ZNF268在肝细胞癌中的表达及临床诊断价值探讨

The Expression and Clinical Diagnostic Value of ZNF268 in Hepatocellular Carcinoma

摘要: 目的：分析ZNF268在肝细胞癌(HCC)与正常肝脏中的表达差异，探讨ZNF268在HCC中的临床诊断价值。方法：实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)分别检测人肝癌细胞株HepG2、Huh7与人正常肝细胞株LO2中ZNF268 mRNA的表达情况；免疫组织化学技术(IHC)检测64例HCC及其癌旁对照组织中ZNF268的表达情况。结果：人肝癌细胞株HepG2、Huh7中ZNF268 mRNA的表达均明显低于人正常肝细胞株LO2 (P < 0.0001, P < 0.0001)；HCC组织中ZNF268的表达明显低于癌旁组织(P < 0.05)。结论：ZNF268在HCC中的表达低于正常肝脏，ZNF268有望作为HCC鉴别诊断和治疗的潜在生物标志物。

Abstract: Objective: To analyze the differential expression of ZNF268 in Hepatocellular carcinoma (HCC) and normal liver, and to explore the value of ZNF268 in the clinical diagnosis of HCC. Methods: qRT-PCR was used to detect the expression of ZNF268 mRNA in HepG2, Huh7 and LO2, respectively; IHC was used to detect the expression of ZNF268 in 64 HCC and paracancerous tissues. Results: The expression of ZNF268 mRNA in HepG2 and Huh7 was significantly lower than that in LO2 (P < 0.0001, P < 0.0001); The expression of ZNF268 in HCC tissue was significantly lower than that in paracancerous tissues (P < 0.05). Conclusion: The expression of ZNF268 in HCC is lower than that in normal liver, making it a potential biomarker for differential diagnosis and treatment of HCC.

1. 引言

原发性肝癌是一种进展迅速，预后极差的恶性肿瘤，是最常见的严重危害全球人类健康的恶性肿瘤之一，目前也是我国最常见的恶性肿瘤和肿瘤致死病因之一，造成了严重的社会经济负担[1]，每年新发病例约70万人，其中中国患者占50%以上[2]。其中肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是肝癌的常见病理类型，占所有病例的75%~85%，其发生与酒精性/非酒精性脂肪肝、病毒性肝炎等多种肝脏疾病相关[3]。HCC高死亡率与其容易侵袭和转移密切相关[4] [5]，故积极寻找能够早期预测HCC、判断预后以及指导治疗的肿瘤标志物，对肝癌精准治疗及提高患者生存率均具有十分重要的意义[6]。

随着肿瘤分子生物学的发展，人们在HCC中发现了许多异常分子，转录因子的异常也涉及其中。比如，许多过量表达的癌基因即为转录因子，它们的功能异常与发育过程的紊乱有关，最终会引起疾病的发生。锌指蛋白是真核生物中最常见的转录因子，其中，C2H2型锌指蛋白是最常见的。除了C端的锌指结构域外，C2H2型锌指蛋白的N端含有一些保守的效应结构域。根据效应结构域的特点，C2H2型锌指蛋白可分为如下四类：KRAB (Kruppel-associated box)、FAX (Finger-associated box)、FAR (Finger-associated repeat)和POZ (Pox virus and zinc finger)。其中，以KRAB型锌指蛋白最为常见，数目最多，约占1/3。ZNF268是一个典型的KRAB型锌指蛋白。有研究表明ZNF268不仅参与了人胚胎肝脏的发育[7]，血细胞的分化[8]，还与白血病发生过程[9]有关。近期有文献报道，ZNF268在宫颈癌[10]-[12]及卵巢癌[13] [14]的发生发展中也有所涉及，这提示ZNF268的表达水平可能与肿瘤的发生、进展、侵袭和转移密切相关。

故本研究通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、免疫组织化学技术(IHC)检测肝癌细胞及肝癌组织中ZNF268的表达情况，并探讨ZNF268在HCC中的诊断价值。

2. 资料与方法

2.1. 一般资料

收集2016年1月1日至2021年12月31日海南医科大学第二附属医院经病理检查确诊的HCC患者64例，其中男性56例，女性8例；年龄24~77岁，中位年龄48岁；以64例HCC组织的配对远癌旁组织(距癌组织边缘大于5 cm)作为对照。本研究通过海南医科大学第二附属医院伦理委员会审批(伦理编号：LW2021611)。

2.2. 纳入排除标准

1) 纳入标准：研究对象为经病理组织学确诊为HCC的连续性选择病例；影像学检查排除其他肿瘤肝转移；未合并其他重大疾病；病例资料完整；接受手术治疗前未接受过抗肿瘤治疗。

2) 排除标准：合并其他重大疾病；病例资料不完整；Aipathwell软件读取报告异常或脱落；术前已接受抗肿瘤治疗。

2.3. 方法

2.3.1. 实时荧光定量PCR检测

HepG2、Huh7与LO2细胞株购置于中科院上海细胞库。ZNF268引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(ZNF268-F: 5’-TACCAACACACCAAACCTGATA-3’, ZNF268-R: 5’-CATTCAAAGCTTTTTGCCGTAC-3’)。逆转录、荧光定量试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司。美国ABI 7500 Fast实时荧光定量PCR仪进行检测，设定反应条件如下：95℃ 3 min；95℃ 5 s；60℃ 10 s；72℃ 15 s，40个循环。

2.3.2. 免疫组织化学技术染色及结果判断

所有组织样本经石蜡包埋后予常规切片(厚度4 μm)。ZNF268免疫组织化学试剂盒购自英国Abcam公司，严格按说明书流程进行操作。结果判定：应用Aipathwell软件经循迹、选色、运算、分析得出结果。IRS = SI (阳性强度) × PP (阳性细胞比率)。阳性细胞比率 = 阳性细胞数/细胞总数[15]。SI可分为0~3级，0级为无阳性着色，1级为淡黄色弱阳性，2级为棕黄色中阳性，3级为棕褐色强阳性；PP可分为0~4级，0级为0~5%，1级为6~25%，2级为26~50%，3级为51~75%，4级为 > 75% [16]。最终按IRS评分高低进行分级：0~6分为低表达，7~12分为高表达。以上结果由两位专业病理医师独立阅片并作记录。

2.4. 统计学分析

采用GraphPad Prism 8软件对实验数据进行统计学分析。率的比较采用χ²检验，组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. ZNF268在HepG2、Huh7及LO2细胞株中mRNA的表达情况

Figure 1. mRNA expression of ZNF268 in HepG2, Huh7 and LO2

图1. ZNF268在HepG2、Huh7及LO2细胞株中mRNA的表达情况

ZNF268在人肝癌细胞株HepG2、Huh7中mRNA的表达均明显低于人正常肝细胞株LO2，P均 < 0.0001，见图1。

3.2. ZNF268在HCC及其癌旁对照组织中的表达情况

ZNF268在HCC组织中的表达主要位于细胞浆，间质细胞有少量表达，呈不同染色程度的棕黄色颗粒。癌旁组织中ZNF268的IRS明显高于HCC组织，HCC组织的ZNF268高表达率为18.8% (12/64)，癌旁对照组织的ZNF268高表达率为34.4% (22/64)，两组差异有统计学意义。P < 0. 05，见图2。

SI分级：A：0级无阳性着色，B：1级淡黄色弱阳性，C：2级棕黄色中阳性，D：3级棕褐色强阳性；PP分级：E：0级为0~5%，F：1级为6~25%，G：2级为26%~50%，H：3级为51%~75%，I：4级为>75%。

Figure 2. Staining score of ZNF268 in HCC and paracancerous control tissues (×100)

图2. ZNF268在HCC及癌旁对照组织中的染色评分(×100)

4. 讨论

HCC是临床常见的恶性肿瘤，其发病率在世界范围内居恶性肿瘤的第六位，死亡率排第四位[17] [18]，HCC发病率仍呈上升趋势，是全球医疗卫生事业面临巨大挑战的重要原因，世界卫生组织预计在2030年将有100多万人死于肝癌[19]。HCC的治疗方式包括外科手术、经肝动脉栓塞化疗术、消融治疗、肝脏移植以及放射治疗，早期肝癌行手术治疗可治愈，但多数患者在确诊时已属中晚期失去外科手术机会，五年总生存率仅为10%~18% [20]。

锌指蛋白是真核生物中最常见的转录因子，转录因子的异常参与了肿瘤的发生发展。ZNF268作为一个典型的KRAB型锌指蛋白，在不同的组织中发挥着不同的功能。研究显示，ZNF268在癌组织(宫颈癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、食道癌)中的表达高于癌旁组织，表明ZNF268在这些恶性肿瘤的发生发展中发挥着促进作用。然而，在胃、胰腺、睾丸以及皮肤癌组织中的表达低于相应的癌旁组织，提示ZNF268可能抑制这些组织的癌变。除此以外，ZNF268在直肠、甲状腺、肾、淋巴结、脑和软组织中的表达与其对应的癌组织中的表达无明显变化。但是ZNF268在肝癌中的研究，国内外未见相关报道，ZNF268是否参与肝癌的发生发展尚未可知，其在肝癌中的生物学作用机制也需深入研究。

本研究在细胞学及人体组织学层面研究ZNF268在HCC及正常肝脏中的表达。初步表明人肝癌细胞株HepG2、Huh7中ZNF268 mRNA的表达均明显低于人正常肝细胞株LO2 (P均 < 0.0001)。HCC组织中ZNF268的表达明显低于癌旁组织(P < 0.05)。这提示ZNF268的表达可能与HCC的恶性程度负相关，有望作为肝癌鉴别诊断和治疗的潜在生物标志物。

5. 结论

综上所述，ZNF268在HCC中表达降低，但ZNF268在HCC中发挥抗癌作用的分子机制尚需进一步深入研究。ZNF268是一个可用来设计新的治疗策略去管理肿瘤的潜在靶标，未来可望在肿瘤的诊断、治疗及预后评估等方面展示广阔的应用前景，同时也将有望推动个体化精准治疗的发展。

基金项目

海南省卫生健康行业科研项目(海南省卫生健康委员会) (21A200282)；海南省自然科学基金青年基金项目(823QN351)；海南省临床医学研究中心项目(LCYX202408)。

NOTES

^*通讯作者。