抗生素土霉素检测的最新研究进展

Latest Research Progress of Antibiotic Oxytetracycline Detection

摘要: 土霉素是一种广泛使用的重要抗生素。随着水产养殖和畜牧业的发展，土霉素(OTC)的使用量不断增加。在土霉素的应用过程中，约有30%~90%的抗生素以原药形式排放到环境中，特别是将动物粪便施用于农田时，大量抗生素的流入可能会破坏自然微生物生态系统，并通过食物链对人类健康构成潜在威胁。目前，土霉素的检测方法主要包括微生物抑制筛查法、免疫分析法、电化学法、荧光光谱法等传统方法。其中，利用荧光金属离子检测是一种重要应用，可通过研究金属离子与土霉素结合增强荧光效应，实现基于荧光猝灭、荧光恢复、荧光共振能量转移(FRET)和比率响应等机理的高灵敏检测。近年来，研究人员开发了诸如原子吸收/质谱联用技术等各种先进仪器分析方法用于土霉素检测，但这些方法往往操作复杂、成本较高。因此，学术界对于开发简单、低成本的土霉素检测新方法提出了迫切需求。我们期望通过总结归纳最新研究进展，有助于更好地监控和评估行业标准，并为相关领域的未来工作方向提供参考。

Abstract: Oxytetracycline is an important and widely used antibiotic. With the development of aquaculture and animal husbandry, the use of oxytetracycline (OTC) continues to increase. During the application process of oxytetracycline, about 30%~90% of the antibiotics are discharged into the environment in the form of original drugs. Especially when animal manure is applied to farmland, the inflow of large amounts of antibiotics may destroy the natural microbial ecosystem and cause potential threat to human health through the food chain. At present, the detection methods of oxytetracycline mainly include traditional methods such as microbial inhibition screening method, immunoassay method, electrochemical method, and fluorescence spectrometry. Among them, the detection of fluorescent metal ions is an important application. It can enhance the fluorescence effect by studying the combination of metal ions and oxytetracycline, and achieve high-performance detection based on mechanisms such as fluorescence quenching, fluorescence recovery, fluorescence resonance energy transfer (FRET) and ratio response. In recent years, researchers have developed various advanced instrumental analysis methods such as atomic absorption/mass spectrometry technology for the detection of oxytetracycline, but these methods are often complex to operate and costly. Therefore, the academic community has put forward an urgent need to develop simple, low-cost new methods for detecting oxytetracycline. We hope that by summarizing the latest research progress, it will help better monitor and evaluate industry standards and provide reference for future work directions in related fields.

1. 引言

土霉素(OTC)属于四环素科，是最常用的抗革兰阴性和革兰氏阳性微生物的兽用抗生素用于动物动物疾病的防治。广谱抗菌药物OTC通过结合30S核糖体亚基阻止细菌细胞内蛋白质的形成。在过去的几十年里，随着水产养殖和牲畜养殖的发展，抗生素土环素(OTC)的使用有所增加。据估计，全球每年使用10万至20万吨抗生素，超过四分之一在中国使用。土霉素(OTC)是最常用的四环素抗生素(TCs)之一，包括OTC、四环素(TC)和氯四环素(CTC) [1]。OTC是一种复杂的、两性离子的大分子有机化合物，由一个具有许多可电离性的复杂的四环体系组成官能团。土霉素结构式见图1。

Figure 1. Oxytetracycline structural formula

图1. 土霉素结构式

土霉素与TC具有相似的理化性质，具有三种不同的酸解离常数。OTC不仅广泛用于陆生牲畜，而且由于其可负担性、可用性和效率，也广泛用于水产养殖。作为动物饲料添加剂，OTC的含量可达到mg∙kg⁻¹的水平[2]。通过动物喂养，大多数OTC在动物肠道中吸收不良，牲畜生产中使用的抗生素中有30%~90%的抗生素以母体化合物的形式排出体外[3]。Shen et al. [4]发现粪便中OTC、TTC和CTC的浓度分别为2.98、3.00和4.62 mg∙kg⁻¹。在中国取样的三个奶牛场中，CTC占奶牛排出的抗生素总量的86% [5]。在水和土壤环境中也发现了OTC。它在牛奶、肉、果汁等食物中积累会对人体健康造成危险影响。

抗生素被用作牲畜、水产养殖和杀虫剂的生长促进剂。考虑到抗生素在动物饲料和人类食品中的进入积累会对健康[6]造成影响的潜在毒性风险，该主题是相关的。在欧洲禁止使用抗生素促进生长，而美国和加拿大仍然允许在农业中使用抗生素用于非治疗目的[7]。美国食品和药物管理局(FDA)的新规定正在努力减少食品[8]中的抗生素污染物。虽然过敏反应很少与抗生素有关，但在文献[9]中已经报道了由抗生素残留引起的肉类和水果。抗生素毒性作用的发生对胃肠道、皮肤、中枢神经系统都有负面影响，甚至在富含钙的器官如骨骼和牙齿的[10]中积累[11]。已经提出了几种模型来证明四环素类药物[12]的细胞毒性作用。据我们所知，四环素，特别是土霉素(OTC)和免疫系统之间可能的相互作用仍然缺乏，也没有充分解决以排除对人类和动物健康的可能毒性。在这方面，免疫系统在调节毒理学机制中获得了一个新的关键作用，该机制可能由摄入的食物衍生的四环素触发。免疫具有保护和保护机体免受疾病[12]-[15]影响的基本作用，也参与了抗自身免疫疾病和肿瘤[16]的稳态和健康维持。细胞毒性CD8⁺T淋巴细胞[9]和CD4⁺T Helper 1 (TH1) [17]反应的加重与炎症性疾病和自身免疫性疾病[18]相关。TH1活性主要基于干扰素–伽马(IFN)-γ的产生，它优化抗菌反应，促进CD8⁺T淋巴细胞活性，似乎也在触发自身免疫反应[19]，[20]中发挥重要作用。自然杀伤剂(NK)依赖性的IFN-γ分泌与自身免疫性[21]、[22]过敏性有关[23]，并可能在胃肠道[24]和血液系统疾病中起致病作用。TH2反应是基于多种细胞因子，包括白细胞介素(IL)-4，它们可导致体液免疫[25]的激活。值得注意的是，一些外部因素，如药物和化学物质，可以诱导自身免疫性疾病[26]-[30]的发展。此外，使用这些药物治疗炎症仍然不是决定性的，在某种程度上，一些兽药的滥用，包括四环素，它们对环境的全球影响可能具有重大意义。

世界卫生组织制定了控制活体动物和动物产品中土霉素(OTC)残留的相关法规，以保护公众健康。每日OTC摄入量应严格控制在0~30 μg/kg体重的范围内，某些水果如苹果、梨等的OTC最大允许残留量为350 ng/g。在动物体内，大部分摄入的抗生素会聚集在组织或排泄到环境中，只有少部分被代谢。据全球统计，每年约有2000吨OTC用于畜牧业和水产养殖业。由于OTC在动物源性食品和饮用水中的大规模应用，可能会对人类健康产生严重影响，如过敏反应、毒性作用和加剧抗生素耐药性。因此，人们日益关注抗生素使用不当带来的负面影响，迫切需要开发出高效便捷的方法，用于识别受污染食品中的OTC残留。目前，OTC的传感检测主要包括纳米材料荧光传感、分子印迹传感、生物分子识别传感。检测方法包括微生物抑制筛选法、免疫分析法、毛细管电泳(CE)、薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)等传统方法，以及安培法、荧光光谱法、电化学法等新兴方法。然而，微生物抑制法和酶联免疫吸附测定法存在灵敏度低、选择性差、操作繁琐等缺陷，难以满足快速高通量检测的需求。

2. 纳米材料荧光传感

随着水产养殖和牲畜养殖的发展，抗生素土环素(OTC)的使用有所增加。OTC不仅广泛用于陆生牲畜，而且由于其可负担性、可用性和效率，也广泛用于水产养殖。作为动物饲料添加剂，OTC的含量可达到mg∙kg⁻¹的水平。通过动物喂养，大多数OTC在动物肠道中吸收不良，牲畜生产中使用的抗生素中有30%~90%的抗生素以母体化合物的形式排出体外。OTC在动物源性食品和饮用水中的大规模应用，可能对人类的健康产生严重影响，如过敏反应、毒性作用和对抗生素的耐药性。由于土霉素污染的增加，以及环境污染的增加，监管机构实行了更严格的标准，近年来已经发展和优化了各种各样的分析方法。在最常见和最常用的技术中，高效液相色谱(HPLC)以其多功能性而突出。荧光探测器(FLD)或质谱仪(MS)也可用于土霉素的测定，提供高灵敏度检测方法。其他技术包括分子分光光度法、伏安法、毛细管电泳和发光法。

荧光检测技术是一种非常灵敏的检测技术。因此，荧光被广泛应用于免疫诊断、流式细胞术、光学显微镜、色谱、电泳和DNA测序[31]。根据具体的应用，限制灵敏度的范围可以从10³到10⁷荧光团。Hirschfeld首先指出，这些限制可以通过使用荧光检测方法来显著扩展，该方法记录单个分子通过紧密聚焦激光束[32]的通道，最近已经开发了几种实际的光子爆发检测方案[33]。各种含金属离子的功能材料在世界各地得到了广泛的应用，为我们的生活带来了极大的便利。然而，从这些材料中释放出来的金属离子对人类的健康和环境都是有害的。因此，这些金属离子的检测是研究人员和政府的迫切需要。研究人员已经开发了大量的传感金属离子的方法，包括光学方法，毛细管电泳，电化学方法、原子吸收光谱、电感耦合等离子体质谱等，可以提供令人满意的结果。然而，这些方法大多存在一些局限性，如复杂的处理、高成本的仪器和耗时的操作。因此，简单和低成本的检测金属离子的方法是非常理想的。荧光碳纳米颗粒(F-CNPs)作为一种新型碳纳米材料，由于其独特的化学惰性强、低光漂白、低毒性、生物相容性好、水溶性好、制备方便等特性，近年来引起了科学家的关注。然而，这些性质在有机染料或半导体量子中并没有发现点(量子点)。因此，F-CNP有望取代这些剧毒的半导体量子点。荧光碳纳米材料是2004年研究人员在用电弧放电法制备的单壁碳纳米管(SWCNTs)的纯化过程中偶然发现的。他们发现，由长SWCNTs氧化的短SWCNTs显示出荧光，这依赖于SWCNTs的大小。这一偶然的发现引起了人们的极大关注，并为F-CNP的制造提供了新的思路。F-CNPs在金属离子检测方面具有很大的前景，但在F-CNPs广泛应用于实际样品之前，仍存在一些挑战需要克服。首先，F-CNPs的荧光很容易受到检测介质的影响，因为矿物质、有机物和细菌的存在很容易引起荧光强度的波动。要提高F-CNP的稳健性，仍需要付出许多努力。由于大多数基于F-CNPs的金属离子探针都是荧光关闭的，这很容易受到检测环境的影响，因此迫切需要更多的基于F-CNPs的纳米传感器，具有荧光开启、FRET、比率响应等新的响应模式。新的检测策略，如比率检测、开启检测和FRET检测，仍然存在需要这样做是因为它们可以提高检测结果的准确性。F-CNPs在其他领域的实际应用有待进一步研究，因为大多数F-CNPs仅用于测定水样中的金属离子。大多数F-CNP仅用于测定金属离子。它们不能去除所检测到的有毒金属离子。设计基于F-CNPs的具有金属离子检测和去除双重功能的纳米传感器，对环境和人类健康具有重要意义。随着F-CNPs的快速发展，更强大的F-CNPs能在未来几年广泛应用于真实样品中，用于金属离子的荧光检测。土霉素荧光检测方法比较见表1。

Table 1. Comparison of fluorescence methods for detection of OTC

表1. 土霉素荧光检测方法比较

Sensing materials	Detection technique	Linear range (μM)	LOD (μM)	Sample	Ref
Iexonuclease I-assisted target recycling	Flu	0.02~21.7	0.015	Food	[34]
Piperazine modified C Odts	V Flu	0~10			[35]
Luminescent silicon-based nanoparticles	R Flu	0.2~20	0.18	Milk	[36]
Eu^3+ + oxytetracycline	Flu	0.3~3	0.3	Plant tissues	[37]
Ca^2+ + oxytetracycline	Flu		0.125	Water	[38]
CQDs (P-CQDs)	Flu	0~10			[39]

注：Flu：Fluorescent；LOD：Limit of detection；V Flu：Visual fluorescence method；R Flu：Ratiometric fluorescence method；CQDs (P-CQDs)：Piperazine modified C Odts。

Shengfeng Huang等人提出一种基于内切酶和外切酶辅助双循环扩增策略的超灵敏的多种抗生素检测电化学适体传感器。该方法的优势在于通过双重循环扩增策略实现了信号放大，从而提高了检测灵敏度。另外，只需更换相应的适体分子，就可扩展检测其他靶标分子，因此在食品安全领域检测多种抗生素残留具有潜在应用价值，为高灵敏检测小分子靶标提供了新的思路[34]。

Amirhossein Bahreyni等人建立了一种用于食品样品中土霉素(OTC)高灵敏度定量的荧光配体传感器。该方法将OTC适体与磁珠结合作为识别元件，OTC适体的互补链PicoGreen (PG)作为敏感的双链DNA (dsDNA)荧光染料。在样品中加入PG后，可测量弱荧光强度且灵敏度高，对几种抗生素也有较好的特异性。更重要的是，牛奶中OTC的回收率从96.46%至101.5%，表明所设计的传感器具有很大的可行性，并且具有用于实际样品中OTC分析的潜力[35]。

Na Xu等人报道了一锅水热合成由氨基丙基三乙氧基硅烷和抗坏血酸开始的氨基功能化的水分散发光硅基纳米粒子(SiNPs)。对极端pH值具有较高的耐受性和较高的离子强度，在紫外线照射下具有优异的光稳定性，并且可以将OTC抗生素与四环素(TCs)家族中具有类似结构的其他抗生素区分开来。这个新开发的方法被成功地用于测定牛奶中的OTC，并且观察到的回收率表明传感器可以作为检测食品中的OTC的有效工具[36]。

Farag Hijaz等人建立了一种基于其与铕络合的植物组织中OTC的荧光测定方法。此方法已成功地用于测定干注射树木叶片中OTC的含量。铕法所得结果与ELISA所得结果相似。系统评估了其性能后，证实了该方法的可靠性和实用性。该方法可用于植物/农产品中OTC残留的监测，对确保食品安全具有重要意义[37]。

Hongxia Chen等人报道了土霉素(OTC)作为钙离子(Ca²⁺)荧光探针的一个新应用，证明了它可以提供一种快速、高灵敏度和选择性的Ca²⁺检测方法。该方法避免了以往EDTA测定自来水中Ca²⁺的复杂性。OTC具有良好的可用性、稳定性和可操作性，进一步成功应用于实际环境中Ca²⁺的检测[38]。

Lei Yang通过胺基的保护/去保护策略，采用酰胺化反应将哌嗪基团引入到碳量子点(CQDs)表面，成功制备得到哌嗪修饰的CQDs (P-CQDs)。P-CQDs与OTC分子之间可能通过氢键和静电作用力发生结合，可实现对OTC浓度(0~10 μM范围内)的线性定量检测，提供了一种快速、便捷的OTC荧光检测新方法。该策略简单、绿色，检测快速便捷，在食品安全监测等领域具有潜在应用前景。同时，功能化的碳量子点本身也是一种新型功能纳米材料，在生物和分析检测等多领域都具有广阔的应用前景[39]。

3. 分子印迹传感

分子印迹技术是一种制备具有人工分子识别能力的高度专一性功能材料的新兴方法，近年来在土霉素(OTC)检测领域获得了广泛应用和研究。分子印迹传感检测OTC是基于以OTC分子为模板，在功能单体和交联剂存在的条件下进行聚合反应，形成具有OTC分子形状和尺寸的空穴结构，即分子印迹聚合物(MIP) [40]。在移除模板分子OTC后，MIP中残留下的空穴可以特异性重识别和结合OTC分子，从而实现对OTC的高选择性识别。将MIP与不同的传感元件(如电化学、光学、质量等)相结合，可构筑多种传感检测平台：电化学MIP传感器将MIP修饰在电极表面，当OTC分子结合到MIP识别空穴时，会导致电极电化学信号(电流、电位等)发生变化，根据这一变化即可检测OTC [41]。荧光MIP传感器将MIP与荧光团偶联，OTC结合到MIP时会影响荧光团的荧光行为(猝灭、增强等)，通过监测荧光信号变化实现OTC检测[42]。质量MIP传感器利用石英晶体微天平等质量传感元件，当OTC结合到修饰于晶体表面的MIP时，晶体质量会发生变化据此检测OTC [43]。分子印迹传感器在OTC检测中表现出卓越的选择性识别能力。此外，MIP本身具有稳定性好、制备简便、成本低廉等优势，使得分子印迹传感策略有望成为检测OTC的理想选择，在食品安全监控、环境监测等领域具有广阔的应用前景[44]。

4. 生物分子识别传感

生物分子识别传感是利用抗体、核酸适配体、肽核酸酶等生物分子对土霉素(OTC)具有高度专一性亲和力识别的特性，构建高灵敏高选择性的OTC生物传感检测平台[45]。抗体是最常用的生物分子识别元件之一[46]。通过免疫发酵等技术可制备出针对OTC的单克隆抗体，并将其与各种传感元件(如荧光纳米材料、电化学电极等)偶联，构建荧光、电化学等抗体生物传感器[47]。当OTC分子与抗体结合时，会引起传感信号(荧光、电流等)发生明显变化，根据这一变化即可实现对OTC的高灵敏检测。核酸适配体是一种人工合成的单链核酸分子，能高亲和力、高选择性地与靶标OTC分子结合[48]。适配体与纳米材料、荧光分子等元件偶联后，可构建出基于荧光猝灭/恢复、电化学阻抗等机理的OTC适配体传感器[49]。适配体生物传感器还可整合至纸基分析装置等便携式检测平台。近年来，一些新兴的人工生物分子如肽核酸酶也逐渐被应用于OTC检测。肽核酸酶是一类人工设计的多肽/核酸融合分子，能专一性识别并催化特定分子底物的水解反应[50]。将OTC偶联至荧光分子后作为肽核酸酶的底物，当OTC存在时会发生水解引发荧光恢复，从而实现高灵敏检测[51]。生物分子识别传感凭借其高选择性、高亲和力等独特优势，在复杂基质样品中对OTC的检测表现出显著优势，是目前最有潜力的OTC高灵敏检测新方法之一。

5. 结语与展望

土霉素(OTC)作为一种广泛使用的抗生素，其在动物源性食品和饮用水中的残留已引起广泛关注。OTC残留不仅可能导致人体过敏反应、毒性作用，还可能加剧抗生素耐药性问题。OTC已被发现污染水体和土壤环境，并可在牛奶、肉类、果汁等食品中积累，对人体健康构成潜在危害。抗生素被过度使用于牲畜养殖、水产养殖和农业防虫，使得它们进入动物饲料和人类食品链，引发了人们对其潜在毒性风险的忧虑。因此，人们越来越关注抗生素使用不当带来的负面影响，迫切需要开发出高效便捷的方法，用于快速识别受污染食品中的OTC残留。尽管现有仪器分析方法具有较高灵敏度，但缺乏便携性和实时检测能力，难以满足现场快速筛查的需求。因此，研发一种便携且高灵敏的OTC检测新方法已经成为当务之急，以保障食品安全维护公众健康。

基金项目

感谢大学生创新创业项目《纳微粒子构筑的柔性可穿戴式双酚A传感器》，编号：S202310160004和《限域合成的量子点MOF主客体功能材料在ROS方面的应用研究》，编号：S202210160001的支持。也感谢教育锦州医科大学教育改革研究课题(编号：YJ2022-018和YB2022042)对本研究的支持。

NOTES

^*通讯作者。