肺腺癌中3P_tRNA-Arg-TCT-4-1的表达及对增殖的影响
Expression of 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 in Lung Adenocarcinoma and Its Effect on Proliferation
DOI: 10.12677/acm.2024.1472055, PDF, HTML, XML, 下载: 3  浏览: 5 
作者: 何志鹤：扬州大学医学院病理学教研室，江苏 扬州；张家港市第二人民医院医院呼吸内科，江苏 张家港；王成海：扬州大学医学院病理学教研室，江苏 扬州；江苏省中西医结合老年病防治重点实验室，江苏 扬州
关键词: 肺腺癌；3P_tRNA-Arg-TCT-4-1；增殖活性；临床特征；Lung Adenocarcinoma； 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1； Proliferative Activity； Clinical Features
摘要: 目的：研究肺腺癌(LUAC)中3P_tRNA-Arg-TCT-4-1的表达情况及其临床意义，并探索3P_tRNA-Arg-TCT-4-1对LUAC细胞生长和和生存预后的影响。方法：收集我院手术切除的LUAC 71例标本及临床特征。qRT-PCR检测3P_tRNA-Arg-TCT-4-1在LUAC组织中的表达水平，统计分析3P_tRNA-Arg-TCT-4-1的表达与LUAC病理特征的相关性。通过Kaplan-Meier统计方法分析3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达对肺腺癌患者生存预后的影响。采用CCK-8增殖实验检测3P_tRNA-Arg-TCT-4-1对LUAC细胞增殖的影响。结果：qRT-PCR实验结果显示，在71对LUAC组织中3P_tRNA-Arg-TCT-4-1相对表达量为3.491 ± 0.222，明显高于癌旁正常组织(t = 10.064, P = 0.000 < 0.05)；统计分析结果显示3P_tRNA-Arg-TCT-4-1的表达与LUAC的分化程度(χ2 = 11.112, P = 0.001)和肿瘤大小(χ2 = 4.616, P = 0.032)密切相关(P均 < 0.05)，而与患者年龄、性别、淋巴结转移和TNM分期之间无相关性(P均 > 0.05)。在与患者生存预后的关系上，3P_tRNA-Arg-TCT-4-1正常或阴性表达组总生存期时间明显长于高表达组(χ2 = 5.885, P = 0.002 < 0.05)。CCK-8增殖实验提示过表达3P_tRNA-Arg-TCT-4-1增强了LUCA细胞的增殖活性，而降低3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达则减弱了LUCA细胞的增殖活性(P均 < 0.05)。结论：在LUCA中3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达水平升高，是一个新的促进增殖的促癌基因；3P_tRNA-Arg-TCT-4-1有可能成为治疗生长旺盛的LUCA分子标志物。
Abstract: Objective: To investigate the expression of 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 in lung adenocarcinoma (LUAC) and its clinical significance, and to explore the effect of 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 on the growth, survival and prognosis of LUAC cells. Methods: The clinical features and specimens of 71 pairs of LUAC were collected. The expression level of 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 in LUAC tissues was detected by qRT-PCR, and the correlation between the expression of 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 and the pathological characteristics of LUAC was statistically analyzed. The effect of 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 expression on survival and prognosis of lung adenocarcinoma patients was analyzed by the Kaplan-Meier statistical method. The effect of 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 on the proliferation of LUAC cells was detected by the CCK-8 proliferation assay. Results: The results of qRT-PCR showed that the relative expression of 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 in 71 pairs of LUAC tissues was 3.491 ± 0.222, which was significantly higher than that in adjacent normal tissues (t = 10.064, P = 0.000 < 0.05). Statistical analysis showed that the expression of 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 was closely correlated with the differentiation degree of LUAC (χ2 = 11.112, P = 0.001) and tumor size (χ2 = 4.616, P = 0.032) (both P < 0.05). There was no correlation with age, sex, lymph node metastasis, and TNM stage (all P > 0.05). With survival and prognosis, the total survival time of the 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 expression group was significantly longer than that of the high expression group (χ2 = 5.885, P = 0.002 < 0.05). The proliferation experiment of CCK-8 suggested that overexpression of 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 enhanced the proliferation activity of LUCA cells while silencing expression of 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 decreased the proliferation activity of LUCA cells (P < 0.05). Conclusion: 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 expression level is increased in LUCA, which is a new oncogene promoting proliferation. 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 may be a LUCA molecular marker for the treatment of vigorous growth.
文章引用：何志鹤, 王成海. 肺腺癌中3P_tRNA-Arg-TCT-4-1的表达及对增殖的影响[J]. 临床医学进展, 2024, 14(7): 588-595. https://doi.org/10.12677/acm.2024.1472055

1. 引言

肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAC)是人类中最常诊断的癌症，在全球癌症发病率中排名第一[1] [2]。引发LUAC的病因包括吸烟、空气污染和职业性危险因数和遗传基因突变等[3]。尽管肺腺癌能够早发现和早诊，但其发生发展的生理机制和潜在生物标志物仍有待进一步阐明。

转运RNA (Transfer RNA, tRNA)作为一种非编码RNA，传统上被认为是蛋白质转化过程中的一种适配分子[4]。近年来，在大规模基因测序时发现了一类新的非编码小RNA，它们来源于tRNA前体或成熟序列，起名tRNA衍生片段(tRNA-derived fragments, TRDF) [5] [6]。与tRNA的随机降解不同，这些片段的发生是在特定tRNA修饰酶作用下进行精确位点切割而形成的新产物，长度为14~50 nt [7]。目前已有不多的文献表明知TRDF参与了一些肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和转移等生物学过程[7]-[11]，例如，TRF-3027 (tRNAGly-GCC)可能与rna诱导沉默复合物(RISCs)的重要组分AGO结合，阻断复制蛋白A1 (RPA1)抑制细胞增殖，调节DNA损伤反应[8]。3’-tsRNA-LeuCAG在体外快速分裂细胞，在小鼠原位肝细胞癌模型中能诱导细胞凋亡。它与mRNA (RPS28和RPS15)结合以增强其翻译，阻断了18s前核糖体RNA加工，导致40S核糖体亚基数量减少，从而诱导细胞凋亡[9]。在结直肠癌中5’tiRNA-Val-CAC促进了细胞的生长和增殖[10]。tRF/miR-1280通过抑制支持CSC表型的Notch信号通路抑制结直肠癌细胞的生长和转移[11]。本实验通过分析NCBI在线数据集GSE83527、GSE62182和GSE110907得到LUAC中差异表达的tRNA衍生片段，其中3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达水平上调，并在71例LUAC组织中得到验证。本实验旨在探讨3P_tRNA-Arg-TCT-4-1的表达、临床病理意义以及对增殖的影响。

2. 材料与方法

2.1. 临床标本

71例新鲜的LUCA组织来自我院胸外科手术切除患者，时间为2021年8月~2023年12月，患者年龄范围43~68岁，中位年龄为56岁。患者手术前均未行化疗或放疗处理。纳入标准：1) 经病理检查确诊为LUCA；2) 入组前未进行手术、化放疗等抗肿瘤治疗；3) 患者临床资料和随访资料完整。排除标准：1) 患有其他原发和转移性肿瘤；2) 合并有心肝肾等重要脏器功能障碍和血液系统疾病、免疫功能障碍。肿瘤分期参照第8版美国肿瘤联合会肺腺癌分期系统，分为I期18例、II期22例、III期31例。本研究经扬州大学附属医院伦理委员会批准，并与患者签署知情同意书。

2.2. 材料和细胞

3P_tRNA-Arg-TCT-4-1过表达和降低表达的质粒由云舟生物科技(广州)股份有限公司合成。质粒转染过程按Lipofectamine 2000试剂盒(Invitrogen公司)说明书步骤进行。肺腺癌细胞株NCI-H1975购买于中国科学院上海细胞库。

2.3. 细胞培养

NCI-H1975的培养基为含10%胎牛血清 + 90% DMEM培养基(Invitrogen公司)，其中还包括100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素(Invitrogen公司)抗生素。放置于37℃且含5% CO2细胞培养箱孵育。

2.4. qRT-PCR实验

总RNA提取试剂盒分离LUCA组织后，用Prime-Script RT Reagent (TAKARA)试剂盒进行逆转录，再用Quanta bio PerfeCta SYBR Green FastMix (艾普拜生物)进行qRT-PCR，按试剂说明书进行实验。

2.5. 细胞增殖活性实验

在指定的时间(12、24、48和72 h)，用10 μL CCK-8溶液在96孔板中处理NCI-H1975细胞系，并在孔中再孵育1小时。最后，使用酶标仪评估450 nm处的吸光度。结果分析：增殖比率 = (降低表达/过表达3P_tRNA-Arg-TCT-4-1细胞实验组 − 无细胞对照)/(无敲低表达/过表达3P_tRNA-Arg-TCT-4-1细胞阴性对照 − 无细胞对照) × 100%。

2.6. 统计学分析

所有数据均采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 16.0软件进行分析，计量数据用均数 ± 标准差(mean ± SD)表示，组间均数的比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。通过Kaplan-Meier统计方法分析3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达对肺腺癌患者生存预后的影响。P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. LUCA组织中3P_tRNA-Arg-TCT-4-1的表达水平

如图1显示，qRT-PCR实验结果显示在71对LUCA组织中3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达水平为3.400 ± 0.238，明显高于癌旁正常组织NC (其值设定为1) (t = 10.064, P = 0.000 < 0.05)。该实验提示3P_tRNA-Arg-TCT-4-1在LUCA中可能发挥促癌基因的作用。

Figure 1. Results of qRT-PCR experiment. The expression level of 3P_TRnA-ARG-CTT-4-1 was up-regulated in LUCA

图1. qRT-PCR实验结果。3P_tRNA-Arg-TCT-4-1在LUCA中表达水平上调

3.2. 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达与LUCA临床特征的关联性

按3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达水平分为两组：高表达组(54例，3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达水平高于对照组)和正常/低表达组(17例，3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达水平等于或低于对照组)。通过统计分析得出3P_tRNA-Arg-TCT-4-1的表达与LUCA的分化程度(χ2 = 11.112, P = 0.001)、肿瘤大小(χ2 = 4.616, P = 0.032)密切相关(P均 < 0.05)，而与患者年龄、性别、肿瘤淋巴结转移和TNM分期之间无相关性(P均 > 0.05)，见表1。这一结果提示高表达的3P_tRNA-Arg-TCT-4-1参与了肺癌细胞的分化和增殖过程。

Table 1. Relationship between expression of 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 in LUCA and clinical features

表1. 肺腺癌组织3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达与临床特征的关系

指标

高表达组(n = 54)

正常/低表达组(n = 17)

χ2

P

性别

男

44

10

3.645

0.056

女

10

7

年龄

<55岁

18

6

0.022

0.882

≥55岁

36

11

肿瘤大小(直径)

≤5 cm

22

12

4.616

0.032

>5 cm

32

5

分化程度

中低分化

40

5

11.112

0.001

高分化

14

12

淋巴结转移

有

26

5

1.845

0.174

无

28

12

TNM分期

I~II期

30

10

0.056

0.813

III期

24

7

3.3. 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1对肺癌细胞增殖活性的影响

正如2.2实验结果提示3P_tRNA-Arg-TCT-4-1与肿瘤直径大小(直径)密切相关，因此进一步通过CCK-8实验研究3P_tRNA-Arg-TCT-4-1对肺腺癌细胞增殖活性的影响。实验结果如图2显示：在72 h时，过表达3P_tRNA-Arg-TCT-4-1后NCI-H1975细胞的增殖活性为0.89 ± 0.03，明显高于对照组0.69 ± 0.02 (P < 0.05)；而降低3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达后NCI-H1975细胞的增殖活性为0.56 ± 0.02，明显低于对照组0.70 ± 0.02 (P < 0.05)。该实验结果表明3P_tRNA-Arg-TCT-4-1能促进肺癌细胞的增殖活性，有助于肿瘤的生长。

Figure 2. Proliferative activity of CCK-8. (A) After overexpression of 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1, proliferation activity of NCI-H1975 cells was increased (P< 0.05); (B) The proliferation activity of NCI-H19751 cells was decreased by decreasing the expression of 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 (P< 0.05)

图2. CCK-8增殖活性实验。(A) 过表达3P_tRNA-Arg-TCT-4-1后，NCI-H1975细胞增殖活性升高(P < 0.05)；(B) 降低3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达则NCI-H19751细胞增殖活性下降(P < 0.05)

3.4. 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达对肺腺癌患者生存预后的影响

3P_tRNA-Arg-TCT-4-1高表达组中位Overall survival生存时间为22个月(四分位区间4~44个月)，3P_tRNA-Arg-TCT-4-1正常或阴性表达组中位Overall survival为31个月(四分位区间9~50个月)。正常或阴性表达组Overall survival明显长于高表达组(χ2 = 5.885, P = 0.002 < 0.05)，见图3。

Figure 3. Survival curve of 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1 expression and prognosis in patients with LUCA

图3. 3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达与肺腺癌患者预后的生存曲线图

4. 讨论

肺癌已成为世界范围内的致命恶性肿瘤，主要组织病理学亚型为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，而非小细胞肺癌的80%以上[1] [2]。肺腺癌(LUAD)是最常见的非小细胞肺癌亚型，5年生存率约为15% [1]。目前虽然在治疗肺癌上取得了很大的进展，其复发和耐药仍然没有得到有效控制，因此，探索新的诊断和治疗方法至关重要。

越来越多的证据表明，TRDFs调节细胞内基因转录、蛋白质翻译和表观遗传[7]-[11]。tRFs参与多种分子调控机制，如靶基因的miRNA样沉默、RNA加工和降解、组蛋白修饰、核糖体组装和活性以及未折叠蛋白反应[12] [13]。此外，TRDF在包括癌症等许多疾病中发挥关键作用[8]-[11]。例如，Ma等人[14]发现tRF-20-S998LO9D在乳腺浸润性癌、头颈部鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、肺鳞状细胞癌、和子宫内膜癌等多种癌症中均有高表达。抑制tRF-20-S998LO9D导致乳腺癌(MCF-7)和肺鳞癌(sk-mes1)细胞的细胞增殖减少。在多种癌症中，tRF-20-S998LO9D升高预示预后不良。

在不同类型的肺癌中也有TRDFs的表达异常，例如，与健康个体相比，非小细胞肺癌(NSCLC)患者和早期NSCLC患者外泌体中tRF-Leu-TAA-005、tRF-Asn-GTT-010、tRF-Ala-AGC-036、tRF-Lys-CTT-049和tRF-Trp-CCA-057的表达水平显著降低；该结果这表明这五种外泌体TRDFs可能是NSCLC的有希望的诊断生物标志物[15]。Shi [16]等人通过分析三对LUAD组织中的TRDFs表达，发现tRF-29-79在LUAD中下调，而tRF-29-79的下调与较差的预后相关。功能上tRF-29-79可抑制LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭。机制上tRF-29-79与RNA结合蛋白PTBP1相互作用，促进PTBP1从细胞核到细胞质的运输，从而调节SLC1A5 pre-mRNA的3'非翻译区(UTR)的选择性剪接，从而发挥其抗癌功能。Magesh [17]等人研究发现在吸烟诱导的肺鳞状细胞癌(LUSC)和非吸烟诱导的LUSC原发肿瘤样本中，TRDFs表达差异很大，表明烟草烟雾可能调节TRDFs表达，促进癌症的发生和发展。本实验通过分析NCBI在线数据集GSE83527、GSE62182和GSE110907得到LUAC中差异表达的tRNA衍生片段，其中3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达升高，然后对3P_tRNA-Arg-TCT-4-1在LUCA中的具体作用还尚未明了，这就是本文的研究所在。

本研究qRT-PCR实验提示在肺腺癌组织中3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达水平高于癌旁正常肺组织，提示3P_tRNA-Arg-TCT-4-1在肺腺癌的发生发展过程中起着促癌基因的作用。也说明了3P_tRNA-Arg-TCT-4-1作为TRDFs的一员，在肺腺癌的发生发展中发挥了重要的作用和功能。分析3P_tRNA-Arg-TCT-4-1与临床参数的关系上，统计分析发现高表达的3P_tRNA-Arg-TCT-4-1与肺腺癌的肿瘤直径大小、分化程度和生存预后密切相关，而与患者年龄、性别、淋巴结转移和TNM分期之间无相关性。这一结果表明，3P_tRNA-Arg-TCT-4-1参与了肺腺癌细胞的增殖和分化，即3P_tRNA-Arg-TCT-4-1在肺腺癌中表达水平越高，肿瘤细胞分化越低，越能生长增殖，且患者预后不佳，进一步说明3P_tRNA-Arg-TCT-4-1是一个促癌基因，可成为肺腺癌增殖和预后判断的生物标志物。TNM分期中的T代表原发肿瘤的大小和浸润深度，但本研究结果显示3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达与肺腺癌的TNM分期无关，但P = 0.056，也接近有统计学意义，这可能是本研究标本数量偏少有关，今后会进一步加大样本数目研究。另外通过CCK-8实验表明过表达3P_tRNA-Arg-TCT-4-1后，细胞的增殖活性升高；降低3P_tRNA-Arg-TCT-4-1表达后，细胞的增殖活性下降，再次提示3P_tRNA-Arg-TCT-4-1促进肺腺癌细胞的增殖活性，参与了肺腺癌的生长过程。

5. 结论

综上所述，3P_tRNA-Arg-TCT-4-1在肺腺癌组织中表达水平上调，与LUCA的肿瘤大小和生存预后密切相关；可以作为LUCA生长的标志物和预后判断的指标。本研究探讨了3P_tRNA-Arg-TCT-4-1在肺腺癌增殖过程和预后判断中的作用，为今后诊治生长旺盛的肺腺癌提供新策略。

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