1. 引言
主动脉夹层是常见的危及生命的疾病[1]。不幸的是,没有特异性的预测诊断工具以及用于临床实践的药物可预防AD进展。因此,仍需要研究其发病机制及潜在治疗方法。以马凡综合症为代表的AD属于遗传性疾病[2],而自发性发病的则属于散发性,且具有年龄、性别、吸烟[3] [4]、高血压及血脂紊乱等特征。遗传与散发型AD共有病理特点,表现为VSMCs损伤丢失,弹性纤维破坏,炎症因子分泌增多,最终引起主动脉壁弱化,主动脉扩张,夹层破裂。了解主动脉变性的分子机制,包括细胞凋亡途径在这一过程中的潜在作用,为预防治疗方面奠定一定的理论基础。
有研究使用非靶向代谢组学和质谱法分别测定发现血浆代谢物琥珀酸在主动脉夹层与主动脉瘤组中升高,可以作为生物标志物,及潜在治疗靶点[5]。另外一项研究表明TMAO可以作为AD的辅助诊断生物标志物[6]。其他研究显示鞘氨酸、植物鞘氨酸和神经酰胺在Stanford A型与Stanford B型AD中含量差异有统计学意义,可以作为生物标志物区分A与B型AD [7]。既往研究中,丙酮酸是体内产生的三碳酮酸,它是糖酵解途径的最终产物,丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用[8],有抗氧化作用[9]。在本研究中我们选取人血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC),用血管紧张素II (Angiotensin II, Ang II)干预刺激细胞建立VSMC损伤模型,用不同浓度的特异性代谢物丙酮酸干预损伤细胞,再通过CCK8、TUNEL及流式等实验检测细胞凋亡情况。旨在探索血浆代谢物丙酮酸对血管平滑肌细胞的凋亡作用。
2. 实验方法
2.1. 细胞培养
人血管平滑肌细胞(VSMC)置于DMEM培养基(含10%胎牛血清、双抗),在条件为37℃、5% CO2恒温箱中常规培养。胰酶消化、传代,采用3~8代细胞进行实验。
2.2. 检测细胞增殖及活力实验
利用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8, CCK8) (上海碧云天生物技术公司)对VSMCs的增殖和活性进行评价。操作如下:先将对数增长的细胞均匀的铺到96孔板中,置于37度恒温培养箱培养。当细胞完全贴壁,且成对数增长状态时用不同浓度的Ang II和丙酮酸(Pyruvic Acid, PA)处理细胞。24小时后,加入CCK-8溶液,37℃避光孵育1小时30分钟。再用酶标仪测量吸光度,计算细胞增殖能力。
2.3. TUNEL检测平滑肌细胞细胞凋亡
利用细胞凋亡试剂盒(TdT mediated dUTP Nick End Labeling, TUNEL) (上海碧云天生物技术公司)对VSMCs凋亡进行检测评估。操作如下:将对数增长的细胞均匀铺于24孔板中,贴壁良好后用PA处理,清洗细胞后用4%多聚甲醛固定细胞30分钟,清洗一次。然后加入含有0.3% TritonX-100的PBS,在室温下孵育5 min。再将50 µl TUNEL测定溶液加入到样本中,避光于37℃下培养60 min,封片,在荧光显微镜下进行观测。
2.4. 流式检测平滑肌细胞凋亡
利用PE Annexin V细胞凋亡检测试剂盒(美国BD Pharmingen公司)对VSMCs凋亡进行进一步检测评估。操作如下:对数增长的细胞均匀的铺到6孔板中,用PA处理,增殖到足够浓度后移到15毫升离心管中以1600转/分离心4分钟然后去除上清液。再加冷的PBS,离心去掉上清液,此过程重复2遍。用100 ul 1×结合缓冲液重悬细胞,在显微镜下进行计数。各离心管内样品的数量到达106个单位/毫升。取上述100 ul液体加到15 ml离心管底部。双染管中避光添加5 ul PE + 5 ul 7-ADD (单染管与双染管类似,只是分别分开添加PE、7-ADD各5 ul),轻轻吹打,静置15 min。每一个离心管中加400 ul 1×结合缓冲液,再用滤网过滤液体到5 ml流式管中。1小时内上流式分析仪进行检测分析。结果用FlowJo_V10统计学处理。
2.5. 统计方法
将所得资料以均值 ± 标准差表达,以独立样本t检验进行组间对比,多组之间进行ANOVA分析,以P < 0.05为显著性。本研究使用Graph Pad Prism 9及SPSS27.0对上述资料进行处理。
3. 结果
3.1. 丙酮酸对细胞活力的影响
为了在细胞水平阐明丙酮酸对主动脉夹层的影响机制,我们模拟体内丙酮酸作用于主动脉平滑肌,而培养了人主动脉平滑肌细胞(HVSCM)。我们先用不同浓度(10 nmol/L、100 nmol/L、1 umol/L、10 umol/L、100 umol/L)的血管紧张素II (Ang II)干预已经贴壁良好的细胞,24小时后,试图得到一个既能导致细胞活力下降且不至于导致细胞大量死亡的一个状态。我们再用不同浓度(0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、3.5 mmol/L、5 mmol/L)的丙酮酸(PA)干预贴壁良好的细胞24小时。以上2种化合物干预之后均用CCK8试剂盒检测细胞活力,其结果如下图(图1),随着Ang II干预浓度增加细胞活力下降,当Ang II浓度为1 uM时细胞活力下降,但也有一部分细胞活力正常。丙酮酸在一定的浓度范围内对血管平滑肌细胞活力影响很小。Ang II干预血管平滑肌细胞后以不同浓度丙酮酸干预发现:丙酮酸浓度为2 mM可以恢复Ang II抑制细胞活力。
3.2. TUNEL试剂盒检测丙酮酸对细胞凋亡的影响
通过TUNEL试剂盒处理后得到染成红色荧光的凋亡细胞,阴性对照为蓝色荧光是DAPI所染的细胞核。阴性对照control组细胞状态良好,呈正常的梭形,背景清晰。Ang II处理的细胞出现了较多的凋亡细胞,呈现萎缩变圆,细胞失去了正常形态。而Ang II与PA同时处理细胞时,也出现凋亡细胞,但是数目较Ang II单独处理少(图2)。
A:Ang II 5种浓度干预细胞;B:Ang II浓度范围缩小为3种干预细胞,最终采用浓度1 uM;C:PA 5种浓度干预细胞;D:PA浓度范围缩小为3种,且与1 uM Ang II同时干预;E:1 uM Ang II与2 mM PA同时干预细胞。(*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001)。
Figure 1. Histogram of CCK8 test results
图1. CCK8检测结果柱状图
A:TUNUL法检测不同处理组,VSMC细胞凋亡荧光显微镜图片;B:不同处理组VSMC细胞凋亡数分析柱状图(*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001)。
Figure 2. TUNEL detection of cell apoptosis
图2. TUNEL检测细胞凋亡
Q1:(AnnexinV-FITC)-/PI+,此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中,甚至机械损伤的细胞也包含其中;Q2:(AnnexinV+FITC)+/PI+,此区域的细胞为晚期凋亡细胞;Q3:(AnnexinV-FITC)+/PI-,此区域的细胞为早期凋亡细胞;Q4:(AnnexinV-FITC)-/PI-,此区域的细胞为活细胞(*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001)。
Figure 3. Flow cytometry detection of cell apoptosis
图3. 流式分析仪检测细胞凋亡
3.3. 流式分析仪检测丙酮酸对细胞凋亡的影响
为了进一步明确丙酮酸对细胞凋亡的影响,我们分别设立空白对照组、Ang II组及Ang II + PA组,用流式分析仪检测细胞凋亡情况。结果如图3。得出,与对照组相比Ang II组平滑肌细胞凋亡率(%)增加(14.03 ± 0.05 vs 29.67 ± 0.03, P = 0.002)。Ang II + PA与Ang II组相比,细胞凋亡率(%)减少(29.67 ± 0.03 vs 19.69 ± 0.08, P = 0.013)。这些结果提示丙酮酸抑制平滑肌细胞凋亡。
4. 讨论
主动脉夹层其发生机理与遗传因素、血液动力学和分子生物学,以及免疫炎症等多方面共同作用。病理变化过程主要有血栓形成、细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)的降解、免疫炎症反应、VSMC凋亡及表型转换出现异常等[10]-[12]。
细胞凋亡已被提出参与AD发生发展过程中应激诱导的SMC损伤[13]。我们的研究发现不同浓度的PA对细胞活力的影响不同,PA干预受损细胞之后,细胞呈现活力恢复趋势。丙酮酸(2 mmol/L)干预受损细胞模型,可以在一定程度上恢复细胞凋亡。
PA是一种重要的有机小分子,也是一种很弱的有机酸。PA既具有羧酸和酮的性质,又具有α-酮酸的性质。PA是最简单的α-酮酸,属于羰基酸。PA也是体内产生的三碳酮酸,它是糖酵解途径的最终产物,在细胞浆中还原成乳酸供能,或进入线粒体内氧化生成乙酰辅酶A,进入三羧酸循环,被氧化成二氧化碳和水,完成葡萄糖的有氧氧化供能过程。因此,PA是糖代谢中具有关键作用的中间产物。PA可通过乙酰辅酶A和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化,因此,PA在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用[8] [9]。PA除了在三大营养物质代谢方面起重要作用外,在抗氧化方面也起着关键作用[9]。
在本研究中我们应用Ang II诱导VSMC细胞凋亡,然后再用丙酮酸干预细胞,结果细胞凋亡减少,说明丙酮酸(PA)可以抑制细胞凋亡。PA是三羧酸循环的重要组成部分,它是由磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenol pyruvate, PEP)在丙酮酸激酶催化作用下产生的。当细胞内PA增加时催化其所需的丙酮酸激酶可能相应也增加,那么丙酮酸激酶上游丙酮酸激酶激动剂M2 (pyruvate kinase M2, PKM2)也处在较高水平。有一项研究阐明我们分析了急性胸主动脉夹层患者(TAAD)和β-氨基丙腈富马酸盐(BAPN)诱导的TAAD小鼠模型的主动脉组织中,观察到主动脉病变中PKM 2水平升高。用PKM 2激活剂TEPP-46治疗显著减弱了小鼠模型中TAAD的进展,如降低了发病率和主动脉的管腔直径来证明的[14]。此外,当用TEPP-46处理时,BAPN诱导的小鼠的胸部肿块显示单核细胞和巨噬细胞浸润减少,IL-1β、MMP和ROS水平降低。此外,TEPP-46处理还通过下调p-STAT 3和HIF 1-α抑制NOD样受体(NLR)家族和含pyrin结构域蛋白3(NLRP 3)炎性体的活化[14]。以上其他研究中得出PKM2激活剂TEPP-46增加降低胸主动脉夹层的发生发展,所以本部分研究中得出PA抑制细胞凋亡可能也是类似机制所致。
5. 结论
综上所述,丙酮酸作为三羧酸循环的重要产物,其抑制细胞凋亡可能与其抗氧化、抗炎、提供能量等特性有关。丙酮酸恢复Ang II干预损伤的血管平滑肌细胞活力。丙酮酸抑制Ang II干预的血管平滑肌细胞进一步凋亡,并有望成为潜在的Stanford B型AD治疗靶点。
基金项目
新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2022D01D66);新疆维吾尔自治区重点研发任务专项(2022B03022-3)。
NOTES
*通讯作者。