摘要: 目的：探讨血清miR-146a、SLPI、IGFBP7、TIMP-2对早期糖尿病肾病(DN)的诊断价值。方法：选取2022年1月至2023年12月在杭州市富阳区第一人民医院就诊的临床诊断为T2DM患者192例，按24 h尿微量清蛋白排泄率(24 h UAER)分为糖尿病肾脏病患者(DN) 48例(A组)，早期糖尿病肾病患者48例(B组)，糖尿病无肾脏病患者48例(C组)，另外选取同期健康体检者作为对照组48例(D组)。检测四组患者血清miR-146a、SLPI、IGFBP7、TIMP-2及24h UAER表达水平，并分析其对早期DN的诊断价值。结果：A组患者血清中miR-146a水平显著高于B、C、D组 (p < 0.05)，A组血清中SLPI、TIMP-2、IGFBP7指标显著低于B、C、D组(p < 0.05)，血清五个分子指标仅miR-146a、UAER单项诊断DN患者AUC面积分别为0.623、0.801 (p < 0.05)，同时小样本金标准诊断对比，miR-146a、UAER单项诊断DN患者AUC面积分别为0.643、0.850 (p < 0.05)，SLPI、TIMP-2、IGFBP7诊断DN患者AUC面积分别为0.464、0.586、0.425 (p < 0.05)，最终我们分析所有样本中五个分子联合诊断DN患者AUC面积为0.903 (p < 0.05)。结论：miR-146a检测对早期DN具有诊断价值，可作为糖尿病肾损伤早期的评估指标，miR-146a、SLPI、IGFBP7、TIMP-2联合UAER检测对早期DN具有更高的诊断价值。
Abstract:
Objective: To explore the diagnostic value of serum miR-146a, SLPI, IGFBP7, and TIMP-2 for early diabetic nephropathy (DN). Methods: A total of 192 patients clinically diagnosed with type 2 diabetes mellitus (T2DM) from January 2022 to December 2024 at the Fuyang District First People’s Hospital in Hangzhou were selected. Based on the 24-hour urinary albumin excretion rate (24 h UAER), the patients were divided into three groups: DN patients (48 cases, Group A), early DN patients (48 cases, Group B), and diabetes patients without kidney disease (48 cases, Group C). Additionally, 48 healthy individuals undergoing routine health check-ups during the same period were selected as the control group (Group D). The expression levels of serum miR-146a, SLPI, IGFBP7, TIMP-2, and 24 h UAER were measured in all four groups, and their diagnostic value for early DN was analyzed. Results: The serum miR-146a levels in Group A were significantly higher than those in Groups B, C, and D (p < 0.05). The indicators SLPI, TIMP-2, and IGFBP7 in Group A were significantly lower than those in Groups B, C, and D (p < 0.05). The diagnostic AUC areas of miR-146a and UAER for DN in Group A were 0.623 and 0.801, respectively (p < 0.05). With small sample gold standard diagnostics, the AUC areas for miR-146a and UAER were 0.643 and 0.850, respectively (p < 0.05). The AUC areas for SLPI, TIMP-2, and IGFBP7 were 0.464, 0.586, and 0.425, respectively (p < 0.05). Ultimately, the combined diagnostic AUC area for the five molecular markers in DN was 0.903 (p < 0.05). Conclusion: miR-146a testing has diagnostic value for early DN and can serve as an early assessment marker for diabetic kidney damage. The combination of miR-146a, SLPI, IGFBP7, and TIMP-2 with UAER provides higher diagnostic value for early DN.
1. 引言
糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy, DN)是糖尿病患者最严重的并发症之一，是世界范围内终末期肾脏疾病的主要原因，具有很高的发病率和死亡率[1] [2]，糖尿病肾病在早期阶段往往没有明显症状，导致患者和医生可能忽视肾脏损害的早期迹象，早期诊断和干预可以显著减缓肾功能下降的速度，防止疾病进展至ESRD (End-Stage Renal Disease, ESRD)，从而减少对透析或肾脏移植的需求。因此早期诊断对于防止其进展至终末期肾病至关重要。
值得注意的是，肾穿作为肾脏病理金标准方法学，属于侵入性操作，难以被早期患者接受并可能会带来一定后遗症，常见的后遗症包括轻微到严重的血尿、血肿、疼痛、感染、动静脉瘘，以及极少见的肾功能恶化。在穿刺过程中，可能会误伤邻近器官如脾脏、肝脏或肠道，因此早期糖尿病肾脏病穿刺不符合临床实际且临床已达成共识[3]，因此寻找安全无创指标对于诊断早期DN变得更加有意义，目前临床上根据24 h尿微量清蛋白排泄率阈值作为诊断糖尿病肾病重要诊断标准，但在早期DN诊断的敏感性及特异性均不高，容易漏诊及误诊，因此寻求更多重要的肾脏损伤和疾病生物标志物有助于早期检测DN (如血清胱抑素C、中性粒细胞明胶酶相关脂钙蛋白、血清同型半胱氨酸、钙粘蛋白水平、b-trace蛋白质、microRNA-130b、血管紧张素转换酶等) [4]-[6]，上述指标特异性和敏感性均不高，进一步寻找理想的早期肾损伤的诊断指标，对疾病的早期干预治疗有重要意义。
2. 资料和方法
2.1. 一般资料
选取2022年1月~2023年12月期间在杭州市富阳区第一人民医院就诊的临床诊断为T2DM患者192例，根据24 h尿微量清蛋白排泄率水平及其他诊断将其分为四组：正常组48例(D组)，糖尿病无肾病组(C组)，早期糖尿病肾病组(B组)，糖尿病肾脏病(A组)，收集并检测各组患者血清中miR-146a、SLPI、IGFBP7、TIMP-2的表达，按照A组男24例，女24例，年龄(54.58 ± 4.43)岁，病程(5.85 ± 1.66)年，体质量指数(BMI) (22.10 ± 1.66) kg/m2，有吸烟史18例。B组男24例，女24例，年龄(56.00 ± 5.76)岁，病程(6.14 ± 1.80)年，体脂量指数(BMI) (22.09 ± 1.53) kg/m2，有吸烟史19例。C组男24例，女24例，年龄(54.44 ± 7.64)岁，病程(6.32 ± 1.90)年，BMI (22.58 ± 1.72) kg/m2，有吸烟史21例。另外选取同期在本院体检健康者48例为对照组(D组)，其中男24例，女24例，年龄(53.83 ± 5.62)岁，BMI (22.05 ± 1.32) kg/m2，有吸烟史15例。四组受试者性别、年龄、BMI、吸烟史等一般资料比较差异无统计学意义(P > 0.05)。
2.2. 纳入和排除标准
纳入标准：1) 符合《中国2型糖尿病防治指南(2020年版)》T2DM诊断标准[7]，DN患者符合《糖尿病肾脏疾病临床诊疗中国指南》诊断标准[8]；2) DM病程为1~5年，DN为初诊患者；3) 患者签署知情同意书。
排除标准[9]，本研究经过院内伦理委员会审批(2021-016)，患者签署知情同意书。
2.3. 一般资料收集
记录入选对象的性别、年龄、糖尿病病程、身高、体重、血压、既往史、个人史、家族史、BMI等相关信息。
2.4. 生化指标的检测
病人入院后留取24 h尿液，记录总尿量，摇匀后留取尿标本进行生化分析；受试者在检测前禁食8 h，抽取5 ml清晨空腹静脉血作为试验样本，血液样本应在5分钟以3000 r/min的速度离心避免溶血，分离血清，然后进行各生化指标的检测；其中，使用全自动生化仪DPP800型及仪器配套的原装试剂盒，检测尿酸、肌酐等。
2.5. Q-pcr检测外周血miR-146a的表达
用TRIzol一步法提取血清中总RNA，测定D (260 nm)/D (280 nm)比值大于1.8，定量后取总RNA进行反转录反应，反应体系10 μL，反应条件42℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 10 min，取cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，反应体系20 μL，反应条件95℃ 30 s，95℃ 3 s，60℃ 30 s循环40次，各样品的目的miRNA和内参(U6)分别进行实时荧光定量PCR，数据采用2-ΔΔCT法进行分析，引物序列详见表1。
Table 1. Primers
表1. 引物
NO. |
Targetgenes |
Primer |
Sequences |
1 |
hsa-miR-146a-5p |
hsa-miR-146a-5pRTPrimer |
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACCCA |
hsa-miR-146a-5pForPrimer |
AGCGTGTGAGAACTGAATTCCA |
microRNA_uniRev |
CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT |
2 |
hsa-U6 |
hsa-U6snRNAFor |
CTCGCTTCGGCAGCACATA |
hsa-U6snRNARev |
CGAATTTGCGTGTCATCCT |
2.6. ELISA法检测外周血SLPI、IGFBP7及TIMP-2指标
取出预先准备的血清样本，采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测SLPI、IGFBP7及TIMP-2。将标准品稀释后加样，标准品孔加入标准品100 μL，待测品孔加入100 μL样品，振荡混匀，37℃水浴2 h，弃去液体，甩干，不洗涤。每孔加生物素标记抗体100 μL，覆上新的板贴，37℃温育1 h，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2 min，甩干，每孔加辣根过氧化酶标记亲和素工作液100 μL，覆上新的板贴，37℃温育1 h，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2 min，甩干，依序每孔加底物溶液90 μL，37℃避光显色15~30 min，依序每孔加终止液50 μL，终止反应，在反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长测量各孔的吸光度值。
2.7. 统计方法
统计学分析数据均采用SPSS21.0软件处理，计量资料以均数 ± 标准差(
)表示，采用方差分析，影响因素的分析采用多因素Logistic逐步回归模型；绘制受试者工作特征(ROC)曲线。p < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. 各组肾功能比较
尿酸、24 h UAER在健康人群中均显著低于疾病组(p < 0.05)，eGFR显著高于疾病组(p < 0.05)，且尿酸、24 h UAER在糖尿病组、早期糖尿病肾病组、糖尿病肾病组是逐渐升高，eGFR是逐渐下降，且有显著性差异(p < 0.05)，见表2。
Table 2. Comparison of renal function among groups
表2. 各组肾功能比较
项目 |
健康对照组z
(n = 48) |
糖尿病组
(n = 48) |
早期糖尿病肾病组
(n = 48) |
糖尿病肾病组
(n = 48) |
p值 |
尿酸(u mol/l) |
296.98 ± 45.78 |
312.19 ± 80.47 |
346.31 ± 100.50 |
390.78 ± 102.67 |
<0.001 |
24 h UAER (mg/24h) |
20.30 ± 7.83 |
24.87 ± 2.15 |
82.91 ± 25.05 |
2239.79 ± 1010.67 |
<0.001 |
eGFR (ml/min/1.73m2) |
104.35 ± 20.2 |
95.64 ± 8.97 |
63.76 ± 6.82 |
64.45 ± 9.50 |
<0.001 |
3.2. 各组候选指标比较
TIMP2、miR-146a的表达在健康组、糖尿病组、早期糖尿病肾病组、糖尿病肾病组显著逐渐升高(p < 0.05)，但SLPI和IGFBP7组间有差异，且表达未有迹可循，见表3。
Table 3. Expression of TIMP2, miR-146a, IGFBP7, and SLPI
表3. TIMP2、miR-146a、IGFBP7和SLPI表达
项目 |
健康对照组(n = 48) |
糖尿病组(n = 48) |
早期糖尿病肾病组
(n = 48) |
糖尿病肾病组(n = 48) |
p值 |
TIMP2 |
62.49 ± 16.07 |
63.50 ± 10.95 |
64.05 ± 14.29 |
66.30 ± 13.42 |
<0.001 |
SLPI |
501.66 ± 86.80 |
420.37 ± 77.83 |
420.37 ± 105.83 |
441.11 ± 97.59 |
<0.001 |
IGFBP7 |
5919.34 ± 1273.97 |
5633.78 ± 1057.34 |
5664.68 ± 1293.20 |
5332.76 ± 1057.35 |
<0.001 |
miR-146a |
2.34 ± 0.69 |
2.41 ± 0.60 |
2.65 ± 1.13 |
2.90 ± 1.06 |
<0.001 |
3.3. UAER、SLPI、TIMP-2、IGFBBP7、miR-146a诊断DN的ROC曲线
将A和B组设置为1 (疾病)，其余组设置为0，SPSS中绘制单因素ROC曲线，血清miR-146a诊断DN患者AUC面积为0.623，UAER诊断DN患者AUC面积为0.801，SLPI、TIMP-2、IGFBBP7诊断DN患者AUC面积不足0.5，p值均<0.05，表明单指标UAER和miR-146a对于糖尿病肾病诊断具有价值，其余指标单独检测并不能对糖尿病肾病诊断提供价值，见图1和表5。
Figure 1. ROC curves for single indicators UAER, SLPI, TIMP-2, IGFBP7, miR-146a
图1. UAER、SLPI、TIMP-2、IGFBBP7、miR-146a单指标ROC曲线图
3.4. 10例肾脏穿刺活检确诊为糖尿病肾脏病患者检测指标与健康对照组和糖尿病组数据对比
病理图片判断为轻、中、重患者(见图2)，早期患者做肾脏穿刺依从性很差，因此早期糖尿病肾脏病穿刺不符合临床实际且临床已达成共识[10]，因此短时间内获取珍贵10例样本。同时检测此10例患者24h UAER、TIMP2、miR-146a、IGFBP7和SLPI表达显著高于健康对照。将10例糖尿病肾脏病患者设置为1 (疾病)，其余组设置为0，SPSS中绘制单因素ROC曲线，血清miR-146a诊断DN患者AUC面积为0.643，UAER诊断DN患者AUC面积为0.850，SLPI、TIMP-2、IGFBP7诊断DN患者AUC面积分别为0.464、0.586、0.425，P值均<0.05，表明单指标UAER和miR-146a对于糖尿病肾病诊断具有价值，其余指标单独检测并不能对糖尿病肾病诊断提供价值，见图3和表4。
注：轻(早期糖尿病肾病)，肾小球基底膜节段性增厚，足突节段性融合，系膜区可见高密度电子致密物沉积。中(糖尿病肾病)，肾小球基底膜节段性偏薄，足突节段性融合，个别系膜区可见少量电子致密物沉积。重(糖尿病肾病末期)，镜下未见肾小球。
Figure 2. Electron microscopy image of a renal biopsy from a patient with diabetic nephropathy
图2. 糖尿病肾脏病患者穿刺电镜图
Table 4. Expression of 24 h UAER, TIMP2, miR-146a, IGFBP7, and SLPI
表4. 24 h UAER、TIMP2、miR-146a、IGFBP7和SLPI表达
项目 |
健康对照组(n = 48) |
糖尿病组(n = 48) |
糖尿病肾病组(n = 10) |
p值 |
24h UAER(mg/24h) |
20.30 ± 7.83 |
24.87 ± 2.15 |
40.90 ± 4.25 |
<0.001 |
TIMP2 |
62.49 ± 16.07 |
63.50 ± 10.95 |
68.26 ± 14.13 |
<0.001 |
SLPI |
501.66 ± 86.80 |
420.37 ± 77.83 |
423.02 ± 77.52 |
<0.001 |
IGFBP7 |
5919.34 ± 1273.97 |
5633.78 ± 1057.34 |
5432.71 ± 1173.21 |
<0.001 |
miR-146a |
2.34 ± 0.69 |
2.41 ± 0.60 |
3.03 ± 1.32 |
<0.001 |
Figure 3. ROC curves for single indicators UAER, SLPI, TIMP-2, IGFBP7, miR-146a in 10 Patients
图3. 10例患者UAER、SLPI、TIMP-2、IGFBP7、miR-146a单指标ROC曲线图
3.5. 多指标联合(五个指标)诊断DN的ROC曲线
Logistic回归分析五个指标联合，再绘制ROC曲线，诊断DN患者AUC面积为0.903，p < 0.05，提示五个指标联合诊断早期DN灵敏度会更高，比UAER指标诊断更有价值，见图4和表5。
Figure 4. Combined ROC curves for UAER, SLPI, TIMP-2, IGFBP7, miR-146a
图4. UAER、SLPI、TIMP-2、IGFBP7、miR-146a联合ROC曲线图
3.6. 单指标和多指标联合分析DN早期诊断价值参数表
Table 5. Reference values for the combined analysis results of UAER, SLPI, TIMP-2, IGFBP7, miR-146a, and five indicators
表5. UAER、SLPI、TIMP-2、IGFBP7、miR-146a及五指标联合分析结果参值
检验结果变量 |
区域 |
标准错误a |
渐近显著性b |
渐近95%置信区间 |
下限 |
上限 |
UAER |
0.801 |
0.03 |
0 |
0.743 |
0.859 |
SLPI |
0.231 |
0.047 |
0 |
0.138 |
0.324 |
TIMP-2 |
0.197 |
0.041 |
0 |
0.117 |
0.276 |
IGFBP7 |
0.173 |
0.035 |
0 |
0.104 |
0.242 |
miR-146a |
0.623 |
0.058 |
0.009 |
0.509 |
0.736 |
五指标联合分析 |
0.903 |
0.029 |
0 |
0.846 |
0.961 |
4. 讨论
本研究集中于探讨和验证一系列生物标志物在糖尿病肾病(DN)早期检测和诊断中的应用潜力。研究发现，某些生物标志物，如UAER水平，在DN早期阶段即有显著变化[11] [12]。这些发现与先前的研究相呼应，进一步强调了在临床上采用多种生物标志物以提高DN早期诊断的精确性的重要性。微量白蛋白尿被认为是糖尿病肾病(DN)早期的一个警示信号[8] [13]。在常规的临床检查中，对微量白蛋白尿进行筛查是标准做法，但值得注意的是，即便未检出微量白蛋白尿，肾损害的可能性仍然存在。因此，开发能够早期发现DN的新方法显得尤为重要。若能在早期便识别出DN的生物学指标，就可能实现更早的诊断和治疗，从而有效降低DN的发病率，减缓其发展速度，并提升糖尿病患者的生活品质。研究表明，与非糖尿病人群相比，2型糖尿病患者在无蛋白尿、微量蛋白尿以及大量蛋白尿各个阶段的多种生物标志物均有显著变化，这些变化可作为DN早期发生的预警指标。
尤其值得注意的是，本研究中发现的生物标志物不仅与DN的早期发展有关，而且在疾病进展的不同阶段表现出不同的动态变化，这可能有助于监测疾病进展和治疗反应。最近的研究表明，miR-146a的表达在DN患者中发生变化，尤其是在糖尿病的早期阶段，这表明其可能作为DN发展的早期生物标志物[14]。通过监测miR-146a的水平，可能有助于早期识别高风险的DN患者，从而及时采取干预措施。分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)是一种具有广泛抗炎和免疫调节功能的蛋白。在DN的背景下，SLPI的表达受到影响，这可能与其在抑制炎症和保护肾脏免受损伤的作用有关。SLPI的水平变化可以反映肾脏的炎症状态和组织损伤程度[15]，因此，监测其水平可能对早期识别DN以及评估疾病进展具有潜在价值。胰岛素样生长因子结合蛋白7 (IGFBP7)在调节细胞增殖、分化以及凋亡等过程中发挥作用。在DN的背景下，IGFBP7的表达变化与肾脏纤维化密切相关，纤维化是DN进展的关键病理过程之一[16]。因此，IGFBP7的水平可能作为评估肾脏损伤和纤维化程度的指标，从而在DN的早期诊断和监测中发挥重要作用。天然人成纤维细胞基质金属蛋白酶抑制物-2 (TIMP-2)与细胞外基质的降解和重建有关，在控制组织修复和纤维化过程中起着关键作用，如TIMP-2通过抑制基质金属蛋白酶(MMPs)活性，防止细胞外基质(ECM)的过度降解，维持ECM的稳定性[17]。在控制纤维化方面，TIMP-2抑制纤维化因子的释放，防止ECM的过度沉积，并通过调节免疫细胞和炎症介质，减轻炎症反应，促进组织修复[3] [18]。在DN中，TIMP-2的水平增加可能反映了肾脏组织的纤维化过程，从而作为早期诊断和评估DN进展的潜在标志物[19] [20]。我们此项真实世界研究中，miR-146a和UAER分别对于早期糖尿病肾病诊断有一定价值(AUC = 0.623, p = 0.009; AUC = 0.801, p = 0)，但是SLPI、TIMP-2、IGFBBP7单独检测对DN诊断并未有价值，这里可能和模型数量和样本分布不均有关系，或符合真实世界规律，有待更大样本量验证这一猜想。
尽管本研究提供了有关生物标志物在DN早期检测中的重要见解，但存在一些限制。首先，生物标志物的表达可能受到多种因素的影响，包括患者的年龄、性别、生活方式以及其他并发症的存在，这些因素都需要在将来的研究中加以控制和研究。其次，尽管我们研究了多种生物标志物，但这一领域还有许多未被探索的潜在标志物，这些标志物可能对于DN的早期检测和预后评估同样重要。
未来的研究应当致力于进一步验证本研究发现的生物标志物在更大、更多样化的患者群体中及开展多中心的前瞻性研究以验证其适用性和可靠性。此外，探索新的生物标志物，尤其是那些能够反映DN早期病理生理过程的标志物，将对早期诊断和个性化治疗策略的制定至关重要。同时，研究应当集中于开发简便、成本效益高的检测方法，以促进生物标志物在临床实践中的广泛应用。
总之，生物标志物在糖尿病肾病早期检测和诊断中显示出巨大的潜力。通过深入研究和开发这些标志物，我们可以期待在未来实现对DN更早期、更准确的诊断，从而为患者提供更及时有效的治疗方案，改善其预后。
基金项目
杭州市富阳区科技局资助项目(2021SK010)。
NOTES
*通讯作者。