1. 引言
骨质疏松症(Osteoporosis, OP)是一种由多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病[1]。糖皮质激素(Glucocorticoid, GC)的大量使用是导致继发性骨质疏松症的重要原因之一。现有研究证实，骨吸收与骨形成失衡是导致OP的主要病理机制[2]。双磷酸盐是治疗糖皮质性骨质疏松症的常规用药，可有效抑制骨吸收，但其对骨吸收形成抑制，同时也会对骨正常矿物化造成影响，增加类骨质，加大骨折风险[3]。
构成骨胶原纤维的蛋白质为Ⅰ型胶原蛋白[4]。仇雷雷等的研究表明，水母胶原蛋白(Jellyfish collagen, JC)与牛Ⅰ型胶原蛋白相似，符合Ⅰ型胶原蛋白特征[5]。胶原纤维在骨组织中起到结构性的网架作用，纤维的排列方向有一定规律，对于压力有一定的抵抗作用，由于胶原纤维的存在，使骨的硬度加强。胶原蛋白外用能清除体内自由基，起到多方面抗氧化的作用。超氧化物歧化酶(Super oxide dismutase, SOD)是一种重要的抗氧化酶，可以防止氧化应激引起的细胞损伤[6]。氧化应激是引起OP的重要危险因素[7]，或许可以通过内服水母胶原联合超氧化物歧化酶(Jellyfish collagen and super oxide dismutase, JCSOD)降低氧化应激的方式改善OP。
本实验采用JCSOD内服的方法，通过病理组织学和骨胶原纤维形态学检测，分析各组小鼠体内ROS和骨特异性碱性磷酸酶(Bone specific alkaline phosphatase, BALP)的含量，探讨JCSOD对OP的可能机制，为日常防治OP提供基础实验依据。
2. 材料和方法
2.1. 实验动物
选取雌性3月龄SPF级C57BL/6小鼠30只，体质量为(20 ± 2) g。实验动物使用许可证号：SCXK (粤) 2022~0002。质量检测单位为广东省医学实验动物中心。通过了贵州中医药大学动物伦理审查会审查，编号为2024018。
2.2. 药品试剂及器材
水母胶原蛋白冻干粉(美尔健生物技术有限公司)，深海超氧化物歧化酶SOD (中科欣扬生物科技有限公司)，地塞米松磷酸钠注射液，生理盐水，蒸馏水，小鼠BALP的ELISA检测试剂盒，小鼠ROS的ELISA检测试剂盒，酶标仪(450 nm)，高精度加样器及枪头，37℃恒温箱，苏木精–伊红染色法(HE)试剂盒、Masson三色染色试剂盒(Solarbio)，正置显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)，石蜡切片机(苏州工业园区汇光科技有限公司)，摊片烤片机(湖北康强医疗器械有限公司)，生物组织包埋机–冷冻机、生物组织包埋机(孝感奥华医疗科技有限公司)，自动组织脱水机(湖北康强医疗器械有限公司)，无菌PBS缓冲液。
2.3. 实验方法
2.3.1. 分组、造模和灌胃
雌性3月龄SPF级C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，空白对照组(Normalcontrol, NC)、模型组(Dexamethasone, Dex)、JCSOD低剂量组(JCSOD-L)、JCSOD高剂量组(JCSOD-H)、水母胶原组(JC)、氨糖软骨素钙片组(Amino sugar chondroitin calcium tablets, ACc)，每组5只。其中JCSOD-L、JCSOD-H、JC、ACc为药物组。NC组腹腔注射生理盐水0.02 mL/d，蒸馏水灌胃0.05 mL/d。Dex组及药物组腹腔注射地塞米松造模2 mg/kg/d [8]。药物组分别以JCSOD (200 mg/kg/d)、JCSOD (400 mg/kg/d)、JC (200 mg/kg/d)、Acc (70 mg/kg/d)灌胃。以上干预方法在同一天进行，持续60天。
2.3.2. 取材
造模与灌胃结束后，断食断水12 h，于小鼠眼球静脉丛取血，充分取血后，迅速分离出小鼠双侧股骨和胫骨，剔除骨组织周围肌肉结缔组织。将胫骨样本放于−80℃冰箱冻存。
2.3.3. 切片样本制备
双侧股骨经过48小时的4%多聚甲醛溶液固定处理后，进行4周的EDTA脱钙，以大头针可轻易刺入骨组织为标准判断脱钙是否完成，脱钙成功后将双侧股骨放入包埋盒中，流水冲洗24 h后，进行脱水、透明、浸蜡操作，取出组织，包埋。
将已经包埋的股骨组织样本存放于−20℃的冷冻环境中，以便达到适宜的硬度切片。切片的厚度控制在3 μm。随后进行包埋、水浴展片、捞片的步骤，将切片平铺并粘贴于载玻片上。控片、展片，迅速进行烤片处理。烤干后，需放置于载片架上，随后置于40℃的恒温箱中1 h，以备后续使用。
2.3.4. 血清制备
充分采血完成后，静置30 min，离心(转速2500 G，时间为15 min)，吸取上层血清转移至1.5 mL清洁EP管中，放置于−80℃冰箱冻存备用。
2.4. 检测指标及方法
2.4.1. HE染色
经过常规的脱蜡至水的左侧股骨组织切片，稍水洗，采用苏木精液进行染色。使用1%盐酸酒精进行处理，再次水洗后，利用促蓝液进行返蓝处理，流水冲洗去除多余染色剂。之后，切片被0.5%伊红溶液染色，用蒸馏水洗涤，并通过梯度乙醇脱水，最后用二甲苯透明处理。封固步骤中，采用中性树胶。最后，利用显微镜对处理后的切片进行拍照记录。
2.4.2. Masson染色
将右侧股骨组织切片脱蜡至水，染色，分化、水洗，返蓝、水洗。染色、洗涤，梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。显微镜拍照，使用图像采集系统采集相关部位图像。
2.4.3. ELISA法血清BALP、骨组织ROS检测
组织匀浆，将双侧胫骨组织加入适量生理盐水捣碎，离心(转速3000 G，10分钟)，取上清，冻存于−20℃冰箱。检测前，分别将血清样本和胫骨匀浆液从冰箱取出，在室温下充分解冻。从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出所需板条。设置标准品孔和样本孔，分别按照试剂盒说明进行操作。在450 nm波长处测定各孔的OD值。
2.4.4. 统计学方法
实验数据采用SPSS 26和GraphPad prism 9软件分析，多组间比较采用单因素方差分析，以均值 ± 标准差(
)表示，P < 0.05表示差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. JCSOD对各组小鼠骨组织形态的影响
注：骨小梁被染为浅红色，骨髓组织呈红褐色或深蓝色。
Figure 1. HE staining of bone trabecula in epiphysis of mice in each group
图1. 各组小鼠骨骺端骨小梁HE染色情况
HE染色骨骺端显微镜拍照，结果显示：NC组，骨小梁致密，排列整齐，连接紧密；Dex组，骨小梁稀疏，变薄，有断裂，排列不规律；JCSOD-L组，骨小梁稀疏，排列不规律；JCSOD-H组，骨小梁较粗，骨小梁较为致密，但低于JC组；JC组，骨小梁明显增粗，致密整齐；ACc组，骨小梁稀疏，排列不规律。见图1。
3.2. JCSOD对各组小鼠骨胶原的影响
Masson染色结果显示：NC组，骨胶原着色深，纹理清晰，排列规律，无断裂；Dex组，骨胶原着色最浅，纹理不清晰，排列不规律，模糊成片；JCSOD-L组，骨胶原着色较浅，纹理不清晰，排列不规律；JCSOD-H组，骨胶原着色深，纹理清晰，但稍逊于JC组，排列规律，较少断裂；JC组，骨胶原着色深，纹理清晰，排列规律，较少断裂；ACc组，骨胶原着色深，排列较规律，较少断裂。见图2。
注：细胞核呈蓝灰色，胞浆、肌肉、红细胞呈红色，胶原纤维蛋白呈蓝色。
Figure 2. Masson staining of bone collagen in each group
图2. 各组小鼠骨胶原Masson染色情况
3.3. JCSOD对各组小鼠血清BALP的影响
Dex组BALP含量明显低于其余各组(P < 0.05)，而药物组含量均高于NC组(P < 0.05)。JC组含量低于其余药物组。ACc组与JCSOD-H组含量相似但低于JCSOD-L组。见表1 BALP (单位：ng/ml)。
Table 1. Comparison of serum BALP and ROS content in bone tissue of mice in each group (mean ± standard deviation)
表1. 各组小鼠血清BALP、骨组织ROS含量的比较(均值 ± 标准差)
组别 |
n |
BALP (单位：ng/ml) |
ROS (单位：pg/g) |
NC组 |
5 |
9.78 ± 0.69* |
9036.82 ± 414.17*# |
Dex组 |
5 |
7.84 ± 0.51 |
9732.3 ± 421.35 |
JCSOD-L组 |
5 |
14.07 ± 0.44*# |
6529.05 ± 463.24*# |
JCSOD-H组 |
5 |
13.1 ± 0.74*# |
7314.2 ± 411.15*# |
JC组 |
5 |
11.52 ± 1.02*# |
7763.49 ± 394.97*# |
ACc组 |
5 |
13.09 ± 0.59*# |
7290.21 ± 400.26*# |
注：*与Dex组比较，P < 0.05；#与NC组比，P < 0.05。
3.4. JCSOD对各组小鼠骨组织ROS的影响
Dex组ROS表达明显高于其余各组(P < 0.05)，而药物组表达均低于NC组(P < 0.05)。JCSOD-L组表达最低，JC组表达均高于其余药物组。见表1 ROS (单位：pg/g)。
4. 讨论
糖皮质激素(Glucocorticoid, GC)所致的骨质疏松症是继发性骨质疏松症的常见原因，发生率仅次于老年性骨质疏松症和绝经后骨质疏松症[9]。GC会抑制成骨细胞因子的产生，如胰岛素样生长因子I和骨的主要有机成分，即I型胶原蛋白；还会直接作用于成熟的破骨细胞，从而抑制其凋亡[10]。因此，骨形成被迅速地抑制，骨吸收大于骨形成。骨骼的生理状态下，其生长依赖于正常骨代谢，在骨形成阶段，骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，随即分泌出胶原纤维，新生成的胶原纤维和其他结构蛋白逐渐沉积形成骨基质，在适当的条件下，钙离子和磷酸盐会沉积在胶原纤维之间，形成矿化结晶，进而形成硬质骨组织。同时破骨细胞也同样被激活，分泌出相关酶原，使周围死骨被溶解，溶解过程中成骨细胞又迁移至此处，进一步形成新骨，以此维持动态平衡[11] [12]。
在骨基质中，胶原纤维起着支撑和结构性作用，使骨骼具有弹性和韧性。同时，无机盐类物质如羟基磷灰石等沉积在胶原纤维之间，形成矿化结构，增加了骨骼的硬度和抗压强度[13]。水母胶原具有促进骨细胞增殖和分化、促进骨细胞基质生成、提高骨组织生物相容性等优点。既往研究显示，将水母胶原应用于骨修复领域，可以促进骨细胞的黏附和增殖，有助于促进骨细胞的再生和骨组织的修复[14]。此外，水母胶原还可以模拟骨基质的微环境，提供细胞黏附的支撑，有利于骨细胞的定向生长和分化[15]。因此，水母胶原作为一种生物相容性良好的材料，在骨修复和骨再生领域具有广阔的应用前景。在骨细胞中，SOD有助于维持细胞内的氧化还原平衡，保护骨细胞免受氧化应激的影响[16]。SOD与骨密度呈正相关，在减少骨组织中的氧化损伤的同时，有助于维持骨密度和骨质的稳定性[17]。本实验使用内服JCSOD的方法，对进展中的骨质疏松症干预后，骨小梁排列整齐，胶原纤维纹理清晰，排列规律，HE染色和Masson染色均显示效果良好。
BALP的主要作用是水解磷酸酯键，从而促进骨骼中磷酸盐的沉积和矿化，有助于骨骼的形成和维持[18]。它作为一种骨细胞特异性标志物，主要存在于成熟骨细胞和成骨细胞表面，其含量表达水平可以反映成骨细胞的活性和骨形成情况[19] [20]。BALP表达水平的下降可能反映了骨细胞活性的降低和骨形成的减少，进而导致骨密度下降和骨质疏松症的发展。BALP水平与骨密度之间呈正相关，较高的BALP水平通常伴随较高的骨密度，这表明BALP的变化可以在一定程度上反映骨质状态[21]。本实验中JCSOD的干预使GC诱导的骨质疏松症小鼠血清中BALP的含量明显升高，提示JCSOD可以有效促进骨形成，从而减缓激素诱导的骨质疏松症小鼠的病情进展。
ROS是一种由氧气分子通过还原反应生成的自由基。这些自由基在细胞代谢和生物化学反应中产生，在正常生理状态下保持相对平衡，在过量积累时就会引起氧化应激[22]。骨髓间充质干细胞成骨分化障碍的原因之一就是ROS诱导线粒体损伤造成的[23]。研究显示，ROS抑制成骨细胞的增殖分化，刺激成骨细胞和骨髓基质细胞的RANKL表达，促进破骨细胞形成和分化，对骨质疏松的发生起着重要促进作用[24]。本实验在JCSOD药物干预后小鼠骨组织ROS表达量显著降低，提示JCSOD可通过降低氧化应激程度，减缓骨质疏松症的发展。
综上所述，JCSOD在防治激素诱导的骨质疏松症方面，能有效延控骨质疏松症的发病进程，维持骨小梁的组织架构，提高骨胶原纤维的染色深度，升高BALP骨代谢指标，抑制ROS的活性。治疗过程中未有小鼠发生意外死亡，说明口服JCSOD具有较高的安全性。不足之处在于本次实验检测指标和检测方法较少，缺乏其他相关指标的验证，不能从多方面论证JCSOD对骨质疏松症的作用。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。