线纹海马Dmrt1基因的克隆与表达分析

Cloning and Expression Analysis of Dmrt1 Gene in Lined Seahorse (Hippocampus erectus)

摘要: Dmrt1广泛参与了不同物种的性别决定和性腺发育过程，为探究dmrt1在线纹海马中的分子特征及表达模式，本研究采用RACE-PCR克隆到了其cDNA全长1009 bp，包含87 bp的5’UTR、756 bp的ORF和166 bp的3’UTR，共编码251个氨基酸；氨基酸多重比对显示，线纹海马dmrt1在DM结构域内具有高度保守性；系统进化树分析表明，其与侏儒海马的dmrt1亲缘关系最近；RT-qPCR显示，dmrt1在线纹海马成体的性腺中呈显著的雄性偏好性高表达于精巢，表明其可能参与了线纹海马精巢的形成和维持。该研究为进一步深入研究线纹海马dmrt1在性别发育中的功能奠定了基础。

Abstract: Dmrt1 is widely involved in the process of sex determination and gonad development in different species. In order to investigate the molecular characteristics and expression pattern of dmrt1 in the Hippocampus erectus, an 1009 bp cDNA was cloned by RACE-PCR, which contains 756 bp ORF, 87 bp 5’UTR, 166 bp 3’ UTR, encoding 251 amino acids. A highly conserved DM domain has been detected in the dmrt1 of Hippocampus erectus by multiple amino acid alignment. Phylogenetic tree analysis showed dmrt1 in Hippocampus erectus was evolutionarily most closely related to that in Hippocampus zosterae. A male-biased expression in testis was detected by RT-qPCR, suggesting that dmrt1 might play important roles in the formation and maintenance of testis in Hippocampus erectus. This study laid the foundation to further study the function of dmrt1 in sexual development of Hippocampus erectus.

1. 引言

DMRT (Double-sex and Mab-3 related transcription factor)基因编码一系列高度保守的转录因子家族，这些转录因子共享一个独特的DM结构域[1] [2]。其中研究最多的DMRT家族基因是DMRT1，它在脊椎动物中包括两栖动物、鱼类、鸟类和哺乳动物的性别决定和性别分化中发挥着至关重要的作用[3] [4] [5]。研究表明dmrt1在硬骨鱼的性腺中呈性别二态性表达并参与性腺的发育过程，如在半滑舌鳎[6] [7]、尼罗罗非鱼[8]和青鳉[9] [10] [11]中dmrt1仅在精巢特异性表达并与精巢的分化相关；在斑马鱼[12] [13]、斑点叉尾鮰[14]、大口黑鲈[15]、大西洋鳕鱼[16]等鱼类中，在精巢和卵巢中均可检测到dmrt1基因的表达，但其在精巢中的表达量明显高于卵巢，揭示了dmrt1基因在鱼类的性腺发育中扮演着重要的角色。

线纹海马(Hippocampus erectus)隶属海龙科，是一种栖息于大西洋浅海区域的小型海洋药源性鱼类[17] [18]，自2009年引入我国后成功地进行人工饲养繁殖，因其繁殖能力和抗病性强、生长速度快等特点，成为我海马养殖的主要品种之一，其在水族观赏市场及医学药用方面具有较高的经济价值。线纹海马具有独特的繁殖策略，实行雄性育儿及一夫一妻制，卵子在雄性育儿袋内完成受精并进行胚胎发育[19]。目前关于其性别调控机制鲜有报道，本研究拟通过克隆线纹海马的dmrt1基因，对其分子特征及表达模式进行分析，旨在为后续深入了解线纹海马的性别决定机制奠定基础。

2. 材料与方法

2.1. 实验鱼

实验所用的线纹海马购买于福建英特鑫生物公司。于鱼房循环系统中进行饲养，期间保证溶氧充足，水温保持在24℃~26℃，盐度为35‰，光照周期为12L:12D，日投喂两次(12:00和18:00)，以活体卤虫和糠虾为主，日换水量为养殖总水体的五分之一。待线纹海马饲养至性成熟，分别取雌鱼雄鱼各三只于MS-222配置好的麻醉剂中，再分别取脑(含垂体)、眼、鳃、心脏、肝脏、肾脏、肠道、皮肤、肌肉、卵巢、精巢和育儿袋等组织，经液氮速后置于−80℃超低温冰箱内冻存。

2.2. 总RNA的提取和cDNA的合成

采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒(TaKaRa，日本)的方法提取成体线纹海马雌雄各组织的总RNA，使用超微量分光光度计(NanoPhotometer-N50，德国)检测其纯度与浓度，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。各组织的RNA鉴定合格后，采用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国)法并参照相关操作步骤将总RNA反转录为cDNA。

2.3. dmrt1基因的克隆

由于线纹海马购买于养殖市场，遗传背景复杂且不清晰，故以前期获得的线纹海马性腺转录组数据中的dmrt1序列为基础，在其ORF内设计特异引物(表1)，以精巢卵巢的混合cDNA作为PCR的扩增模版，克隆出dmrt1基因ORF内的部分序列，PCR反应条件为：98℃ 30 s；98℃ 10 s，66℃ 10 s，72℃ 1 min 30 s (34个循环) 72℃ 5 min，4℃。

将PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收，再将回收产物连接到pMD18-T载体上，并转化至DH5α大肠杆菌的感受态中，菌落PCR筛选阳性克隆送测序，测序结果与预测转录本进行比对，进一步确定dmrt1基因的序列。实验所用引物如表1所示，引物及测序结果均由上海生工生物工程有限公司完成。

在ORF内设计两对RACE特异性引物(表1)，采用SMARTer RACE 5′/3′ Kit (TaKaRa，日本)试剂盒用线纹海马雌雄性腺的总RNA合成5’-RACE和3’-RACE的cDNA文库，结合自带的接头通用引物和接头特异引物，遵循巢式PCR原理进行扩增，克隆得到5’UTR和3’UTR的两端序列，PCR反应程序为：98℃ 30 s；98℃ 10 s，70℃ 10 s，72℃ 2 min，98℃ 10 s，69℃ 10 s，72℃ 2 min，98℃ 10 s，68℃ 10 s，72℃ 2 min，98℃ 10 s，67℃ 10 s，72℃ 2 min，98℃ 10 s，66℃ 10 s，72℃ 2 min，98℃ 10 s，65℃ 10 s，72℃ 2 min (30个循环)；72℃ 5 min，12℃。同以上操作将PCR产物连接、转化、送测序最后拼接出dmrt1基因的全长序列。

2.4. 序列分析

使用NCBI网站进行开放阅读框(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和结构域的查找(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)；利用Expasy在线网站(https://www.expasy.org/)对序列进行氨基酸翻译；使用GeneDoc软件和Clustalx软件对序列进行同源性分析；使用DNAMAN软件比对目标序列与其他物种氨基酸的相似度；利用MEGA 10软件构建系统进化树(NJ法)。

2.5. 实时荧光定量PCR

采用TB Green Prermix EX Taq™ Ⅱ (Takara，日本)试剂的操作说明和Bio-Rad PCR仪对线纹海马的dmrt1基因进行组织表达分析。以不同组织反转录而来的cDNA按1:5的比例稀释作为荧光定量的模板，在dmrt1序列的ORF内设计特异性引物(表1)，以β-actin作为内参基因，检测dmrt1在各组织中的相对表达量。所有样本均进行3次平行重复实验，用2^－ΔΔCT方法计算基因的相对表达量。

Table 1. Primers used in the experiment are shown in the following table

表1. 实验所用引物序列

引物名称	序列(5’-3’)	用途
dmrt1 Race-F1	AGACAGCAAGCTCAGGACGAGGAGT
dmrt1 Race-F2	CGCCGCTTCTTCTTCTTCTCTGC	RACE扩两端
dmrt1 Race-R1	GTCTTGGGTTTTGACCGAGGACAG
dmrt1 Race-R2	ACTCCTCGTCCTGAGCTTGCTGTCT
dmrt1-F	CTAATCCCGACCGCAACC	中间片段克隆

续表

dmrt1-R dmrt1-Y-F dmrt1-Y-R β-actin F β-actin R

AAACAACAACAGAAAGTCCGAAT AGTCGGAGAACCCCTACCAG GTCCTCCAGGCTGAAGAAGG GGGACCTGACTGACTACCTC TCATACTCCTGCTTGCTGAT

荧光定量 内参引物

3. 结果

3.1. 线纹海马dmrt1基因的序列分析

通过RACE-PCR从线纹海马的成熟性腺中克隆出了dmrt1基因的cDNA序列，全长为1009 bp，包含756 bp的ORF序列以及87 bp的5' UTR、166 bp 3' UTR，共编码251个氨基酸(图1)；使用NCBI在线软件查询出在第18~64氨基酸残基处含有1个保守的DM结构域。

3.2. 线纹海马dmrt1基因的同源性及系统进化树分析

使用Clustalx和GENEDOC软件对不同物种dmrt1的氨基酸进行同源性分析，结果显示线纹海马与其他物种的dmrt1在DM结构域内呈高度保守，线纹海马dmrt1的ORF与虎尾海马、侏儒海马、草海龙和叶海龙的相似性分别为70.03%、68.93%、57.34%和55.93%，其次与斑马鱼和青鳉的相似性为41.95%和40.89%，而与红原鸡、小鼠、非洲爪蟾和人的同源性较低仅为28.12%、27.81%、26.82%和25.46% (图2)。

对上述物种dmrt1的氨基酸进行了系统进化树的构建，结果显示，线纹海马dmrt1基因与海龙科及其他鱼类的dmrt1基因聚为一支，其中与侏儒海马的亲缘关系最密切；而哺乳类、非洲爪蟾和鸡聚为另一分支，和线纹海马的亲缘关系较低(图3)。

3.3. 线纹海马dmrt1基因的组织表达分析

采用实时荧光定量PCR检测dmrt1在雌鱼和雄鱼不同组织中的相对表达情况，结果显示，线纹海马dmrt1在性腺中呈显著的性别二态性高表达于精巢，其在精巢中的表达量约卵巢表达量的20倍，另其在雄性特有的育儿袋中也有微量表达(图4)。此外，dmrt1基因在雌、雄线纹海马的肝脏、皮肤、肌肉和心脏中有一定程度表达，但其表达量远低于精巢(图4)。

Figure 1. Nucleotide and deduced amino acid sequences of Hippocampus erectus dmrt1

图1. 线纹海马dmrt1的全长cDNA序列及预测氨基酸序列

Sequence login No.: Hippocampus zosterae dmrt1, XP_051923903.1; Hippocampus comes dmrt1, XP_019721568.1; Phyllopteryx taeniolatus dmrt1, XP_061623093.1; Phycodurus eques dmrt1, XP_061528312.1; Danio rerio dmrt1, NP_991191.2; Oryzias latipes dmrt1, XP_004086499.1; Oryzias latipes dmrt1, XP_004086499.1; Xenopus tropicalis dmrt1, XP_031746577.1, Gallus gallus DMRT1, XP_040511578.1; Mus musculus DMRT1, NP_056641.2; Homo sapiens DMRT1, XP_006716795.1

序列登录号：侏儒海马XP_051923903.1，虎尾海马XP_019721568.1，草海龙XP_061623093.1，叶海龙XP_061528312.1，斑马鱼NP_991191.2，青鳉XP_004086499.1，非洲爪蟾XP_031746577.1，红原鸡XP_040511578.1，小鼠NP_056641.2，人XP_006716795.1

Figure 2. Amino acid sequence comparison of Hippocampus erectus dmrt1 with different species

图2. 线纹海马dmrt1与不同物种的氨基酸序列比对

Figure 3. Phylogenetic tree of dmrt1 in Hippocampus erectus

图3. 线纹海马dmrt1 的系统进化树

Figure 4. Expression levels of dmrt1 gene in different tissues of male and female in Hippocampus erectus

图4. Dmrt1 基因在线纹海马雌、雄不同组织中的表达水平

4. 讨论

DMRT基因家族广泛参与了从低等动物到高等动物的性别决定和性腺发育，其家族成员共享一个独特的DNA结合基序[2]，通过对线纹海马dmrt1基因的序列特征进行分析，发现该基因存在较高的物种进化保守性。

Dmrt1在大多数物种中呈现显著的性别二态性。在哺乳动物的XY性别决定系统中，其Y染色体上包含一个显性雄性决定基因，称为SRY，它负责启动物种的雄性性别决定[20]。在人类中，DMRT1与SRY = 基因相似，在男性胚胎生殖嵴中特异表达，参与了雄性的性别决定过程[21]。在小鼠胚胎的体细胞和两性原始生殖细胞(PGC)的生殖嵴中均可检测到dmrt1的表达[22] [23]，说明其并不参与初始的性别决定，但出现明显的性腺分化后，dmrt1在卵巢中的表达下降，而对于精巢中生殖细胞和支持细胞的功能维持方面仍具有重要作用[24]。鸡dmrt1基因具有性别特异表达特性，且主要在Z染色体上，影响雄性性腺的发育，在雄性(ZZ)中的表达量高于雌性(ZW) [25]。敲除鸡雄性个体的dmrt1基因将导致精巢结构退化，同时向卵巢分化[26] [27]。非洲爪蟾dmrt1 (xDmrt1)仅在精巢组织中表达，且在53期蝌蚪的性腺/中肾复合体中首次检测到dmrt1的转录本，此时性腺仍无明显差异[28]。

在硬骨鱼类中，dmrt1在大多数物种的性腺中呈现性别二态性，表现为精巢中特异性表达或显著的雄性偏好性。在青鳉中dmrt1基因有两个同源物存在为dmrt1bY (或Dmy) [29]，被证明是雄性发育的主要调控因子，在青鳉的精巢中特异性表达[6] [7]。在尼罗罗非鱼中dmrt1特异表达于雄性精巢的支持细胞和体细胞内，dmrt1在XX雌鱼中过表达会导致卵巢腔发育迟缓和血清中的17β-雌二醇水平降低，甚至部分雌性完全性逆转为雄性。在半滑舌鳎[6] [7]、胡子鲶[30]和黄颡鱼[31]中分别通过RT-qRCR技术检测了dmrt1基因在不同组织中的表达量发现其均特异表达于成体的精巢中，而其他组织中则无表达。斑马鱼、斑点叉尾鮰、大西洋鳕鱼和大口黑鲈等鱼类中的dmrt1基因表现出显著的雄性偏好性，虽在雌雄性腺中均能检测到dmrt1的表达，但其在精巢中的表达量要明显高于卵巢[12]-[16]。闫宁宁[15]在大口黑鲈中扩出了dmrt1基因的全长，并检测到dmrt1在精巢中呈现最高水平的表达，均显著性高于其他各个组织，卵巢等其他组织中仅有微量表达。本实验中，dmrt1基因在线纹海马中高表达于精巢，这表明dmrt1基因可能参与了精巢发育和维持，其具体的性别决定机制有待进一步研究。

5. 结论

本研究通过RACE-PCR克隆到了线纹海马dmrt1基因的序列，其具有高度保守的DM结构域并与侏儒海马的dmrt1亲缘关系最近；RT-qPCR结果显示，dmrt1在线纹海马成体的性腺中呈显著的雄性偏好性高表达于精巢，表明其可能参与了线纹海马的性别发育过程及精巢的形成和维持，以期为进一步深入研究线纹海马的性别发育机制奠定了基础。

NOTES

^*通讯作者。