1. 引言
线纹海马(Hippocampus erectus)又名灰海马，隶属海龙科(Syngnathidae)，是一种原产于美洲地区加勒比海等海域的小型海洋鱼类[1] [2]。线纹海马具备特殊的雄性育儿方式，因其具有生长速度快、繁殖和抗病能力强等优点于2009年由我国学者引入并成功进行了人工养殖[3]。目前关于线纹海马育儿袋的研究较少，大多集中于形态学及转录组测序分析。分子生物学层面的研究是解析育儿袋发育的基础。
RNA是细胞生物遗传信息传递的中间载体，在分子生物学领域具有突出地位[4]。RNA提取是分子生物学中RNA相关实验的基础[5]，获得高质量、纯净、完整的RNA是构建cDNA文库、RT-PCR、Northern杂交等后续实验的关键起点[6] [7]。常见的RNA提取方法包括传统的Trizol法、柱式试剂盒法、异硫氰酸胍法和SDS法等[8]，而获取高质量RNA的关键环节在于组织样本的裂解。目前常用的组织匀浆方法包括手动玻璃匀浆器法、研钵液氮研磨法、磁珠法、超声波破碎法等[9]，由于不同组织结构的差异，寻找高效适合的组织匀浆方法极为重要。本实验以探究适用于线纹海马育儿袋RNA提取的组织匀浆方法，分别采用了玻璃匀浆器研磨、磁珠震荡研磨和研钵液氮研磨三种匀浆方式结合柱式试剂盒的方法提取其总RNA，并对获取的总RNA质量进行了评估，为后续进行线纹海马育儿袋RNA相关实验奠定了基础。
2. 材料与方法
2.1. 实验鱼
实验所用的线纹海马购买于福建英特森公司。所购的线纹海马放置于循环水箱中暂养，饲养水温24℃~26℃左右，盐度维持在35‰，并保持12小时的光照和12小时的黑暗环境；每日定时投喂两次，早晚各一次，主要投喂以鲜活糠虾为主；暂养结束后对其进行解剖，取雄性线纹海马的育儿袋组织于干净的无酶管中经液氮速冻后置于−80℃超低温冰箱储存用于后续总RNA的提取。
2.2. 育儿袋匀浆及总RNA提取
实验所用的玻璃匀浆器、研钵、研磨棒、磁珠子、镊子等器皿用前均经烘箱240℃烘烤4小时以上以防RNase污染，枪头、离心管等塑料制品均采用无RNase污染的耗材。
取50 mg左右的育儿袋组织，分别采用三种不同的匀浆方式进行匀浆。(1) 玻璃匀浆器研磨：将组织剪碎置入遇冷的玻璃匀浆器中，加入600 μl的buffer裂解液，在冰上迅速转动匀浆棒研磨组织，使组织尽可能裂解；(2) 磁珠震荡研磨：将组织剪碎置入放入1.5 ml无酶管中，加入6颗小磁珠(d = 1 mm)、1颗大磁珠(d = 5 mm)和600 μl的buffer裂解液，使用FastPrep-24 5G匀浆仪(MP，美国)进行震荡匀浆，参数设置为4 M/s，每次震荡20 s，共计3次；(3) 研钵液氮研磨：将组织置入预冷3 min后的研钵、研杵，用研杵反复碾压研磨组织至粉末状，加入600 μl的buffer裂解液，研磨至糊状后置于常温，溶解后转移1.5 ml无酶管中。
匀浆后的组织使用TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒(Takara，日本)完成后续RNA提取，具体步骤参考试剂盒的说明书，最终溶解洗脱RNA采用50 ul无水进行回收。
2.3. 总RNA样品质量的检测
获得的RNA样品取1 µl采用核酸蛋白测定仪测定其浓度及纯度(NanoPhotometer-N50，德国Implen公司)，并记录OD260/OD280以及OD260/OD230的比值；取3 µl的样品加入1 µl的loading buffer混匀，于180 v、300 mA的设置下进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测其28 S和18 S rRNA条带的亮弱程度。
2.4. cDNA的合成
分别将上述三种匀浆方法所获取的总RNA使用Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (赛默飞，美国)进行反转录。合成20 μl的总反应体系：RNA溶液12 μl、RNase Inhibitor 1 μl、RevertAid M-MuL RT 1 μl、5x PrimerScript Buffer 2 4 μl、10mM dNTP mix 2 μl，65℃ 5 min，立即冰上冷却2 min，42℃ 1 h 20 min，70℃ 5 min，4℃保存。所得产物用内参基因actin进行PCR扩增，引物序列为actin-F：AGCTTCACTACTACTGCTGAGC，actin-R：CATGATGCTGTTGAAGGTGGTC。
3. 结果与分析
3.1. 不同匀浆方式对组织的研磨程度分析
将经三种不同的匀浆方式研磨的组织–裂解液混合物进行离心后观察沉淀组织的情况，结果显示经玻璃匀浆器研磨和磁珠震荡研磨的组织残渣中可观察到明显的透明的筋膜及块状结构，而经研钵液氮研磨的组织残渣呈均一粉末状沉淀(见图1)。
1. grind with glass homogenizer; 2. grind with beads shock; 3. grind with liquid nitrogen
1. 玻璃匀浆器研磨法；2. 磁珠震荡研磨法；3. 研钵液氮研磨法
Figure 1. Tissue residues of different homogenizing methods
图1. 不同匀浆方式的组织残渣
3.2. 不同匀浆方式获取的总RNA的浓度及纯度检测
采取核酸测定仪NanoPhotometer-N50 (Implen公司，德国)测定三种不同匀浆方式获得的RNA的浓度及纯度，结果显示，经玻璃匀浆器研磨和磁珠震荡研磨获取的总RNA浓度分别为18.9 ng/μl和7.8 ng/μl，而经研钵液氮研磨获取的总RNA浓度为76.5 ng/μl；通过测定的A280 nm、A260 nm和A230 nm的相对吸收值可以看出，研钵液氮研磨法的A260/A280比值为2.125，介于2.0~2.2之间，表明RNA的纯度较高，基因组DNA残留较少；三种匀浆方式A260/A230的比值均小于2.0，说明样品中可能存在有机化合物、盐(胍盐)等污染物增加了A230的数值，研钵液氮研磨法的A260/A230的比值均大于玻璃匀浆器研磨法及磁珠震荡研磨法，污染程度最低(见表1)。
Table 1. RNA concentration and purity extracted by different homogenizing methods
表1. 不同匀浆方式提取的RNA浓度及纯度
匀浆方式 |
浓度 |
A260/A280 |
A260/A230 |
玻璃匀浆器研磨法 |
18.9 ng/μl |
2.003 |
1.022 |
磁珠震荡研磨法 |
7.8 ng/μl |
1.624 |
0.936 |
研钵液氮研磨法 |
76.5 ng/μl |
2.125 |
1.410 |
3.3. 总RNA完整性的分析
采用凝胶电泳通过28 S和18 S rRNA条带的亮弱程度判断RNA的降解程度。结果显示，玻璃匀浆器研磨法和磁珠震荡研磨法提取的RNA未见明显条带，而研钵液氮研磨法可以看到清晰的28 S和18 S rRNA两条带，其亮度约等，表示RNA未出现大规模降解，完整性较好(见图2A)。将上述RNA逆转录后的cDNA作为内参基因actin的扩增模板, 结果显示在研钵液氮研磨法获得的RNA反转录模板中扩增到了一条明亮的目的条带(见图2B)，而另外两种匀浆方式所获模板中未扩增出目的条带。
1. grind with glass homogenizer; 2. grind with beads shock; 3. grind with liquid nitrogen
1. 玻璃匀浆器研磨法；2. 磁珠震荡研磨法；3. 研钵液氮研磨法
Figure 2. Electrophoretic images of RNA and PCR amplification products of target gene in different homogenizing methods
图2. 不同匀浆方式的RNA及目的基因PCR扩增产物的电泳图
4. 讨论
RNA提取的原理是通过破碎动植物组织细胞，利用物理及化学方法将RNA和DNA、蛋白质、有机质等分离开来，不同物种和组织间所采取的RNA提取方式各有不同[10]。RNA的提取质量受多种因素的影响，不同组织的样本处理、不同成份的裂解液及RNA的制备方法、环境中的RNase均会影响RNA的提取质量，因此选择适当的提取方法是确保获取高质量RNA的关键[11] [12] [13] [14]。
组织样本的研磨是RNA制备能否成功的关键基础[15]。组织结构的不同所选取的相应匀浆方式亦有差异。动物组织中的胸腺、肾脏、肝胰脏等组织核酸及核酸酶含量较高，组织匀浆简单，采取手动匀浆的方式就可使组织轻易研磨破碎；而对于一些纤维含量丰富且较难处理特殊组织的结构，如心脏、骨骼肌、皮肤、筋膜等组织细胞密度低，单位重量的组织RNA含量较少且匀浆难度大，可采取全自动样本处理器、电动匀浆或液氮研磨等方式来裂解组织。戴先成[16]等在对大鼠心肌组织的研究中发现，采取玻璃匀浆器的匀浆方式能使心肌组织完全裂解获取质量较好的RNA；刘江丽等[17]在对小鼠心脏、肾脏和肝脏的研究中表明采取全自动样本处理器、磁珠法及手动匀浆器的匀浆方式均能获得较高质量的RNA，其中采用全自动样本处理器所获得的RNA浓度最高；海洋无脊椎动物栉孔扇贝和凡纳滨对虾的肝胰腺采取电动匀浆器处理的方式可获得完整性较好的RNA条带，而刺参基于体壁较厚的结缔组织和丰富的胶原蛋白等，组织匀浆难度大，其采用缩短电动匀浆时间，增加匀浆次数的方法获取了质量较好的RNA [18] [19]；此外，液氮碾磨常应用于一些植物组织如毛竹[20]、樱桃[21]、红苹果[22]等以获取较高质量的RNA。
目前，关于鲜有育儿袋RNA提取方法的报道。本实验基于获取高质量育儿袋RNA的目的，采用三种不同的匀浆方式搭配柱式试剂盒的方法来提取线纹海马育儿袋组织中的总RNA，发现采用研钵液氮研磨法能提取到纯度较高、质量较好的RNA，基于主要原因是育儿袋中含有大量结缔组织和胶原蛋白，液氮速冻是组织变脆更易碎化组织成粉末状，进一步便于裂解液充分裂解细胞，而采用玻璃匀浆器和磁珠震荡研磨方式很难研磨育儿袋组织，无法使裂解液充分和细胞接触，匀浆时间过长亦会导致RNA降解，提取质量不佳。
5. 结论
本文采用三种不同的匀浆方式搭配柱式试剂盒方法提取线纹海马育儿袋中的总RNA，结果表明研钵液氮研磨法所提取的RNA效果最佳，质量较好，可用于后续分子相关实验；而匀浆器研磨法和磁珠电动研磨法所获得的RNA纯度不高，质量较差。本研究可为组织结构类似的其它动物组织中RNA的提取及优化提供参考意见。