1. 引言
大口黑鲈(Micropterus salmoides)俗称加州鲈鱼，原产自加拿大和美国，1983年大口黑鲈被引进至我国，且年产量一直保持在16万吨左右[1]，因其肉质坚实，味道鲜美，且骨刺少，营养价值高，在市场上深受大众喜爱。随着北方地区大口黑鲈养殖量不断增加，各类疾病暴发严重。尤其近两年大口黑鲈养殖过程中常出现各类病毒性、细菌性疫病引起大量死亡，给养殖户造成了经济损失，其中爱德华氏菌在大口黑鲈的病原菌中较为常见。
据研究表明爱德华氏菌属应归为肠杆菌科，可被分为三个种，迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda, E. tarda)、保科爱德华氏菌(Edwardsiella hoshinae, E. hoshinae)和鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictalurid, E. ictaluri)，其中，迟缓爱德华氏菌分布较为广泛[2]，危害较严重。2013年后，通过对迟缓爱德华氏菌的表现型和遗传特征的鉴定发现其存在着很多的差异，研究人员将异于迟缓爱德华氏菌的分离株重新命名为杀鱼爱德华氏菌[3]。由杀鱼爱德华氏菌引起的爱德华氏菌病在世界范围内的重要经济鱼类中，除大口黑鲈外也包括鳗鲡、真鲷和大菱鲆[4]。该菌致病高发期在夏季及初秋等高温季节，一旦发病会极大抑制养殖鱼类的生长，引起养殖鱼类大面积死亡，对养殖户造成不可估量的经济损失[5]。杀鱼爱德华氏菌目前已引起水产养殖业和相关研究人员的普遍重视，因此筛选出有效抑制杀鱼爱德华氏菌的药物迫在眉睫。
我国中草药种类繁多，使用历史悠久。中草药具有天然性、多功能性、无毒副残留性、无抗药性等诸多优点[6]。目前已有诸多研究人员发现，中草药对多种病原都具有一定的抑制作用，这在水产养殖病害防治方面也有相关研究报道。中草药被普遍认为能够替代抗生素、疫苗和化学药品在水产养殖中广泛使用，因此中草药在水产养殖抗病使用中有巨大的优势以及使用前景。
2. 实验材料与方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 病原菌与中草药
实验用杀鱼爱德华氏菌来自于实验室保存。将其进行复苏，通过固体与液体培养基的培养，纯化富集大量杀鱼爱德华氏菌。
实验中草药为百部(Stemona japonica)、大黄(Rheum officinale Baill)、当归(Angelica sinensis)、蛇床子(Cnidium monnieri (L.) Spreng)、黄连(Coptidis rhizoma)、苦参(Sophora flavescens)、黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)、黄柏(Cortex Phellodendri Chinensis)、女贞子(Fructus ligustri Lucidi)、苏木(Lignum sappan)。
2.1.2. 实验仪器与设备
酶标仪(帝肯)；高速冷冻离心机(艾本德)；生物安全柜(海尔)；生化培养箱(北京六一)；游标卡尺(上海赛拓)。
2.2. 实验方法
2.2.1. 药液的制备
每味中草药取50 g，投入烧杯加水500 mL，浸泡一夜后煎煮，水沸腾后文火继续煎煮1 h，最终浓缩至50 mL，生药浓度为1 g/mL。两层纱布过滤，滤液移至50 mL离心管，获得中草药粗提液，放置4℃冰箱保存，静置沉淀后取上层药液使用[7]。
2.2.2. 平板的制备
称取BHI固体培养基粉末47 g，溶于1 L去离子水中，加热煮沸，121℃高压灭菌1 h备用。将灭菌的牛津杯置于细菌培养板中间，倒入25 mL制备好的培养基溶液，保持液体不流入牛津杯内，冷却备用。
2.2.3. 抑菌圈的测定
取浓度为2 × 106 cfu/mL杀鱼爱德华氏菌悬液100 μL涂布于带孔的BHI固体培养基上。每个孔内加入150 μL中草药液，保持加满但不溢出的状态。将培养皿平放于生化培养箱内37℃培养24 h，选取三个不同方向，分别量取抑菌圈直径并取平均值。
药物敏感度评定标准为：抑菌圈直径平均值 > 20 mm，判定为极度敏感(++++)；抑菌圈直径平均值15~20 mm，判定为高度敏感(+++)；抑菌圈直径平均值10~15 mm，判定为中度敏感(++)；抑菌圈直径平均值 < 10 mm，判定为低度敏感(+)；无抑菌圈则判定为不敏感(-) [8]。
2.2.4. 最小抑菌浓度(MIC)的测定
在细胞培养板孔中加入150 μL的BHI液体培养基和150 μL有明显抑制效果的5味中草药粗提液，通过二倍稀释法进行倍比稀释，粗体液的浓度分别为500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.625 mg/mL、7.8125 mg/mL、3.906 mg/mL、1.953 mg/mL、0.977 mg/mL，在每孔中加入10 μL菌液，菌液浓度为2 × 106 cfu/mL。每个孔做空白对照，只加中药粗体液不加菌液，盖好盖板置于生化培养箱内37℃培养24 h，利用酶标仪测量每孔的吸光度(OD)值。按顺序出现的最后一组无明显差异的数据所对应的药物浓度，判定为该药物的最小抑菌浓度。
2.2.5. 最小杀菌浓度(MBC)的测定
依据MIC的数据结果，移液枪吸取稀释浓度为MIC值及高于该稀释浓度的培养物150 μL涂布于无孔的BHI固体培养基上，置于生化培养箱内37℃培养24 h，观察结果，无菌落长出的培养皿所对应的最低浓度为该药物的最小杀菌浓度[9]。
3. 实验结果
3.1. 抑菌圈测定结果
杀鱼爱德华氏菌对10味中草药的敏感程度如表1所示，杀鱼爱德华氏菌对10味中草药的敏感程度大小依次为：苏木、黄连、女贞子、黄芩、大黄。其他无抑菌圈均为不敏感[10]。其中，杀鱼爱德华氏菌对苏木表现为极度敏感(++++)，对黄连表现为高度敏感(+++)，对大黄、黄芩、女贞子菌表现为中度敏感(++)。因此，杀鱼爱德华氏菌对苏木，黄连较为敏感。选取有效果的苏木、黄连、大黄、黄芩、女贞子5种中草药继续进行MIC以及MBC的测定。
Table 1. Antibacterial effects of 10 Chinese herbal medicines on Edwardsiella piscicida in vitro
表1. 10味中草药对杀鱼爱德华氏菌的体外抑菌效果
中草药 |
抑菌圈直径1 |
抑菌圈直径2 |
抑菌圈直径3 |
平均值 |
抑菌等级 |
百部 |
--- |
--- |
--- |
--- |
--- |
大黄 |
11.90 |
11.50 |
11.70 |
11.70 |
++ |
当归 |
--- |
--- |
--- |
--- |
--- |
蛇床子 |
--- |
--- |
--- |
--- |
--- |
黄连 |
16.0 |
14.52 |
14.48 |
15.00 |
+++ |
苦参 |
--- |
--- |
--- |
--- |
--- |
黄芩 |
12.46 |
10.38 |
12.60 |
11.81 |
++ |
黄柏 |
--- |
--- |
--- |
--- |
--- |
女贞子 |
13.74 |
13.30 |
13.46 |
13.50 |
++ |
苏木 |
20.50 |
22.10 |
21.00 |
21.20 |
++++ |
注：+++极度敏感；+++高度敏感；++中度敏感；---不敏感。
3.2. 5味中草药对杀鱼爱德华氏菌的MIC
大黄、黄连、黄芩、女贞子以及苏木的MIC测定结果如表2所示，大黄的MIC浓度为31.25 mg/mL，黄连的MIC浓度为15.625 mg/mL，黄芩的MIC浓度为31.25 mg/mL，女贞子的MIC浓度为125 mg/mL，苏木的MIC浓度7.8125 mg/mL。因此，苏木的MIC值最小，抑制效果最明显。其次分别是黄连、大黄、黄芩。女贞子的MIC浓度最大抑菌效果较差。
Table 2. MIC of 5 Chinese herbal medicines against Edwardsiella piscicida
表2. 5味中草药对杀鱼爱德华氏菌的MIC
|
|
OD值 |
药物浓度(mg/mL) |
500 |
250 |
120 |
62.5 |
31.25 |
15.625 |
7.8125 |
3.906 |
1.953 |
0.977 |
大黄 |
实验组 |
1.7068 |
1.0535 |
0.3006 |
0.2151 |
0.1631 |
0.7576 |
0.5969 |
0.866 |
0.9808 |
1.0241 |
对照组 |
1.7173 |
1.0142 |
0.3016 |
0.207 |
0.1527 |
0.1242 |
0.3547 |
0.3597 |
0.401 |
0.3783 |
差值 |
−0.0105 |
0.0393 |
−0.001 |
0.0081 |
0.0104 |
0.6334 |
0.2422 |
0.5063 |
0.5798 |
0.6458 |
续表
黄连 |
实验组 |
1.3593 |
1.1276 |
0.8885 |
0.4865 |
0.2826 |
0.1827 |
0.3529 |
0.6539 |
0.9751 |
1.0532 |
对照组 |
1.2968 |
1.0638 |
0.8772 |
0.4336 |
0.2574 |
0.169 |
0.1308 |
0.2892 |
0.3622 |
0.286 |
差值 |
0.0625 |
0.0638 |
0.0113 |
0.0529 |
0.0252 |
0.0137 |
0.2221 |
0.3647 |
0.6129 |
0.7672 |
黄芩 |
实验组 |
0.2851 |
0.1908 |
0.1364 |
0.1175 |
0.3908 |
0.6717 |
1.013 |
0.9898 |
1.0231 |
1.0837 |
对照组 |
0.3113 |
0.1757 |
0.1282 |
0.1104 |
0.445 |
0.4436 |
0.3551 |
0.3875 |
0.3582 |
0.3903 |
差值 |
−0.0262 |
0.0151 |
0.0082 |
0.0071 |
−0.0542 |
0.2281 |
0.6579 |
0.6023 |
0.6649 |
0.6934 |
女贞子 |
实验组 |
0.1769 |
0.1285 |
0.1035 |
0.2072 |
0.2732 |
0.2371 |
0.2066 |
0.2197 |
0.2786 |
0.3375 |
对照组 |
0.1778 |
0.1283 |
0.1071 |
0.0987 |
0.0938 |
0.0977 |
0.085 |
0.0688 |
0.0689 |
0.0615 |
差值 |
−0.0009 |
0.0002 |
−0.0036 |
0.1085 |
0.1794 |
0.1394 |
0.1216 |
0.1509 |
0.2097 |
0.276 |
苏木 |
实验组 |
0.3555 |
0.2792 |
0.1841 |
0.1793 |
0.1034 |
0.0848 |
0.0865 |
0.2575 |
0.3443 |
0.2797 |
对照组 |
0.3566 |
0.2777 |
0.1821 |
0.1871 |
0.1042 |
0.0871 |
0.0862 |
0.0813 |
0.1329 |
0.0921 |
差值 |
−0.0011 |
0.0015 |
0.002 |
−0.0078 |
−0.0008 |
−0.0023 |
0.0003 |
0.1762 |
0.2114 |
0.1876 |
3.3. 5种中草药对杀鱼爱德华氏菌的MBC
大黄、黄连、黄芩、女贞子以及苏木的MBC测定结果如表3所示。大黄全部长菌因此无MBC浓度。黄连MBC浓度为125 mg/mL，黄芩全部长菌因此无MBC浓度，女贞子MBC浓度为250 mg/mL，苏木MBC浓度为62.5 mg/mL。综上可得出苏木对杀鱼爱德华氏菌的杀菌效果最明显。
Table 3. MBC of 5 Chinese herbal medicines against Edwardsiella piscicida
表3. 5味中草药的MBC测定结果
浓度(mg/mL) 中药 |
500 |
250 |
125 |
62.5 |
31.25 |
15.625 |
7.8125 |
大黄 |
P |
P |
P |
P |
P |
|
|
黄连 |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
|
黄芩 |
P |
P |
P |
P |
P |
|
|
女贞子 |
N |
N |
P |
|
|
|
|
苏木 |
N |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N不长菌；P长菌。
4. 讨论
4.1. 不同中草药的抑菌效果分析
据抑菌圈测定实验结果可知，选取的10味中草药中有5味中草药对杀鱼爱德华氏菌有明显抑制效果。其中黄连、女贞子以及苏木对杀鱼爱德华氏菌有明显的抑制作用。抑菌圈的平均直径均大于13 mm，苏木的抑菌圈直径可达20 mm以上。但这3味药材对杀鱼爱德华氏菌的抑菌效果也存在一定差异。黄连属毛茛科黄连属应试部位为根茎；女贞子属木犀科应试部位为成熟果实；苏木属豆科应试部位为根皮。由此可推测中草药对病原菌抑制效果的不同可能与中草药的种类及应试部位有关系。而苦参与苏木同属豆科，应试部位为根部，本试验结果却显示苦参对杀鱼爱德华氏菌无抑制作用，蛇床子属伞形科，但应试部位与女贞子同为成熟果实，本试验中也显示蛇床子对杀鱼爱德华氏菌无抑制作用。综上可推断原因可能为，不同种类的中草药及应试部位都会对同一病原菌产生不同的抑制效果。根据MIC及MBC测定结果，黄连、女贞子、苏木抑菌效果最为明显，其MIC测定结果分别为15.625 mg/mL、125 mg/mL、7.8125 mg/mL，其MBC的测定结果分别为125 mg/mL、250 mg/mL、62.5 mg/mL。而大黄与黄芩对杀鱼爱德华氏菌的抑制效果不及黄连、女贞子及苏木明显，可见不同中草药对同一的菌株的抑制效果不同。董亚萍[11]等研究发现，苦参、黄芩、连翘等中草药均对嗜水气单胞菌有延缓耐药性的作用。但在本实验中苦参对杀鱼爱德华氏菌无抑制作用，可推测其原因为，同一种中草药对不同的病原菌抑制效果有一定的差异。肖辉[12]等研究发现，同样的药材使用不同的提取方法对同一菌种的抑制效果有极大的差异。在本实验中百部、当归、蛇床子等药物对大口黑鲈病原杀鱼爱德华氏菌不敏感，依此推测原因可能为本实验中采取的中草药提取方式未能使中草药中的有效活性物质释放出来导致对杀鱼爱德华氏菌不敏感。因此，为本实验提供了进一步设想，对应试的10味药材采取不同的提取方式，进一步探究药物的不同提取物对爱德华氏菌的抑菌效果。
4.2. 药物活性物质的抑菌效果分析
百部、大黄、黄芩等许多中草药都具有杀菌作用。本实验中苏木、黄连、女贞子均具有抗炎、抗菌、抗病毒的作用，苏木主要含有黄酮类化合，包括苏木黄素、苏木查尔酮、巴西苏木素、黄酮类等，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抗菌作用[13]。许瑞平[12]等研究发现，苏木的根茎、叶、花等部位含有黄酮类、糖皂甙等活性物质可以起到较强的抑菌作用。可用于预防和治疗多种细菌感染疾病，如金黄色葡萄球菌、维氏气单胞菌等。通过本试验可证明，苏木对杀鱼爱德华氏菌也起到明显的抑杀作用。女贞子含有齐墩果酸、女贞子苷、挥发油等活性物质，能够增强动物免疫机能[14]，同时对革兰氏阳性菌和阴性菌也均有抗菌作用。朱文婷[15]等研究发现，黄连中所含的黄连碱、小檗碱等活性成分通过破坏细菌结构、抑制细菌糖代谢的方式起到抑菌的作用。通过体外抑菌实验，发现黄连对除杀鱼爱德华氏菌外有明显抑制作用，对嗜水气单胞菌同样有明显抑制作用。综上可推断，中草药的成分复杂，对细菌的抑制作用皆与其中的有效活性物质有关，其多糖、生物碱、有机酸类、黄酮类等均可能为抑菌的有效成分[16]。
4.3. 抑菌圈测定结果与MIC、MBC浓度关系分析
将抑菌圈直径大小与MIC及MBC数据进行对比，抑菌圈直径大小与MIC及MBC浓度测量值存在着一定的关系。可以发现抑菌圈平均直径越大的中草药，其MIC及MBC测定值越小。但女贞子的抑菌圈平均直径为13.50 mm，大黄与黄芩的抑菌圈平均直径分别为11.70 mm、11.81 mm。而大黄与黄芩的MIC则要小于女贞子。其原因推断可能为同一种中草药在固体培养基与液体培养基中的扩散程度存在一定差异。因此，抑菌圈与MIC、MBC测量值的相关性并不十分严谨，存在一定的局限性。同时也说明，判断中草药对爱德华氏菌的抑制效果除体外抑制效果研究以外还应该结合更全面的体内实验。如，在本实验中大黄的抑制效果并不明显，而ZHAO [17]等通过含有大黄的复方中药来改善大口黑鲈的代谢和免疫紊乱，试验发现按4%添加剂量添加复方中药到饲料中可使大口黑鲈的代谢及免疫维持在正常水平。在本实验中根据抑菌圈直径的测定来看，苏木对杀鱼爱德华氏菌极其敏感，黄连、女贞子对杀鱼爱德华氏菌也相较敏感，但从MIC及MBC的测定结果来看在药物浓度较高的情况下，才可出现对爱德华氏菌的抑制效果。据此可推测大致原因，中草药浓度需达到某一定值，才可出现对病原菌的抑制及杀菌效果。
4.4. 中草药在水产养殖业的发展趋势
中草药来源于天然的有机物与无机物，是一种天然药物，无有毒物质残留，不会对人体造成危害，不会污染环境。中草药不仅种类繁多，历史悠久，所含天然物质能够促进机体生长[18]，同时也可以抑制并杀死病原菌，有效地预防病害发生。夏与晴[7]等通过研究发现，将有协同作用的中草药按照一定的比例配伍，所得出的复方药物，要比其单方药物的抑菌效果更加明显。综上，单方中草药的抑制效果较为单一，而存在协同作用的复方中草药则能扬长避短，大大提升其抑菌效果[19]。所以，以联合药物的思想开发水产类疾病防治是大势所趋，从全面的角度有机协调、协同发展。通过此发现可对本实验做出设想，进一步将对杀鱼爱德华氏菌有协同作用的中草药苏木、女贞子、黄连进行合理配伍更加深入探究复方药物对大口黑鲈病原杀鱼爱德华氏菌的抑制效果。全面发展中草药在水产养殖病害防治的绿色应用。为后续中草药在水产养殖中的应用提供科学依据。
5. 结论与展望
随着北方地区大口黑鲈养殖量不断增加，各类疫病暴发严重。其中爱德华氏菌在大口黑鲈的病原菌中较为常见，本实验将实验室冻存的杀鱼爱德华氏菌复苏纯化并选取百部、大黄、当归、蛇床子、黄连、苦参、黄芩、黄柏、女贞子、苏木10味中草药材探究其对大口黑鲈病原爱德华氏菌的抑制效果。
通过试验得出以下结论，选取的10味药材中，有5味对杀鱼爱德华氏菌有抑制效果，其中苏木表现为极度敏感，抑菌圈直径达到21.20 mm，最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)分别为7.8125 mg/mL和62.5 mg/mL。女贞子与黄连的抑菌效果仅次于苏木，女贞子的抑菌圈直径为13.50 mm，MIC及MBC浓度分别为125 mg/mL和250 mg/mL；黄连的抑菌圈直径为15.00 mm，MIC及MBC浓度分别15.625 mg/mL和125 mg/mL。相比之下，有抑制作用的大黄与黄芩却不能起到杀菌作用。
结果显示，所选取的单方中草药对大口黑鲈病原爱德华氏菌有一定的抑杀作用。为中草药在水产病害防治方面提供了一定的理论基础，中草药有望成为抗生素及化学药品的有效替代品。但本实验未能从药物提取方式更深入的探究，且单方中草药作用效果单一，本实验未能更深一步探究复方中草药对大口黑鲈病原的抑制效果，后续研究有待进一步加深。
综上，可知苏木、女贞子、黄连对爱德华氏菌有明显的抑菌、杀菌作用。以此为基础进行深入研究，可为爱德华氏菌引起的水产疫病的防治提供新思路，同时也为防止水产动物抗生素滥用，发展水产养殖绿色健康养殖高质量发展提供科学依据。
基金项目
天津市农业发展服务中心种业青年科技创新项目(zxkj202421)。
NOTES
*通讯作者。