1. 引言
由于简化作物结构和精耕细作为基础的过度集约耕作，以及为了获得最高产量而过度使用化肥和农药保护作物，破坏了土壤的生物平衡[1]。因此，减少化学品的使用量，寻求部分可替代化肥、农药等化学品在农业生产上的应用，实现绿色安全生产是目前亟待解决的问题。
浒苔隶属于绿藻门(Chlorophyta)石莼目(Ulvales)石纯科(Ulvaceae)浒苔属(Enteromorpha)，是一种适应力强、繁殖快、广温、广盐、耐酸的大型的天然经济绿藻，而全球变暖、海水升温等诸多因素为浒苔的生长提供了有利条件，导致浒苔危害频繁爆发，多个拥有海岸线的国家均出现了不同程度的绿潮侵袭[2]。浒苔虽然无毒，但大量繁殖会导致海底动植物因缺氧而死，且其他海洋生物受到浒苔分泌的化学物质的不利影响，腐烂后的浒苔藻体还会散发出恶臭，严重影响周边地区居民正常的生活。同时，浒苔爆发后需大量人力物力打捞，据统计，打捞上来的浒苔超过60%被直接填埋，难以发挥其生物价值，造成这一有效海藻资源的浪费[3]。
有研究表明海藻生物肥可以改善土壤性质。如通过根部浇灌，海藻肥中的海藻多糖–褐藻胶可作为天然的土壤改良剂，具有较强的螯合能力，能与重金属离子形成螯合物，还具有凝胶保水的作用。海藻提取物提高土壤中有效促生长因子的持久性及利用率，提高团粒状结构的形成，改善土壤内部空隙，提高土壤的吸水锁水率和通透性，协调土壤中固体、液体和气体三种物质的比例，平衡土壤的天然胶体，增加土壤中有机质的含量[4]。张蕊等[5]研究结果表明，施用海藻肥可明显提高土壤有机质、有效钾、有效氮、有效磷的含量。土壤酶能够表征土壤环境质量，可以极为敏感反映土壤环境的微小变化。王秀梅等[6]研究发现海藻肥能够增强土壤中蔗糖酶的活性，但对磷酸酶活性影响不大。有研究表明，马尾藻肥料可以影响蛋白酶活性、多酚氧化酶活性和脲酶活性等酶活性，增加了细菌多样性和丰富度，进而促进番茄生长[7]。海藻肥可以直接改善土壤理化性质，提高土壤有机质、速效磷、碱解氮、速效钾含量，调节土壤中的C/N比值，改良土壤结构，改善土壤微生物环境，增加根际细菌群落多样性，可以使土壤养分供应更加协调[8]。
近年来，海藻生物肥作为其中一种新兴的生物肥料的开发研究引起了国内外有关学者的广泛关注，目前生产中海藻生物肥料的原料大都是褐藻门的马尾藻属(Sargassum spp.)和海带属(Laminaria)，而对大型绿藻类海藻–浒苔的开发应用研究较少。因此，如何有效实现浒苔资源的利用已成为海藻综合利用和改善生态环境的重要课题。故有必要开发一种广泛可用的方法，将海洋生物质废物转化为高价值产品。
本文以浒苔为主要原料，以其他中草药为辅佐材料，通过微生物发酵工艺制备的发酵液，研究浒苔发酵液及其复合液对土壤性质和土壤酶活性的影响，为新型土壤改良剂提供新品种提供理论基础。同时，实现了有害绿潮藻类的资源化利用，对保护生态环境实现可持续发展具有重要的现实意义。
2. 材料与方法
2.1. 供试材料
(1) 试验材料
①供试蔬菜作物品种：供试番茄品种为矮生红番茄，购自语桐种苗园艺；
②供试植物种类：浒苔粉剂由上海海洋大学水域环境生态工程研究中心提供；丁香、菊花、金银花购自药材店；蟛蜞菊在厦门地区野外采集；
③化学药剂：41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂(拜尔股份公司生产)。
(2) 试验生物制剂材料
①枯草芽孢杆菌(山东苏柯汉生物工程股份有限公司，有效菌数为200亿cfu/g)；
②微生物菌剂(沃宝生物科技，主要菌种有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、淡紫拟青霉、绿色木霉、凝结芽孢杆菌，有效活菌数 ≥ 100亿/g)；
③纤维素酶(正宏生物科技有限公司)；
④果胶酶(正宏生物科技有限公司)；
⑤面包改良剂(师傅300复配面包酶制剂)。
2.2. 试验方法
2.2.1. 发酵液的制备
发酵液配方为：1 kg植物干粉末，30 g面包改良剂，2 g枯草芽孢杆菌，10 g微生物菌剂，2 g纤维素酶，8 g果胶酶。与15 L水混合均匀，将混合物装入塑料桶中发酵，发酵起始温度为30℃~40℃，发酵时间30 d~50 d，后得到67 mg/mL的植物发酵液。
2.2.2. 发酵液盆栽试验
将矮生红番茄苗定植到填装沙壤土(田园土:沙 = 7:3)的盆中，每盆沙壤土1 kg，试验共设5个处理组，利用氟吡菌胺作为阳性对照，两个对照组：T6作阳性对照，T7作空白对照，具体见表1，发酵液的母液浓度均为67 mg/mL。并利用LC-MS分析了浒苔发酵液的化学成分。
每个花盆每次施肥100 ml，混合肥是以4:1将浒苔发酵液和中草药发酵液混合均匀之后对植物进行根部施肥。每个处理3次重复，每次重复4盆，每盆种植一株番茄。待番茄缓苗成功后，浇灌上述处理组和对照组，开始正常的水肥管理，即10 d浇一次肥，2 d浇一次水。70 d后，采土壤进行检测。
Table 1. Experimental groups
表1. 7个实验组
处理 |
发酵液 |
T1 |
浒苔 |
T2 |
浒苔 + 蟛蜞菊 |
T3 |
浒苔 + 金银花 |
T4 |
浒苔 + 菊花 |
T5 |
浒苔 + 丁香 |
T6 |
41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂(0.03 mL/株) |
T7 |
曝氧自来水 |
2.2.3. 土壤基础性质及酶活测定
使用检测试剂盒(上海科顺生物科技有限公司)检测各组土壤的有机质含量以及土壤脲酶、土壤蔗糖酶、土壤磷酸酶活性。
pH检测：称取10.0 g风干的土壤试样，置于50 ml的烧杯中，并加人25 mL水，将容器密封后用搅拌器，剧烈搅拌5 min，然后静置1 h~3 h。后插入校正过的pH计入试样溶液中，待读数稳定后读取pH。
2.2.4. 发酵液成分分析
代谢物提取：将实验样本在4℃条件下解冻，解冻后样本涡旋1 min，混合均匀；精确移取适量样本于2 mL离心管中，浓缩干燥；接着加入500 uL甲醇溶液到干燥后的样本管中，涡旋1 min；12,000 rpm 4℃离心10 min，取全部上清液，转移至新的2 mL离心管中，浓缩干燥；准确加入150 uL80%甲醇水配制的2-氯-L-苯丙氨酸(4 ppm)溶液复溶样品，取上清液过0.22 um膜过滤，过滤液加入到检测瓶中，用于LC-MS检测。
色谱条件：使用ACQUITY UPLC® HSS T3 (2.1 × 100 mm, 1.8 um)色谱柱，0.3 mL/min的流速，40℃的柱温，进样量2 uL。正离子模式，流动相为0.1%甲酸乙腈(B2)和 0.1%甲酸水(A2)，梯度洗脱程序为：0~1 min，8% B2；1~8 min，8%~98% B2；8~10 min，98% B2；10~10.1 min，98%~8% B2；10.1~12 min，8% B2。负离子模式，流动相为乙腈(B3)和5 mM甲酸铵水(A3)，梯度洗脱程序为：0~1 min，8% B3；1~8 min，8%~98% B3；8~10 min，98% B3；10~10.1 min，98%~8% B3；10.1~12 min，8% B3。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正负离子模式分别采集数据。正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为−2.50 kV，鞘气40 arb，辅助气10 arb。毛细管温度325℃，以分辨率70,000进行一级全扫描，一级离子扫描范围100~1000 m/z，并采用HCD进行二级裂解，碰撞能量为30 eV，二级分辨率为17,500，采集信号前3离子进行碎裂，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。
2.2.5. 数据处理
试验数据均运用SPSS 22.0软件分析处理，首先对试验数据进行单因素方差分析(ANOVA)，用Duncan’s多重比较法进行数据平均数的差异显著性分析，数据使用平均值±标准误(mean±SE)表示，p < 0.05为差异显著。将实验样本中检测的特征峰分子量、保留时间、二级谱图与植物谱图库进行比较、匹配，实现代谢物的定性、定量鉴定。
3. 结果与分析
3.1. 浒苔及其复合发酵液对土壤pH、有机质的影响
浒苔及其复合发酵液不同处理组对土壤pH、有机质见图1、图2。
由图1可知，与未处理前相比，不同处理组下的土壤pH均有所下降。其中，T1的pH值最低，为6.91，下降幅度最大，较未处理前下降10.95%，其余处理组按前后顺序分别较未处理前下降10.05%、3.86%、7.34%、5.41%、7.86%、6.18%，下降幅度按大小依次为T1 > T2 > T6 > T4＞T7 > T5 > T3。
由图2可知，与未处理前相比，不同处理对土壤有机质影响不同。其中，T7的有机质含量最高，为37.92，增加幅度最大，较未处理前上升62.75%，其余处理组按前后顺序分别较未处理前上升−17.68%、−14.25%、28.07%、18.63%、39.36%、27.51%，上升幅度按大小依次为T7 > ＞T5 > T3 > T6 > T4 > T2 > T1。
3.2. 浒苔及其复合发酵液对土壤酶活的影响
不同处理组下的土壤酶活均存在显著差异，具体情况见表2。
在土壤脲酶方面，与空白对照组相比，不同处理对土壤脲酶酶活性影响不同。其中，T4处理下的土壤脲酶酶活性最高，其活性达到9782.89 U/g，较空白对照组显著提高58.82%，其余处理组按前后顺序分别较空白对照组提高20.90%、12.52%、−4.50%、47.50%、30.91%，T2处理下的土壤脲酶酶活性最低，显著低于除CK组的其余处理组，各处理对土壤脲酶酶活性影响大小依次为T4 > T5 > T3＞T6 > T1 > T7 > T2。
Figure 1. pH of soil under different treatments
图1. 不同处理下土壤pH
Figure 2. Organic matter of soil under different treatments
图2. 不同处理下土壤有机质
Table 2. Soil enzyme activities under different treatments
表2. 不同处理下土壤酶活
处理 |
土壤酶活(U/g) |
脲酶 |
蔗糖酶 |
磷酸酶 |
T1 (浒苔) |
7447.02 ± 309.83d |
492.58 ± 41.02b |
0.0746 ± 0.0026c |
T2 (浒苔 + 蟛蜞菊) |
5882.06 ± 515.90e |
515.32 ± 27.88b |
0.0852 ± 0.0028b |
T3 (浒苔 + 金银花) |
9085.22 ± 377.69b |
598.89 ± 28.30a |
0.0954 ± 0.0047a |
T4 (浒苔 + 菊花) |
9782.89 ± 208.23a |
383.71 ± 51.40c |
0.0704 ± 0.0028cd |
T5 (浒苔 + 丁香) |
9370.45 ± 197.01b |
563.99 ± 15.88a |
0.0684 ± 0.0048d |
T6 (阳性CK组–化学药剂) |
8063.75 ± 318.68c |
572.31 ± 45.29a |
0.0939 ± 0.0045a |
T7 (CK组) |
6159.59 ± 200.56e |
564.31 ± 31.63a |
0.0841 ± 0.0046b |
注：同列数据后不同字母表示差异达到显著水平(P < 0.05)。
在土壤蔗糖酶方面，与空白对照组相比，不同处理对土壤蔗糖酶酶活性影响不同。其中，T3处理下的蔗糖酶酶活性最高，其活性达到598.89 U/g，较空白对照组提高6.13%，其余处理组按前后顺序分别较空白对照组提高−12.71%、−8.68%、−32.00%、0%、1.42%，T4处理下的蔗糖酶酶活性最低，显著低于其余组，各处理对蔗糖酶酶活性影响大小依次为T3 > T6 > T7＞T5 > T2 > T1 > T4。
在土壤磷酸酶方面，与空白对照组相比，不同处理对土壤磷酸酶酶活性影响不同。其中，T3处理下的土壤磷酸酶酶活性最高，其活性达到0.0954 U/g，较空白对照组显著提高13.44%，其余处理组按前后顺序分别较空白对照组提高−11.30%、1.31%、−16.29%、−18.67%、11.65%，T5处理下的土壤磷酸酶酶活性最低，显著低于除T4外的其余处理组，各处理对土壤磷酸酶酶活性影响大小依次为T3 > T6＞T2 > T7 > T1 > T4 > T5。
3.3. 浒苔发酵液成分分析
对浒苔发酵液进行LC-MS测总离子流图(见图3)。本次检测，浒苔发酵液共鉴定到857个代谢物。其中，浒苔发酵液中含有大量的脂肪酸及其衍生物、氨基酸类、木质素等化合物。
Figure 3. LC-MS analysis of volatile components of Enteromorpha prolifera
图3. 浒苔挥发性组分LC-MS分析
4. 讨论
健康的土壤环境是农作物茁壮生长的重要条件，土壤理化因子与酶活性则表能征土壤肥力。化学药剂的使用容易造成化肥、农药残留及超标和土壤大面积污染，不利于作物的生长。通过植物物种多样性方法在增加土壤生物多样性的同时还维护了土壤的健康，减少化肥、农药对土壤生态系统的破坏[9]。本研究中不同处理后对各土壤因子的影响不同，可能是番茄生长期间对不同养分的需求不同原因所致。
4.1. 浒苔发酵对土壤pH值的影响
土壤pH即土壤的酸碱度，是影响农作物生长发育的决定性因素，一般作物最适宜生长的土壤pH为6.5~7.5 [10]。试验结果表明，不同处理组的土壤pH值均有所下降，且均在作物适宜范围之内，有益于作物的生长发育，这与刘新源[12]研究的添加生物炭后土壤pH降低的结果相一致。
4.2. 浒苔发酵对土壤有机质吸收的影响
有机质是土壤的重要组成部分，有机质含量多少是判断土壤肥力的重要指标，也是作物生长必需的磷等元素各种养分的重要来源，且对土壤的结构性、缓冲性、耐肥性、通气性等指标有着重要的影响[11]。不同处理对土壤中有机质含量变化的影响有着显著差异。
土壤中根系分泌物和植物残体是土壤有机质的主要来源。从本试验结果可知，土壤有机质含量随着时间的延长而增加，与未处理前组相比，空白对照组的有机质含量显著增加，而浒苔发酵液组T1、蟛蜞菊复合发酵液T2组的有机质含量低于未处理前组，造成这种现象的原因可能是土壤pH值[13]通过影响微生物活性及土壤腐殖质含量，进而影响了有机质含量，生物肥的添加会促进植株对有机质的吸收，将其转化成自身生长所需的营养物质。
4.3. 浒苔发酵对土壤酶活性变化的影响
土壤酶是存在于土壤中不同状态酶类的总称，具备催化、转化功能，是评价土壤肥力的又一重要指标。土壤中有机质等矿物质的降解与吸收都有着土壤酶的参与，因此土壤酶活性的强弱直接反映土壤肥力，影响到土壤中碳氮磷等物质的转化、能量的传递[14]。
土壤脲酶促进氮循环，水解尿素产生氨和碳酸，以便于作物为吸收利用[15]。研究表明除了T2，其余处理组的脲酶活性要显著高于空白对照组T7。土壤蔗糖酶参与碳循环，能够将蔗糖分解成相应的单糖而被作物吸收利用[16]，其催化产物与易溶性营养物质(有机质、氮、磷等)含量和微生物数量及土壤呼吸强度有着紧密的联系，是间接评价土壤肥力的生物指标之一。本试验中，T3的蔗糖酶活性要高于T7。土壤磷酸酶活性高低可以反映土壤磷素的供应状况和转化规律，土壤中有机磷的分解、转化和其生物有效性受到直接影响[17]。T2、T3的磷酸酶活性要高于T7。
由于番茄种植过程常有根结线虫等病原生物的侵害，因此种植户常用氟吡菌胺处理种植土壤，氟吡菌胺是一种吡唑酰胺类广谱杀菌剂悬浮剂为氟吡菌胺和霜霉威的复配液体制剂，对霜霉病、疫病、晚疫病、猝倒病等常见卵菌纲病害具有杰出防效，对作物和环境安全。
试验发酵液复合液处理组中存在一些处理组的蔗糖酶、磷酸酶低于空白对照组的情况，可能是因为作物生长消耗土壤大量养分，导致相对应的土壤酶活力还没恢复过来而引起的。这与徐忠山等[18]的研究结果相似，他们发现土壤蔗糖酶活性与过氧化氢酶活性均表现为旺盛期最低。
有研究表明，木质素在土壤中可以通过转化为腐殖质，提高土体的内部空隙和胶结土壤颗粒，使得松散的土壤颗粒呈团聚体，土体结构更加密实[19]，以此来改善土壤结构、培育土壤，有利于控制土传病虫害的影响及作物的生长发育[20]。在本研究中也从浒苔发酵液中检测到了此类化合物。然而，由于本试验没设计时间梯度的土壤样品的检测，没有从动态上去分析发酵液及其复合液对土壤环境因子的影响，应增加多时间梯度样品的检测，以利于更好地确定不同发酵液处理组对土壤的影响。
5. 结论
试验结果表明，浒苔发酵液及其复合液均对土壤性质有不同程度的改良，即能够降低土壤的pH值，促进植株对有机质的吸收，同时能提高土壤中脲酶、蔗糖酶、磷酸酶的活性，有利于改善土壤肥效转化的微生态环境。
致 谢
浒苔生物肥关键技术与产品开发(上海海洋大学资助横向项目编号：集大S19098)；泉州师范学院福建省海洋藻类活性物质制备与功能开发重点实验室2018年度开放课题“防治茶叶假眼绿叶蝉的海藻植保剂的研发”(2018FZSK04)；福建农林大学国家重点实验室2017年度开放课题“海藻植保剂在辣木主要害虫中的生防应用研究”(SKB2017014)。