1. 引言
葡甘聚糖是一种从块茎中提取的杂多糖，由β-1,4糖苷键连接的D-葡萄糖和D-甘露糖组成，摩尔比为1:6.6。大约每19个糖单位在C6位置随机乙酰化，乙酰基含量低由于葡甘聚糖分子中含有丰富的羟基等活性基团[1]。葡甘聚糖也是一种水溶性中性多糖[2]，具有良好的生物降解性和生物相容性。中国最优质的葡甘聚糖年产量约为1.5万吨，占全球产量的60%。值得注意的是，葡甘聚糖细粉在中国的价格仅为葡聚糖粉的十分之一左右。
葡甘聚糖也是黏性最高的多糖之一，水中1% (w/v)葡甘聚糖粘度可达2350 mPa·s。由于高粘度和胶凝性能，葡甘聚糖传统上用作食品和化妆品领域的乳化剂和稳定剂[3]。近年来，其应用已扩展到生物医学和制药领域。葡甘聚糖衍生物可作为血浆代用品[4]、色谱介质[5]、给药载体[6] [7]、药物赋形剂[8]和组织培养支架。葡甘聚糖因其具有良好的生物相容性，细胞在葡甘聚糖微球表面具有良好的附着、生存和增殖能力，是作为细胞悬浮培养微载体的优良材料。微载体材料包括人工合成聚合物[9]和天然聚合物[10]。近年来，天然聚合物及其衍生物受到越来越多的关注。常用于制造微载体的天然聚合物包括明胶、胶原、纤维素、壳聚糖、海藻酸等。根据其物理性质，微载体进一步细分为固体和液体微载体。固体微载体具有粘附和细胞扩展的优点，液体微载体在细胞培养方法中，细胞在培养基和疏水性液体之间的界面上粘附和生长，对细胞生长没有不利影响，具有高氧溶解度等优点。
本文以液体石蜡的混合物为油相，在油相中混入葡甘聚糖溶液，Span-80为乳化剂，采用乳化搅拌分散法制备葡甘聚糖微载体，探究了不同反应条件对微载体成球率的影响，同时进行高温高压检测及SEM的表征，为未来微载体的研究带来潜在的研究价值。
2. 实验部分
2.1. 实验主要原料
葡甘聚糖(≥95%)购于合肥博美生物科技有限责任公司；环氧氯丙烷(AR)、石油醚(AR)、液体石蜡(AR)、无水乙醇(AR)购于天津科密欧化学试剂有限公司；盐酸(AR)、NaOH (AR)购自国药集团化学试剂有限公司。
2.2. 实验主要设备
DV-II+PRO数字粘度计精密天平(美国Brookfield)；JSm-7500F发射扫描电子显微镜(日本电子公司)；倒置显微镜(QUANTUM量子科学仪器贸易有限公司)；XFS-280A手提式蒸汽灭菌锅(上海锐风仪器制造有限公司)。
2.3. KGM微载体构建
配置不同浓度的水相溶液，将水相溶液以一定的水油体积比倒入含有一定体积比的乳化剂的油相溶液中，以一定的速度进行悬浮搅拌，搅拌一段时间后，缓慢加入环氧氯丙烷进行交联，反应完成后，得到的混合物用无水乙醇、超纯水进行反复洗涤并减压抽滤，最后将得到的湿微载体放入真空干燥机中进行干燥，如图1所示，具体操作如下：
1) 将KGM降解成小分子链的KGM，得到KGM水降解液，作为水相(W)；将KGM溶于一定浓度的盐酸中，不断搅拌，使其形成胶冻状，放入立式灭菌器内进行高温降解，设置温度为120℃，降解40 min后取出并将其冷却至室温，加入碱溶液，不断搅拌，直至全部溶解，过滤浆液得到黄色液体即KGM水溶液；
2) 将溶解有油相乳化剂且与水互不相溶的溶液作为油相(O)；
3) 以一定的水油比将水相缓慢加入油相，搅拌得到W/O型乳液；
4) 向上述乳液中滴加交联剂，以一定的交联温度和一定的搅拌速度搅拌，发生交联反应；
5) 交联成球后，经95%乙醇、水和石油醚反复洗涤至没有油性物质存在，收集微载体，即得到KGM微载体。
Figure 1. Flow chart of experiment
图1. KGM微载体的制备实验流程图
3. 实验结果
3.1. 油相的筛选
分别使用正己烷、石油醚、二氯乙烷和液体石蜡为油相，水油比例为1:3 (v:v)，将水相缓慢加入油相，搅拌得到W/O型乳液；向上述乳液中滴加环氧氯丙烷，交联剂使用量与水相比例为1:20 (m:m)，以交联温度60℃，搅拌速度150 rpm，反应时间12 h进行交联反应。交联成球后，经95%乙醇、水和石油醚反复洗涤至没有油性物质存在，收集微载体，即得到KGM微载体。如图2所示，使用正己烷、石油醚、二氯乙烷和液体石蜡为油相，均能得到外观形貌相近的KGM微载体，以成本、回收、环保和安全性能综合考量后，以液体石蜡为油相进行后续实验。
Figure 2. Microscope photos of konjac glucomannan microspheres in different oil phases
图2. 不同油相中KGM微载体的显微镜照片
3.2. 乳化剂的筛选
分别使用不同比例span-80和吐温-80两种乳化剂“配伍”作为混合乳化剂在相同反应条件下以方法2.3得到KGM微载体，对干燥后的KGM微载体通过倒置显微进行评价。如图3所示，span-80是一种油包水型乳化剂，其HLB = 4.3，得到的微载体呈均一分散状态，故选用span-80作为乳化剂。
Figure 3. Microscopic photograph of KGM microspheres
图3. 不同乳化剂下KGM微载体的显微镜照片
3.3. KGM微载体制备工艺优化
选取水油比(m/v)、乳化剂用量(%)、乳化时间(min)、乳化速度(rpm)和交联温度(℃)进行单因素实验，确定KGM成球的最佳参数，表1列出了每个因素的优化范围。对每个因素进行3次平行实验，并选择平均值。
Table 1. Single factor optimized experimental parameters
表1. 单因素优化法的实验参数值
水油比(m/v) |
乳化剂用量(%) |
搅拌速度(rpm) |
交联剂浓度(%) |
交联温度(℃) |
1:1 |
0.2 |
100 |
5 |
30 |
1:1.5 |
0.4 |
150 |
10 |
40 |
1:2 |
0.6 |
200 |
15 |
50 |
1:2.5 |
0.8 |
250 |
20 |
55 |
1:3 |
1 |
300 |
25 |
60 |
1:3.5 |
1.2 |
350 |
30 |
65 |
从图4(a)可看出，KGM微载体成球率随水油比先增加随后降低。这是由于当油相液态石蜡的体积较小时，油相中形成的水相小液滴较多，每滴之间的距离较小粘在一起。液体石蜡体积的进一步增加使后续处理变得非常困难，减压过滤时间大大增加。综上所述，选择水相与油相以体积比为1:3 (g:mL)混合得到的微载体效果较好，此时KGM微载体成球率最高，达到86.8%。
从图4(b)可看出，KGM微载体成球率随乳化剂浓度先增加随后降低。这是由于随乳化剂用量的增加，形成的微载体的颗粒尺寸逐渐减小，粘连现象也逐渐消失。当乳化剂用量过小时，表面张力较高，不能形成规整球体，因此成球率低。综上所述，选择乳化剂Span-80浓度为油相体积的1% (m/v)，此时所得的KGM成球率最高，为87.8%。
从图4(c)可看出，KGM微载体成球率随着乳化时间先增加后降低。由于乳化时间越长，水相溶液在油相中分散得越均匀，微载体颗粒大小形成越均匀，成球率逐渐增大。但乳化时间太长，导致整个反应时间较长会导致微载体碎裂，使得成球率下降，整个体系稳定下降。综合考虑，最佳的乳化时间为10 h，此时，成球率达到最高87.5%。
从图4(d)可看出，KGM微载体成球率随着交联剂先增加后降低。这是由于随着交联剂用量增加，微载体机械强度增加，成球率也逐渐增加，但是交联剂浓度过高，导致成球降低，可能的原因是交联剂浓度过高，导致微载体黏连严重从而导致成球率降低。综上所述，最佳的交联剂浓度为水相体积的10% (m/m)，此时所得的KGM成球率最高，为87.8%。
从图4(e)可看出，KGM微载体成球率随着交联温度先增加后降低。这是由于低温下交联反应速度慢，延长反应时间，造成不必要的损失。交联反应随温度升高而增加，导致KGM分子链之间的氢键和分子间力减少，而自由基形成速度加快，有助于KGM在成球体系中交联；然而，温度过高使得形成的反相乳液体系不稳定，微载体易破碎、粘连。综合考虑，选择交联温度为60℃为最佳的交联温度，成球率达到最高，最高为78.4%。
由图4(f)可看出，KGM微载体成球率随搅拌速度的增大而减小。搅拌速度对于微载体粒径具有显著的影响，搅拌速度越快，所形成的微载体的粒径越小，但是搅拌速度过大时，微载体对剪切力非常敏感，不利于微载体的形成，因此导致成球率降低。综上所述，搅拌速度为150 rpm，提供更规整的微载体和更均一的颗粒大小，选择搅拌速度为150 rpm为最佳的搅拌速度。
Figure 4. Single factor experimental results of KGM microcarrier spheroidization rate
图4. KGM微载体成球率单因素实验结果
3.4. KGM微载体的SEM微观形貌分析
将经过真空干燥的KGM微载体置于扫描电镜下，观察微载体表观形貌。如图5所示，(a1)、(a2)、(a3)为在最优条件下制备的KGM微载体的逐步放大图，(b1)、(b2)和(b3)分别为商品化的Seplife LX-MC-Dex1微载体逐步放大图。由图可知，与商品化的Seplife LX-MC-Dex1微载体相比，KGM表面结构较为光滑，粒径较小，基本呈规整的球型形状，与Seplife LX-MC-Dex1微载体在外观形貌方面相近，与普通光学显微镜法通过拍摄图像和长度换算来对颗粒粒径进行定值，粒径在60~150 μm之间。KGM微载体表面布满大大小小的凹坑，这些凹坑能有效的增大微载体的比表面积，Esc细胞将更容易吸附在凹坑表面及间隙中，说明成功制备了KGM微载体。
Figure 5. Scanning electron micrograph of KGM microcarriers and Seplife LX-MC-Dex1
图5. KGM微载体和Seplife LX-MC-Dex1 SEM图
3.5. KGM微载体的高温高压检测
Figure 6. (a) Dry KGM microcarrier image; (b) High-temperature and high-pressure treated KGM microcarrier image; (c) Dry KGM microcarrier SEM image; (d) High-temperature and high-pressure treated KGM microcarrier SEM image; (e) Dry KGM microcarrier SEM image; (f) PBS-soaked KGM microcarrier SEM image
图6. (a)干KGM微载体图；(b)经过高温高压处理的KGM微载体图；(c)干KGM微载体SEM图；(d)经过高温高压处理KGM微载体SEM图；(e)干KGM微载体SEM图；(f)经过PBS浸泡后KGM微载体SEM图
图6分别为KGM微载体样品的干微载体状态(a)、(c)、(e)，经过PBS缓冲溶液浸泡后的状态(f)以及经过高温高压灭菌处理后的状态(b) (d)。由图可清楚的看出，KGM微载体经PBS缓冲溶液浸泡和灭菌锅内温度为125℃，压力为0.15 MPa的高温高压条件处理下，球型形貌基本不受影响，能进行高温高压处理。
4. 结论
本研究通过乳化搅拌分散法得到葡甘聚糖微载体，考察了水油比、乳化剂用量、乳化时间、交联剂浓度、交联温度和搅拌速度对成球率的影响，以液体石蜡为油相，以环氧氯丙烷为交联剂，span-80为乳化剂，当水油比为1:3时，乳化剂用量为油相体积的1% (m/v)，乳化时间为10 h，搅拌速度为150 rpm，交联剂浓度为水相质量的10%，交联温度为60℃，得到的微载体形貌规整，均一分散，粒径约为60~150 μm，微载体的密度为(1.04 ± 0.01) g/mL，耐受高温高压，具备良好的物理化学稳定性。
NOTES
*通讯作者。