线纹海马Sox9a基因的克隆与表达分析

Cloning and Expression Analysis of Sox9a Gene in Hippocampus erectus

摘要: Sox9在脊椎动物性腺分化及精巢发育中行使重要功能。为探究线纹海马sox9a的分子特征及表达模式，本研究采用RACE获得了其cDNA全长1979 bp，包含339 bp 5’ UTR、1488 bp的ORF和152 bp 3’ UTR，共编码496个氨基酸；氨基酸多重比对显示，线纹海马sox9具有高度保守的HMG-box结构域；系统进化树分析表明，其与侏儒海马sox9a的亲缘关系最近；RT-qPCR显示，sox9a泛在表达于线纹海马成体的主要组织中，在性腺中呈显著的雄性偏好性高表达于精巢，揭示其可能参与线纹海马精巢的分化及维持。本研究为后续深入研究线纹海马sox9a在性别发育中的功能奠定了基础。

Abstract: Sox9 plays an important role in gonadal differentiation and testis development in vertebrates. In order to explore the molecular characteristics and expression pattern of sox9a in Hippocampus erectus, RACE was used to obtain its full length cDNA of 1979 bp, including 339 bp 5’UTR, 1488 bp ORF and 152 bp 3’UTR, encoding a total of 496 amino acids. Multiple amino acid comparisons showed that the Hippocampus erectus sox9 had a highly conserved HMG-box domain. Phylogenetic tree analysis showed that it was most closely related to Hippocampus zosterae sox9a. RT-qPCR showed that sox9a was ubiquitously expressed in the main tissues of Hippocampus erectus adults, and showed a significant male preference in the gonads and was highly expressed in the testis, suggesting that sox9a might be involved in the differentiation and maintenance of Hippocampus erectus testis. This study laid a foundation for further research on the role of Hippocampus erectus sox9a in sexual development.

1. 引言

脊椎动物的性别调控是由多个遗传模块相互交联共同作用的，性别相关基因的高度表达会启动不同的基因网络模块从而调控性腺的发育[1]。SRY基因定位于哺乳动物中的Y染色体，是脊椎动物中鉴定的首个性别决定基因[2] [3]，该基因含一个保守的HMG-box结构域，通过特异性识别和结合顺式作用元件进一步调控靶基因的转录水平[4]。Sox基因是在HMG-box结构区与sry基因序列相似度超60%的一类基因[5]，迄今为止，已有超40个sox基因在脊椎动物中得到鉴定，根据结构与功能的不同可将该基因家族划分为A-K11个亚族[6]。Sox9基因隶属于soxE亚族，最早于人类下丘脑发育不良患者中发现其功能与性别异常和软骨骼发育障碍等现象相关[7]。研究表明，哺乳动物中sry上游基因通过直接调节sox9的表达启动基因网络级联，并促进支持细胞分化、间质细胞分化、脉管系统形成和睾丸索的发育过程[8] [9]。Sox9基因的缺失或突变可能会导致性腺发育异常或性逆转的现象[10]。

迄今为止，sox9基因已在不同物种中得到了广泛的研究。哺乳动物中，sox9基因高表达于生殖嵴的支持细胞中[11]，分化初期Y染色体上的sry与转录因子Sf1相结合通过顺式作用元件TESCO上调sox9的表达，引起sox9-amh信号通路被激活，下游雄性分化相关的级联基因开始响应，促使性腺向睾丸的方向进行分化[12] [13]，反之则发育为卵巢[14]。人类中sox9基因功能的缺失或突变可能导致男性骨骼发育障碍和性别发育异常[10]；小鼠中组织特异性敲除精巢中的sox9会使支持细胞向卵巢的颗粒细胞转化并引起雌性偏好基因异常表达[15]。相较于哺乳动物，硬骨鱼中额外全基因组复制使得大多数硬骨鱼类中含多个sox9拷贝，斑马鱼中sox9a-amh-cyp19a1a是促进卵母细胞凋亡、精巢分化的关键信号通路[16]；青鳉中Dmy通过激活Gsdf/Sox9a2和抑制Rspo1的表达来促进雄性化进程，Gsdf和Sox9a2共注射可挽救Dmy缺失个体出现的雄性向雌性性逆转[17]；此外，在圆斑星蝶[18]、牙鲆[19]、尼罗罗非鱼[20]、金钱鱼[21]、大黄鱼[22]、虹鳟[23]、黄颡鱼[24]等中均检测到sox9的不同拷贝，其在性腺中大多呈二态性表达，揭示了sox9基因在鱼类的性腺发育中扮演着重要的角色。

线纹海马隶属海龙科海马属，原产于美洲地区加勒比海等海域[25] [26]，是一种极其珍贵的海洋药源性鱼类。因其生长速度快、繁殖和抗病能力强，于2009年由我国学者引入并成功驯化养殖[27]。线纹海马生殖方式极为特殊，实行雄性育儿及一夫一妻制，受精卵在雄海马育儿袋里伪胎盘中孵化[28]，目前关于其性别调控机制鲜有报道。本研究拟通过克隆线纹海马的sox9a基因，对其分子特征及表达模式进行分析，旨在为进一步深入了解线纹海马的性别决定机制奠定基础。

2. 实验材料与方法

2.1. 实验材料

本实验所用的线纹海马购买于福建英特森公司，置于循环水箱中饲养。饲养水温24℃~26℃，盐度35‰，每日定时投喂两次，以鲜活糠虾和卤虫为主，饲养至6月龄时解剖。依次取雌雄线纹海马(各三尾)的脑、眼、鳃、心脏、肝脏、肾脏、肠道、皮肤、肌肉、卵巢、精巢和育儿袋，所有组织均经液氮速冻后置于−80℃超低温冰箱备用。

2.2. 实验方法

2.2.1. 总RNA的提取和反转录

本实验采用TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒的方法提取线纹海马雌雄各组织的总RNA，具步骤按照试剂盒说明书进行；使用微型分光光度计(NanoPhotometer-N50)和1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度与质量。以提取的各组织RNA为模版，按照赛默飞公司提供的反转录试剂盒Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit的操作步骤进行cDNA的合成。

2.2.2. sox9a基因的克隆

根据本实验室转录组sox9a基因的测序结果，在ORF内设计一对引物，以精巢和卵巢混合cDNA作为PCR反应的扩增模版，克隆sox9a基因的中间片段，PCR反应程序为：98℃ 30s；98℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，(34个循环) 72℃ 5 min，4℃。

根据所获得的中间片段在5’端和3’端设计特异性引物；按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit (TaKaRa)说明书，以线纹海马的性腺组织总RNA为模版合成5’ RACE和3’RACE cDNA的第一条链，结合RACE中自带的接头特异引物，遵循touchdowen巢式PCR扩增原则，进行sox9a基因5’UTR和3’UTR片段的克隆，PCR反应程序如下：98℃ 30 s；6个循环：98℃ 10 s，68~58℃ 30 s (−2 ℃/cycle)，72℃ 2 min；27个循环：98℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min；72℃ 5 min，4℃。

以上所有PCR产物均经电泳切胶回收，连接到pmd-18t载体(TaKaRa)上并转化至大肠杆菌DH5α (Solarbio)中进行筛克隆，经PCR验证后挑选阳性菌落送测序比对。实验所用引物如表1所示。

2.2.3. 序列分析

利用Expasy在线网站(https://www.expasy.org/)进行序列的氨基酸翻译；使用NCBI网站进行开放阅读框(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和结构域的查找(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)；使用Clustal软件和GeneDoc软件对序列进行同源性分析；使用DNAMAN软件检测目标序列与其他物种氨基酸的相似程度；利用MEGA 7. 0软件构建系统发育树(NJ法)。

2.2.4. 荧光定量PCR

Table 1. Primers used in the experiments

表1. 实验所用引物序列

引物名称	序列(5’~3’)	用途
sox9a race-f1	CTCAGCACAGGACCCAGATCAAGAC	RACE扩增
sox9a race-f2	GCCTCTACTCGACTTTCAGCTACA
sox9a race-r1	GTACTTGTAGTCGGGGTGATCCT
sox9a race-r2	CGGGGAACTTATCGTCTTCGTCCTT

续表

sox9a-F	CACGCGTTCTGGGATTCTAT	中间片段 扩增 荧光定量 内参基因
sox9a-R	TCTGGTGAGCTGTGTGTAAACC
Y sox9a F Y sox9a R actin F actin R	CACGCGTTCTGGGATTCTAT TCTGGTGAGCTGTGTGTAAACC GGGACCTGACTGACTACCTC TCATACTCCTGCTTGCTGAT

根据sox9a基因的cDNA序列设计荧光定量引物(表1)，将线纹海马各个组织的cDNA均稀释5倍作为荧光定量的模版，以actin基因作为内参基因。具体反应体系：TB Green Prermix EX Taq II 10 μl，引物各0.5 μl，模版1 μl，无酶水8 μl。PCR程序：95℃ 1 min；40个循环：95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s。采取2^−ΔΔCT计算基因的相对表达量。每一组设置3个重复。

3. 结果

3.1. 线纹海马sox9a基因的序列分析

通过RACE扩增共获得Sox9a基因的cDNA全长1979 bp，包含5’ UTR339 bp、ORF 1488 bp和3’ UTR 152 bp，共编码496氨基酸，3’UTR具有典型的ploy A结构(图1)。

Figure 1. Nucleotide and amino acid sequences of sox9a in Hippocampus erectus

图1. 线纹海马sox9a基因的全长cDNA序列及预测氨基酸序列

3.2. 线纹海马sox9a基因的同源性及系统进化树分析

将线纹海马与其他物种sox9的氨基酸序列进行比对，结果显示所有序列均含有高度保守的HMG结构域，线纹海马的HMG-box位于105~180位氨基酸，另21~96位为sox-N二聚化结构域。其中，HMG-box结构域的两端存在两个独立的核定位信号NLS1、NLS2以及一个特征性基序，在HMG-box结构域的中心存在一个核输出信号NES (图2)。线纹海马的sox9a与虎尾海马和侏儒海马的同源性高达98.79%，与尖海龙和内冠海龙的同源性亦在95%以上，表现出同科物种间的高度保守，而与哺乳动物及其它硬骨鱼类的同源性略低，相似性位于74.56%~82.7%之间(表2)。

Note: The red box is the HMG-box domain; The yellow dotted lines are characteristic motifs; The yellow solid line is the nuclear output signal; The solid white lines are the nuclear localization signals NLS1 and NLS2注：红色方框为HMG-box结构域；黄色虚线为特征性基序；黄色实线为核输出信号；白色实线分别为核定位信号NLS1和NLS2

Figure 2. Amino acid sequence alignment of Hippocampus erectus sox9a and other homologs

图2. 线纹海马sox9a与不同物种的sox9氨基酸序列比对

Table 2. Amino acid sequence alignment of Hippocampus erectus sox9a and other homologs Sequence

表2. 线纹海马sox9a与不同物种的氨基酸序列比对

物种	登录号	Sox9a序列比对
Human sapiens sox9	NG_012490.1	74.56%
Mus musculus sox9	NC_000077.7	75.58%
Gallus gallus sox9	NC_052549.1	81.87%

续表

Xenopus tropicalis sox9	NC_030686.1	82.70%
Oryziaslatipes sox9a	NC_019866.2	74.74%
Danio rerio sox9a	NC_007123.7	77.82%
Hippocampus comes sox9	XP_019714069.1	98.79%
Hippocampus zosterae sox9a	NW_026061305.1XP_04961477.1	98.79%
Syngnathus acus sox9a	XP_057682747.1	96.97%
Corythoichthys intestinalis sox9a		97.37%

注：物种从上到下依次为人、小鼠、鸡、非洲爪蟾、青鳉、斑马鱼、线纹海马、虎尾海马、侏儒海马、尖海龙、内冠海龙。

系统进化树分析显示，斑马鱼的sox9b在早期便和其它物种的sox9发生了歧化，线纹海马的sox9a与哺乳动物、鸡、非洲爪蟾的sox9、模式鱼类斑马鱼和青鳉以及其它海龙科鱼类的sox9a聚为了一大支，其中与侏儒海马和虎尾海马的亲缘关系最近(图3)。

Figure 3. Phylogenetic tree of sox9a in Hippocampus erectus

图3. 线纹海马sox9a基因的系统进化树

3.3. 线纹海马sox9a基因的组织表达分析

采用RT-qPCR检测sox9a在成年雌、雄线纹海马各个组织中的基因表达量，结果显示，sox9a在雌、雄线纹海马的大多组织中呈泛在表达，其中在雌雄海马的肝脏中富集程度最高，脑、眼、鳃次之。对雌雄组织进行比较发现，sox9a在雄性组织腮、心脏和性腺中的表达量均高于雌性(fold > 2)，性腺中sox9a更是呈显著的性别二态性表达，其在精巢中的表达量是卵巢的33倍(图4)。

Figure 4. Expression levels of sox9a gene in different tissues of male and female in Hippocampus erectus

图4. sox9a基因在线纹海马雌、雄不同组织中的表达水平

4. 讨论

本研究通过RACE法克隆得到cDNA全长为1979 bp的sox9a基因序列，包含1488 bp的开放阅读框，编码496个氨基酸，通过同源性比对发现，其与鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类均有较高的相似性且HMG-box结构域都高度保守。研究发现sox9a基因具有典型的sox9结构特征，其HMG结构域的两端存在两个独立的核定位信号NLS1、NLS2以及一个特征性基序(AQAARRKL)，在HMG结构域的中心存在一个核输出信号NES，这与NCBI数据库中其他物种的sox9蛋白序列结构高度一致[29] [30]，表明sox9蛋白的保守性极强。早期的研究常通过HMG结构域的氨基酸序列与sry基因的相似性来鉴定新的sox基因[31]，其HMG结构域可与DNA序列特异性结合，从而调控上下游基因的表达[8]。有学者为了探究HMG结构域的相关功能，在XX小鼠中将sry的HMG box替换为sox3或sox9的HMG box，结果导致小鼠发生性反转，发育出正常的睾丸索[32] [33]，表明sox的HMG box可以在功能上替代sry HMG box来启动正常的雄性性别分化功能。此外，在sox9a基因中还包含一个sox-N二聚化结构域，该结构域为soxE家族中特有的存在[34]。系统发育树分析发现，线纹海马的sox9a蛋白与鱼类、哺乳类和鸟类等聚为一大支，其中与海龙科的亲缘关系最为密切，暗示其在功能上亦发挥着相同的作用，这也说明sox9a蛋白在物种的进化过程中是高度保守的。

硬骨鱼类的性别决定机制及其复杂，有研究表明sox9基因在鱼类的性别决定与分化过程中起着关键作用[10]。迄今为止，sox9基因在鱼类中的组织差异表达模式已有许多报道。由于硬骨鱼中一次大规模的基因组复制，使得大多数鱼类的sox9基因都含有两个副本。在青鳉中，sox9a只在卵巢中表达，而sox9b在精巢中表达[18]；在斑马鱼[17]和黄颡鱼[24]中，sox9a基因在精巢、脑等其他组织中遍布表达，而sox9b基因却仅表达于卵巢的卵母细胞中，说明sox9b基因可能参与了卵巢的发育过程；在尼罗罗非鱼中，sox9a基因在性腺未分化时期中的表达没有差异，当性腺分化后，sox9a在雄性性腺中的表达量明显上调[16]。此外，在圆斑星鲽、白斑狗鱼、许氏平鲉[35] [36]等鱼类中仅含有一种sox9基因，研究发现sox9基因除了在性腺中表达外，还在成鱼的其他组织中遍布表达，且在性腺中精巢的表达水平显著高于卵巢，说明sox9基因对雄性性腺的分化起到重要作用。

在本研究中，克隆到一种sox9a基因，通过RT-qPCR发现其在各个组织中泛在表达，其中在精巢中的表达量远高于卵巢，呈现出明显的性别二态性，这与金钱鱼、大黄鱼、虹鳟等鱼类[21] [22] [23]的研究结果一致，表明线纹海马的sox9a基因可能参与了雄性性腺的分化和发育过程。与其他组织相比，sox9a基因均在雌雄个体的脑、眼、鳃等组织中有较高水平的表达，这与许氏平鲉、翘嘴鲌、西伯利亚鲟等[36] [37] [38]的研究结果类似，表明其可能参与并调控了线纹海马神经系统的发育及分化等过程。此外，在线纹海马雌雄个体的肝脏中均检测到了sox9a基因的大量表达，揭示着sox9a基因可能参与了肝脏的代谢等过程，其中具体发挥的功能和作用机制尚未得知，还需进一步验证和探索。

5. 小结

综上所述，本研究通过RACE法成功克隆线纹海马的sox9a基因，RT-qPCR结果表明sox9a基因可能参与精巢和神经系统的发育等过程，与雄性性腺的性别决定与分化紧密相关，本研究为日后深入探究线纹海马的性别发育机制提供参考资料。