凋亡信号通路等过程有关(图2(b))。

3.3. 特征基因的筛选和验证

基于这164个铁死亡相关差异基因实施了两种不同的算法。根据LASSO系数曲线图(图3(a))以及最佳调谐参数选择图(图3(b))，筛选出19个具有非零系数的特征基因。随后，使用SVM-RFE算法鉴定了11个差异基因(图3(c)，图3(d))。对这两种算法得到的差异基因取交集，得到4个特征基因，分别为NOX4，FBXW7、TIMM9、ARF6 (图4(a))。为进一步检验上述基因的诊断效能，通过R软件进行ROC分析预测生物标志物的诊断有效性，结果表明，四种潜在生物标志物均显示出良好的诊断价值，NOX4的AUC为0.622，FBXW7的AUC为0.656，TIMM9的AUC为0.757，ARF6的AUC为0.742 (图4(b))。通过R软件进行ROC分析，评估该逻辑回归模型的诊断能力，结果表明，该模型的AUC为0.816，具有很好的诊断效能(图4(c))。

3.4. 免疫细胞浸润及其与特征基因的关系

采用CIBERSORT算法对上述正常和COPD样本中免疫细胞的浸润情况进行分析，绘制了22个免疫细胞比例的结果图，其中蓝色代表正常样本，红色代表COPD样本。如图所示，COPD样本中T细胞CD48、滤泡辅助性T细胞、γδT细胞以及M0巨噬细胞的比例明显高于对照组；而CD4⁺记忆性T细胞、单核细胞的比例则显著低于对照组(图5)。随后，评估了4种生物标志物与免疫细胞的相关性。结果显示，TIMM9与M0巨噬细胞呈显著负相关；NOX4与活化的肥大细胞呈显著负相关、与浆细胞及静息态肥大细胞呈显著正相关；FBXW7与浆细胞呈显著正相关；ARF6与静息态树突状细胞及T细胞CD8呈显著负相关、与活化的树突状细胞及T细胞CD4记忆细胞呈显著正相关(图6)。

Figure 2. Differential gene GO and KEGG analysis

图2. 差异基因GO与KEGG分析

Figure 3. Identification of signature genes

图3. 特征基因的鉴别

Figure 4. ROC curves for signature genes and diagnostic models

图4. 特征基因及诊断模型的ROC曲线

Figure 5. Immune cell infiltration analysis

图5. 免疫细胞浸润分析

4. 讨论

铁死亡是由Dixon等人首次发现的程序性细胞死亡方式，它参与生物体个体发育的各个阶段，包括细胞的衰老进程、组织稳态的动态平衡以及免疫功能的调节等。铁死亡不仅可维持机体的正常生理功能[17]，也是多种疾病发生发展的重要环节。在多种病理条件及疾病中，细胞死亡的调控往往处于失衡状态[18]。以往研究将细胞死亡分为两大类：程序性细胞死亡及非程序性细胞死亡[19] [20]。程序性细胞死亡包括凋亡、自噬、焦亡等，其发生过程受特定基因的调控，维持内环境的稳态与平衡[21]。而病理条件下的细胞死亡如坏死则认为是非调控的，由物理或化学损伤等刺激引起，往往伴随着免疫应答及炎症反应[14]。大量研究表明铁死亡在多种系统疾病的进展中发挥关键作用，如神经退行性病变、急性肾功能衰竭、心肌梗死、脑卒中以及肿瘤的生长及扩散[8] [11] [13] [14] [16] [22] [23]。此外，近期的研究表明铁死亡与多种呼吸系统疾病如COPD、肺癌、肺纤维化、急性肺损伤的发生发展密切相关[24]。

Figure 6. The relationship between biomarkers and immune cells

图6. 生物标志物与免疫细胞的关系

本研究从GEO数据库及铁死亡基因库中分别下载GSE76925数据集、铁死亡相关基因，并对其进行差异基因的表达分析，绘制铁死亡相关差异基因的表达热图。并对这些差异基因进行GO和KEGG富集分析，发现这些高表达基因主要与氧化应激、化学损伤、细胞代谢过程、DNA活化的转录因子结合等过程有关。随后，通过SVM-RFE算法鉴定了11个差异基因、LASSO算法得到19个差异基因，对这两种算法得到的差异基因取交集，得到4个特征基因，分别为NOX4，FBXW7、TIMM9、ARF6；通过R软件进行ROC分析结果显示四种潜在生物标志物均显示出良好的诊断价值。同时，该诊断模型的ROC分析结果也表明此模型具有一定的诊断效能。免疫细胞的浸润情况分析结果显示COPD样本中T细胞CD48、滤泡辅助性T细胞、γδT细胞以及M0巨噬细胞的比例明显高于对照组。且TIMM9与M0巨噬细胞呈显著负相关；NOX4与活化的肥大细胞呈显著负相关、与浆细胞及静息态肥大细胞呈显著正相关；FBXW7与浆细胞呈显著正相关；ARF6与静息态树突状细胞及T细胞CD8呈显著负相关、与活化的树突状细胞及T细胞CD4记忆细胞呈显著正相关。上述研究结果提示NOX4，FBXW7、TIMM9、ARF6可能在预测和诊断COPD中发挥作用，在未来的研究中，功能将在细胞水平上得到进一步验证。

5. 结论

综上所述，本研究基于生物信息学对铁死亡以及COPD相关数据集进行分析，得到GO及KEGG相关的作用机制及通路；并对铁死亡相关基因进一步筛选，得到4个关键基因，并对其这4个关键基因进行了诊断效能的验证以及免疫浸润的关联分析，初步探索COPD的发生机制，此结果有助于为COPD的发病机制以及与预防诊断的研究提供新方向。然而，本研究仍缺乏COPD相关的基础实验验证，后续的应结合临床样本及细胞动物实验进行验证。

NOTES

^*通讯作者。