H₂S在CdCl₂诱导拟南芥气孔关闭中的作用及其与NO的关系

The Role of Hydrogen Sulfide and Its Relationship with Nitric Oxide in Cadmium Chloride-Induced Stomatal Closure in Arabidopsis thaliana

摘要: 以拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型和突变体为材料，探讨硫化氢(H₂S)和一氧化氮(nitric oxide，NO)在氯化镉(CdCl₂)诱导气孔运动中的作用及其相互关系。结果显示，CdCl₂显著诱导拟南芥野生型气孔关闭、叶片H₂S合成和L-/D-半胱氨酸脱巯基酶(L-/D-CDes)活性升高，H₂S合成抑制剂显著抑制了以上效应；NO清除剂和合成抑制剂均能显著抑制CdCl₂诱导的野生型保卫细胞NO合成和气孔关闭。另外，CdCl₂处理不能诱导Atl-cdes、Atd-cdes、Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5突变体气孔显著关闭。此外，NO清除剂和合成抑制剂显著抑制了CdCl₂诱导的野生型H₂S含量和L-/D-CDes活性的增加，而H₂S合成抑制剂不能抑制野生型保卫细胞NO生成；CdCl₂不能升高Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5突变体叶片H₂S水平和L-/D-CDes活性，而CdCl₂能增强Atl-cdes和Atd-cdes突变体保卫细胞NO荧光水平。由此表明，NO介导的H₂S生成参与CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭，且在此过程中，L-和D-CDes负责H₂S的合成，NO由NOS和NR途径产生。

Abstract: The roles and interrelationship of hydrogen sulfide (H₂S) and nitric oxide (NO) in cadmium chloride (CdCl₂)-induced stomatal movement were investigated using the Arabidopsis thaliana wide-type and related mutants. The results showed that CdCl₂ induced stomatal closure, H₂S synthesis and L-/D-cysteine desulfhydrase (L-/D-CDes) activity increase of leaves in wild-type. H₂S synthesis inhibitors could significantly prohibited these effects. NO scavenger and synthesis inhibitors all significantly inhibited CdCl₂-caused NO production of guard cells and stomatal closure. Additionally, CdCl₂ couldn’t close stomata of Atl-cdes, Atd-cdes, Atnoa1, nia1-2, nia2-1 and nia1-2/ nia2-5 mutants. Furthermore, NO scavenger and synthesis inhibitors could prevent CdCl₂-caused increase of H₂S content and L-/D-CDes activity in wild-type, but H₂S synthesis inhibitors couldn’t inhibit CdCl₂-induced NO production of guard cells. CdCl₂ couldn’t increase H₂S content and L-/D-CDes activity in Atnoa1, nia1-2, nia2-1 and nia1-2/nia2-5 mutants, but CdCl₂ intensified NO fluoresence levels in Atl-cdes and Atd-cdes mutants’ guard cells. From these results we concluded that NO-mediated H₂S synthesis participated in CdCl₂-induced stomatal closure in A. thaliana, L- and D-CDes are responsible for H₂S synthesis and NO was sourced from NOS and NR pathways in the physiological process.

1. 引言

硫化氢(hydrogen sulfide, H₂S)是一种无色、有臭鸡蛋味的有毒气体。研究表明，H₂S参与调节植物的许多生理过程[1]-[3]。H₂S还可以缓解各种非生物胁迫如盐胁迫[4]、干旱[5]和重金属[6]对植物的伤害。另外，H₂S被证明参与乙烯、黑暗和CdCl₂等诱导的气孔关闭[7]-[9]。

一氧化氮(nitricoxide, NO)是一种高度活跃的水合脂溶性气体信号分子。研究发现，NO参与调节哺乳动物的很多生理过程[10] [11]。NO在植物的很多生理过程中也发挥重要作用，如种子萌发[12]、植物的衰老[13]和气孔运动[14] [15]等。另外，NO还参与植物对干旱、盐胁迫和热害等非生物胁迫的响应[16]-[18]。大量研究表明，NO介导ABA、UV-B和油菜素内酯等诱导的气孔运动[14] [19] [20]。

目前已有研究表明，H₂S参与CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭过程[9] [21]。然而，NO是否参与CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭还不清楚；另外，在此生理过程中H₂S与NO之间的相互作用也未见报道。为此，本文研究H₂S和NO在CdCl₂诱导拟南芥气孔运动信号转导过程中的相互关系，为进一步阐明CdCl₂调控植物气孔运动的信号转导机制积累资料。

2. 材料与方法

2.1. 材料与试剂

供试材料为拟南芥野生型(Col-0)、类NO合酶(NOS)基因突变体Atnoa1、硝酸还原酶(NR)基因突变体nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5、L-/D-半胱氨酸脱巯基酶缺失突变体Atd-cdes和Atl-cdes为材料。Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5突变体由贺军民教授(陕西师范大学)惠赠，拟南芥野生型(Col-0)、Atd-cdes和Atl-cdes突变体均购自诺丁汉拟南芥储存中心(Nottingham Arabidopsis Stock Centre, NASC, UK)。材料培养参照黄丽萍(2023)所述方法。选取生长4-5周完全展开的野生型及各突变体莲座叶作为实验材料。以下处理条件均为：光照强度为(100 μmol·m⁻²·s⁻¹)，温度为22℃ ± 2℃，处理时间为3 h。

NO特异性荧光探针(4,5-diaminofluorescein diacetate, DAF-2DA)、NO清除剂2-4,4,5,5-苯-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物[2-(4-carboxyenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxidepotassium salt, cPTIO]、NOS抑制剂N_ω-硝基-L-精氨酸-甲酯(N_ω-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)、NR抑制剂钨酸钠(sodium tungstate dehydrate, Na₂WO₄)、H₂S氨氧基乙酸(aminooxyacetic acid, AOA)和羟胺(hydroxylamine, NH₂OH)、二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)、L-半胱氨酸(L-cysteine, L-Cys)、D-半胱氨酸(D-cysteine, D-Cys)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)和2-(N-吗啡啉)乙烷磺酸[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, MES]均购自Sigma-Aldrich公司(St Louis, MO, USA)；其他试剂均为国产分析纯。

2.2. 气孔开度的测定

气孔开度测定参考McAinsh等人[22]描述的方法并稍作修改。撕取叶片下表皮，用刷子刷掉叶肉细胞，置于MES/KCl缓冲液(10 mmol·L⁻¹ MES，50 mmol·L⁻¹ KCl, 100 µmol·L⁻¹ CaCl₂, pH 6.15)中光照3 h使气孔开放，然后表皮条用于以下实验。为了研究CdCl₂对野生型气孔开度的影响，表皮条分别用含有0、100、200、300和400 µmol·L⁻¹ CdCl₂的MES/KCl缓冲液处理1 h、2 h和3 h，然后用装有目镜测微尺的光学显微镜测定气孔开度；为了研究CdCl₂对气孔的效应是否可以恢复，先将表皮条分别用含有0、100、200、300和400 µmol·L⁻¹ CdCl₂的MES/KCl缓冲液处理3 h，然后将表皮条放到MES/KCl缓冲液中再恢复处理3 h，然后测定气孔开度；为了研究H₂S合成抑制剂及NO清除剂和合成抑制剂对CdCl₂诱导野生型气孔关闭的影响，表皮条分别用MES/KCl缓冲液单独或含有300 µmol∙L⁻¹ CdCl₂、0.4 mmol·L⁻¹ AOA、0.4 mmol·L⁻¹ NH₂OH、0.4 mmol·L⁻¹ C₃H₃KO₃ + 0.4 mmol·L⁻¹ NH₃、200 µmol·L⁻¹ c-PTIO、25 µmol·L⁻¹ L-NAME、100 µmol·L⁻¹ Na₂WO₄及300 µmol∙L⁻¹ CdCl₂分别与H₂S合成抑制剂及NO清除剂和合成抑制剂混合液的MES/KCl缓冲液处理3 h，然后测定气孔开度；为了研究CdCl₂对野生型和突变体Atl-cdes、Atd-cdes、Atnoa1、nia1-2、nia2-5和nia1-2/nia2-5气孔的效应，野生型和以上各突变体的表皮条分别用不含或含有300 µmol∙L⁻¹ CdCl₂的MES/KCl缓冲液处理3 h，然后测定气孔开度。每个处理至少重复三次，最终数据为三次测量所得数据的平均值 ± 标准误差(n = 90)。

2.3. H₂S含量的测定

H₂S含量的测定采用亚甲基蓝法[23] [24]，具体步骤参考黄丽萍[25]的方法。在研究H₂S合成抑制剂及NO清除剂和合成抑制剂对CdCl₂诱导的野生型叶片H₂S含量的影响及CdCl₂对野生型和突变体Atl-cdes、Atd-cdes、Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5叶片H₂S含量的影响时，叶片处理方法与气孔开度测定部分的处理相同，处理结束后，测定H₂S含量。每个处理至少重复三次，最终数据为三次测量所得数据的平均值 ± 标准误差(n = 9)。

2.4. L-/D-CDes活性的测定

L-/D-CDes活性的测定参照侯智慧等[24]和Riemenschneider等[26]的方法并稍作修改，具体步骤参考黄丽萍[25]的方法。叶片中L-/D-CDes活性测定前，叶片的处理方法与H₂S含量测定部分的相同。每个处理至少重复三次，最终数据为三次测量所得数据的平均值 ± 标准误差(n = 9)。

2.5. 保卫细胞NO水平的测定

保卫细胞NO水平检测借助于特异性荧光探针DAF-2DA，参照Kojima等[27]的方法并稍加修改，具体步骤参考黄丽萍[25]的方法。为了检测NO清除剂和合成抑制剂对CdCl₂诱导野生型保卫细胞NO水平的影响，表皮条分别用MES/KCl缓冲液单独或含有300 µmol∙L⁻¹ CdCl₂、0.4 mmol·L⁻¹ AOA、0.4 mmol·L⁻¹ NH₂OH、0.4 mmol·L⁻¹ C₃H₃KO₃ + 0.4 mmol·L⁻¹ NH₃、200 µmol·L⁻¹ c-PTIO、25 µmol·L⁻¹ L-NAME、100 µmol·L⁻¹ Na₂WO₄及300 µmol∙L⁻¹ CdCl₂分别与H₂S合成抑制剂及NO清除剂和合成抑制剂混合液的MES/KCl缓冲液处理3 h，处理结束后立即用含有50 μmol·L⁻¹ H₂DCF-DA的Tris-KCl缓冲液(10 mmol·L⁻¹ Tris, 50 mmol·L⁻¹ KCl, pH 7.2) 25℃ ± 2℃避光孵育10 min，多余的探针用Tris-KCl缓冲液漂洗3-5次，然后用荧光显微镜(Olympus BX53, U-RFLT50, JAPAN)检测NO并拍照；为了检测CdCl₂对野生型和突变体Atl-cdes、Atd-cdes、Atnoa1、nia1-2、nia2-5和nia1-2/nia2-5保卫细胞NO水平的效应，野生型和以上各突变体的表皮条分别用不含或含有300 µmol∙L⁻¹ CdCl₂的MES/KCl缓冲液处理3 h，处理结束后立即用含有10 μmol·L^–1 DAF-2DA的Tris-KCl缓冲液25℃ ± 2℃避光孵育30 min，多余的探针用Tris-KCl缓冲液漂洗3-5次，然后用荧光显微镜检测NO并拍照。检测条件为：激发波长为450~490 nm，发射波长为520~560 nm。利用Photoshop 7.0 (Adobe, San Jose, CA, USA)对显微照片的整个气孔区进行处理和分析。每个处理至少重复3次。

2.6. 数据统计

试验中每个处理3次重复，在SPSS 17.0进行数据整理与分析，进行描述统计分析得出不同处理组的平均值、标准差等基本情况，在满足方差齐性和正态分布的前提下，进行描述统计分析和比较均值下的单因素ANOVA检验得到平均值、标准误差以及数据之间存在的显著性，当P值小于0.05时，认为数据间存在显著性差异并用不同字母表示，数值以平均值 ± 标准误差表示，用Origin 6.1软件(Microcal Software, Nothampton, MA, USA)绘制柱形图；用Photoshop 7.0制作图版。

3. 结果与分析

3.1. CdCl₂对拟南芥气孔运动的影响

为了探明CdCl₂是否影响拟南芥气孔运动，检测了不同浓度CdCl₂ (0、100、200、300和400 µmol·L⁻¹)对野生型拟南芥气孔开度的效应。图1(A)结果显示，CdCl₂能诱导野生型气孔关闭，随着Cd²⁺浓度的增加，气孔开度逐渐减小，CdCl₂对气孔关闭具有剂量和时间依赖效应。300 µmol·L⁻¹ CdCl₂处理3 h诱导气孔关闭的效果最佳。图1(B)结果表明，CdCl₂诱导气孔关闭的效应具有可逆性。

3.2. H₂S参与CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭

为探明H₂S是否是CdCl₂诱导拟南芥气孔关闭过程中的重要信号成分，检测了H₂S合成抑制剂AOA、NH₂OH与C₃H₃KO₃ + NH₃(L-/D-CDes催化反应产物)对CdCl₂诱导野生型气孔关闭的效应及CdCl₂对突变体Atl-cdes和Atd-cdes气孔的影响。由图2(A)可知，CdCl₂处理显著诱导拟南芥气孔关闭，AOA、NH₂OH和C₃H₃KO₃ + NH₃均可不同程度地抑制CdCl₂诱导的气孔关闭，而AOA、NH₂OH和C₃H₃KO₃ + NH₃单独处理对气孔开度并无明显影响。图2(B)显示，与野生型相比，CdCl₂未能显著关闭Atl-cdes和Atd-cdes突变体的气孔。由以上数据可以得出，H₂S可能是CdCl₂诱导拟南芥气孔关闭过程中的重要信号组分，H₂S的合成可能依赖于L-CDes和D-CDes途径。

为进一步证明CdCl₂诱导气孔关闭过程中H₂S产生的具体酶学途径，测定了AOA、NH₂OH以及C₃H₃KO₃ + NH₃对CdCl₂诱导野生型叶片H₂S含量和L-/D-CDes活性变化的影响。结果显示，CdCl₂处理后叶片H₂S含量和L-/D-CDes活性升高，而AOA、NH₂OH以及C₃H₃KO₃ + NH₃可以显著逆转CdCl₂的效应(图3(A)~(C))。以上数据表明，L-/D-CDes催化合成的H₂S参与CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭过程。

注：图中不同小写字母表示不同处理间有显著性差异(P < 0.05)，下图同。

Figure 1. Effects of CdCl₂ on stomatal movement in wild-type A. thaliana

图1. CdCl₂对野生型拟南芥气孔运动的影响

Figure 2. Effects of H₂S synthesis inhibitors on CdCl₂-triggered stomatal closure in wild-type (A) and effects of CdCl₂ on stomal aperture in Atl-cdes and Atd-cdes mutants (B)

图2. H₂S合成抑制剂对CdCl₂诱导拟南芥野生型(Col-0)气孔关闭的影响(A)和CdCl₂对Atl-cdes和Atd-cdes突变体气孔开度的效应(B)

3.3. NO参与CdCl₂调控的拟南芥气孔关闭

为了探明NO是否参与CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭过程，检测了NO清除剂c-PTIO、硝酸还原酶(NR)抑制剂钨酸钠(Na₂WO₄)和一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME对CdCl₂诱导野生型气孔关闭效应。图4(A)显示CdCl₂显著诱导野生型气孔关闭，c-PTIO、Na₂WO₄和L-NAME均能明显抑制以上效应，而c-PTIO、Na₂WO₄和L-NAME单独处理对气孔开度无显著效应。另外，CdCl₂处理不能诱导Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/2-5突变体气孔关闭(图4(B))。由此推测，NO可能参与CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭，且此过程中NO的产生由NR和NOS负责合成。

为进一步证明NO参与CdCl₂诱导的气孔关闭过程，检测了c-PTIO、Na₂WO₄和L-NAME与CdCl₂复合处理对野生型保卫细胞NO水平的影响。结果表明，CdCl₂能显著促进野生型保卫细胞NO合成(图5(A)、图5(B))，而c-PTIO、Na₂WO₄和L-NAME能阻断CdCl₂诱导保卫细胞NO合成的效应(图5(C)~(E))。此外，CdCl₂未能诱导Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5突变体保卫细胞NO合成。由此可以证实，在CdCl₂诱导拟南芥气孔关闭过程中，NO是由NR和NOS催化产生，Atnoa1、Nia1和Nia2均参与NO的生成。

Figure 3. Effects of H₂S synthesis inhibitors on CdCl₂-caused H₂S synthesis (A) and L-/D-CDes activity increase of leaves in wild-type (Co1-0) ((B), (C))

图3. H₂S合成抑制剂对CdCl₂诱导的野生型(Co1-0)叶片H₂S合成(A)和L-/D-CDes活性升高的影响((B), (C))

Figure 4. Effects of NO scavenger and synthesis inhibitors on CdCl₂-triggered stomatal closure in wild-type (A) and effects of CdCl₂ on stomatal movemen in Atnoa1, nia1-2, nia2-1 and nia1-2/2-5 mutants (B)

图4. NO清除剂和合成抑制剂对CdCl₂诱导野生型气孔关闭的影响(A)和CdCl₂对Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/2-5突变体气孔运动的效应(B)

注：离体表皮条按如下方法处理：(A) MES/KCl缓冲液单独处理，或含(B) 300 µmol·L⁻¹ CdCl₂、(C) 300 µmol·L⁻¹ CdCl₂ + 200 µmol·L⁻¹ c-PTIO、(D) 300 µmol·L⁻¹ CdCl₂ + 25 µmol·L⁻¹ L-NAME和(E) 300 µmol·L⁻¹ CdCl₂ + 100 µmol·L⁻¹ Na₂WO₄的MES/KCl缓冲液；(F-I) 将撕取的Atnoa1, nia1-2, nia2-1和nia1-2/2-5突变体的表皮条分别用300 µmol·L⁻¹ CdCl₂处理3 h，然后在暗中立即用含10 µmol·L⁻¹ DAF-2DA的Tris-KCl缓冲液孵育30 min，Tris-KCl缓冲液漂洗3~5次，去除多余染料，立即用荧光显微镜观察并拍照；(J) 为图(A)-(I)的平均DAF-2荧光强度，数据来自三个重复实验的平均值 ± 标准误差(n = 9)；图(J)中不同小写字母表示不同处理间有显著性差异(P < 0.05)。

Figure 5. Effects of NO scavenger and synthesis inhibitors on CdCl₂-triggered NO production of guard cells in wild-type (A)-(E) and effects of CdCl₂ on NO production of guard cells in Atnoa1, nia1-2, nia2-1 and nia1-2/2-5 mutants (F)-(I)

图5. NO清除剂和合成抑制剂对CdCl₂诱导野生型保卫细胞NO生成的影响(A)-(E)和CdCl₂对Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/2-5突变体保卫细胞NO生成的影响(F)-(I)

3.4. H₂S和NO在CdCl₂诱导拟南芥气孔关闭中的相互关系

3.4.1. NO清除剂和合成抑制剂对CdCl₂诱导野生型叶片H₂S含量和L-/D-CDes的影响

以上结果已经证明，H₂S和NO都参与CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭过程，为进一步探明H₂S和NO的关系，检测了c-PTIO、Na₂WO₄和L-NAME对CdCl₂诱导野生型叶片H₂S合成和L-/D-CDes活性升高的影响。结果显示，与对照组相比，CdCl₂显著诱导叶片H₂S含量和L-/D-CDes活性升高，而c-PTIO、Na₂WO₄和L-NAME阻断了以上效应(图6(A)-(C))。以上结果暗示，在CdCl₂调控拟南芥气孔关闭过程中，NR途径和NOS途径合成的NO共同介导H₂S的合成，进而诱导拟南芥气孔关闭。

3.4.2. CdCl₂对Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5突变体叶片H₂S含量和L-/D-CDes活性的影响

为了进一步证实H₂S和NO的关系，检测了CdCl₂对Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5突变体叶片H₂S含量和L-/D-CDes活性的影响。结果显示，CdCl₂显著增加野生型叶片H₂S含量和L-/D-CDes活性，但此效应在Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5突变体中被阻断(图7(A)~(C))。由此推断，NR途径和NOS途径合成的NO均介导CdCl₂诱导的H₂S合成。

Figure 6. Effects of NO scavenger and synthesis inhibitors on CdCl₂-induced H₂S content (A) and L-/D-CDes avtivity ((B), (C)) of leaves in wild-type

图6. NO清除剂和合成抑制剂对CdCl₂诱导的野生型叶片H₂S含量(A)和L-/D-CDes活性的影响((B), (C))

Figure 7. Effects of CdCl₂ on H₂S content (A) and L-/D-CDes activity in Atnoa1, nia1-2, nia2-1 and nia1-2/nia2-5 mutants ((B), (C))

图7. CdCl₂对Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5突变体叶片H₂S含量(A)和L-/D-CDes活性的影响((B), (C))

3.4.3. H₂S合成抑制剂对CdCl₂诱导的野生型保卫细胞NO生成及CdCl₂对Atl-cdes和Atd-cdes突变体保卫细胞NO生成的影响

为了进一步证实NO位于H₂S的上游介导CdCl₂诱导的气孔关闭，用H₂S合成抑制剂分别与CdCl₂复合处理，检测野生型保卫细胞NO水平，并检测了CdCl₂对Atl-cdes和Atd-cdes突变体保卫细胞NO产生的影响。结果显示，CdCl₂处理后野生型保卫细胞DAF-2荧光比对照组显著增强(图8(A)、图8(B))，而H₂S合成抑制剂AOA、NH₂OH和C₃H₃KO₃ + NH₃不能抑制CdCl₂诱导的DAF-2荧光增强(图8(C)-(E))。另外，CdCl₂对Atl-cdes和Atd-cdes突变体保卫细胞DAF-2荧光的增强效果与野生型相同(图8(F)，图8(G))。以上结果进一步证实了NO确实位于H₂S上游介导了CdCl₂诱导拟南芥气孔关闭过程的结论。

4. 讨论

镉是一种毒性很强的重金属元素，容易被植物根系吸收并运输到植物的地上部分，从而影响植物生长发育和很多生理过程。研究表明，CdCl₂可以诱导植物气孔关闭[9] [21]。然而，CdCl₂诱导植物气孔运动过程中的信号转导机制还不清楚，因此，本文研究了CdCl₂对拟南芥气孔运动的效应。结果显示，CdCl₂以浓度和时间依赖效应诱导拟南芥气孔关闭，此结果与Ma等[9]在绿豆中的研究结果一致；CdCl₂处理的最适浓度和最佳时间分别是300 µmol·L⁻¹和3 h (图1)，此结果与乔增杰等[21]在拟南芥中的研究结果略有差异，此差异的具体原因还需要进一步的研究。

H₂S作为信号分子，在植物的很多生理过程如种子萌发、光合作用和气孔运动等方面发挥重要作用[1] [2] [28]。另外，H₂S能缓解干旱[3]、低温[29]和重金属[30]等非生物胁迫对植物的伤害。大量数据表明，H₂S在CdCl₂、油菜素内酯和ABA等诱导的气孔关闭过程中发挥作用[2] [9] [21] [31]。本研究结果显示，CdCl₂能诱导野生型拟南芥气孔关闭、叶片H₂S含量增加和L-/D-CDes活性增强(图2(A)，图3)，而CdCl₂诱导的以上效应被H₂S合成抑制剂AOA、NH₂OH及C₃H₃KO₃ + NH₃显著逆转；此外，H₂S合成突变体Atl-cdes和Atd-cdes对CdCl₂的敏感性降低，CdCl₂未能关闭Atl-cdes和Atd-cdes突变体的气孔(图2(A))。由以上数据可得，H₂S参与CdCl₂调控的拟南芥气孔关闭过程，H₂S主要是通过L-/D-CDes合成的，AtL-CDes和AtD-CDes正调控CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭，此结果与乔增杰等[21]的研究结果略有差异，具体原因有待进一步研究。

大量研究表明，NO作为植物的内源性信号分子，广泛参与调节植物体内的许多生理过程[32]。Liao等[33]报道，NO可以缓解干旱胁迫对万金菊的伤害。另有研究表明，外源NO可以增加莴苣的耐盐性[17]。

注：离体表皮条按如下方法光照处理3 h：(A) MES/KCl缓冲液单独处理，或含(B) 300 µmol·L⁻¹ CdCl₂、(C) 300 µmol·L⁻¹ CdCl₂ + 0.4 mmol·L⁻¹AOA、(D) 300 µmol·L⁻¹ CdCl₂ + 0.4 mmol·L⁻¹ NH₂OH和(E) 300 µmol·L⁻¹ CdCl₂ + 0.4 mmol·L⁻¹ C₃H₃KO₃ + NH₃的MES/KCl缓冲液；(F)-(G) 将撕取的Atl-cdes和Atd-cdes突变体的表皮条分别用300 µmol·L⁻¹ CdCl₂处理3 h，然后在暗中立即用含10 µmol·L⁻¹ DAF-2DA的Tris-KCl缓冲液孵育30 min，Tris-KCl缓冲液漂洗3~5次，去除多余染料，立即用荧光显微镜观察NO荧光并拍照；(H) 为图(A)-(G)的平均DAF-2荧光强度，数据来自三个重复实验的平均值±标准误差(n = 9)；图(H)中不同小写字母表示不同处理间有显著性差异(P < 0.05)

Figure 8. Effects of H₂S synthesis inhibitors on CdCl₂-induced NO production of guard cells in wild-type (A)-(E) and CdCl₂ on NO production of guard cells in Atl-cdes and Atd-cdes mutants (F)-(G)

图8. H₂S合成抑制剂对CdCl₂诱导的野生型保卫细胞NO生成的影响(A)-(E)和CdCl₂对Atl-cdes和Atd-cdes突变体保卫细胞NO生成的影响(F)-(G)

硝酸还原酶途径产生的NO参与ABA诱导的拟南芥气孔运动[34]。NOS途径产生的NO参与UV-B诱导的蚕豆气孔关闭[19]。NO还参与油菜素内酯和乙烯诱导的气孔关闭[20] [35] [36]。到目前为止，NO是否介导CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭尚不清楚。本研究结果显示，c-PTIO、Na₂WO₄和L-NAME均能显著抑制CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭和保卫细胞DAF-2荧光增强(图4(A)，图5(A)~(E)和图5(J))；另外，与野生型相比，CdCl₂不能显著诱导Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5突变体气孔关闭和保卫细胞DAF-2荧光增强(图4(B)，图5(F)~(J))。以上数据表明，NO参与CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭过程，NO由NOS和NR途径催化产生，Atnoa1、Nia1和Nia2共同负责NO的生成。

有研究显示，NO和H₂S共同调节了动物的某些生理过程，如二者对平滑肌细胞的作用具有协同性[37]。在植物中，H₂S与NO相互作用参与调节很多生理过程[38]。H₂S通过诱导紫花苜蓿内源NO合成来提高其抗盐能力[39]。NO位于H₂S上游参与乙烯[35]和油菜素内酯[36]诱导的气孔关闭。NO位于H₂S的下游参与ABA诱导的气孔关闭[40]。Ma等(2019)[9]报道，H₂O₂介导的H₂S生成参与调控CdCl₂诱导的绿豆气孔关闭。然而，在CdCl₂诱导拟南芥气孔关闭过程中，H₂S和NO之间的相互关系还不清楚。本研究结果显示，CdCl₂能显著提高野生型叶片H₂S含量和L-/D-CDes活性，但以上效应被c-PTIO、Na₂WO₄和L-NAME显著抑制(图6(A)~(C))；而且，CdCl₂不能使Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5突变体叶片H₂S含量和L-/D-CDes活性提高(图7(A)~(C))。另外，CdCl₂使野生型保卫细胞DAF-2荧光显著增强(图8(A) &图8(B))，而AOA、NH₂OH及C₃H₃KO₃ + NH₃未能减弱CdCl₂诱导的保卫细胞DAF-2荧光强度(图8(C)~(E))，且Atl-cdes和Atd-cdes突变体保卫细胞DAF-2荧光强度与野生型没有显著差异(图8(F)~(G))。由以上数据可知，NO介导的H₂S生成参与CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭过程。

综合以上数据可知，CdCl₂通过诱导NOS和NR催化的NO产生，NO通过增强L-/D-CDes活性，进一步促进H₂S合成，最终诱导拟南芥气孔关闭。本研究结果为进一步阐明CdCl₂调控植物气孔运动的信号转导机制提供理论基础。而其他信号分子如胞质pH、G蛋白、蛋白激酶和Ca²⁺等是否介导CdCl₂诱导的气孔关闭，以及H₂S与它们之间的相互关系都有待进一步研究。

5. 结论

CdCl₂诱导拟南芥气孔关闭最适浓度和最佳处理时间分别是300 µmol·L⁻¹和3 h；H₂S和NO均参与CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭，且NO作用于H₂S的上游发挥作用，L-CDes和D-CDes共同负责H₂S的产生，AtL-CDes和AtD-CDes正调控CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭，NO由NOS和NR途径催化产生，Atnoa1、Nia1和Nia2共同负责NO的生成。

基金项目

山西省自然科学基金项目(No.202203021211262)。