摘要: 目的：探讨牛源性乳源中分离的金黄色葡萄球菌的分离鉴定及细菌耐药性分析。方法：从临床型乳房炎患病牛的牛乳中采用传统微生物细菌的分离鉴定，革兰氏染色及生化鉴定后，经16S rRNA PCR测序对分离鉴定的金黄色葡萄球菌分型及耐药性分析。结果：分离鉴定出8株金黄色葡萄球菌，其中金黄色葡萄球菌对头孢噻肟最敏感，然后依次是环丙沙星，左氧氟沙星，庆大霉素，阿莫西林，红霉素，青霉素，氨苄西林，对卡那霉素最不敏感。其中2株金黄色葡萄球菌产生生物被膜能力强。结论：金黄色葡萄球菌对多种抗菌药物呈耐药趋势，且牛源性金黄色葡萄球菌的不同菌属对不同药物的耐药性有差异性，收集的不同来源的样本可为今后人源性金黄色葡萄球菌感染的样本，进行进化分析。
Abstract:
Objective: To explore the isolation, identification, and antibiotic resistance analysis of Staphylococcus aureus isolated from bovine milk sources. Method: Traditional microbiological bacteria were isolated and identified from the milk of cows with clinical mastitis, followed by Gram staining and biochemical identification. The isolated and identified Staphylococcus aureus were classified and analyzed for drug resistance using 16S rRNA PCR sequencing. Result: Eight strains of Staphylococcus aureus were isolated and identified, among which Staphylococcus aureus was the most sensitive to cefotaxime, followed by ciprofloxacin, levofloxacin, gentamicin, amoxicillin, erythromycin, penicillin, ampicillin, and least sensitive to kanamycin. Two strains of Staphylococcus aureus have strong biofilm production ability. Conclusion: Staphylococcus aureus shows a trend of resistance to multiple antibiotics, and different genera of bovine Staphylococcus aureus have differences in resistance to different drugs. The collected samples from different sources can be used for evolutionary analysis of future human Staphylococcus aureus infections.
1. 引言
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)是人体皮肤表面、鼻腔及呼吸道黏膜的常见病原菌，能产生多种毒素，引起急性肠胃炎等中毒性综合征[1]-[3]。同时，S. aureus也是引起奶牛乳腺炎的病原之一，可导致产奶量下降。S. aureus通常通过与医护人员直接接触或通过外科手术和植入医疗植入物侵入性医疗过程中来进行传播。细菌的多重耐药性，进一步使医院感染的有效治疗变得复杂，可能由于抗生素耐药的S. aureus感染，导致医疗行业的巨大经济负担。由于临床上抗生素的大量广泛使用，出现S. aureus对多种药物产生耐药性，由于抗生素的滥用，在饮用奶中可能会大量蓄积，对人类健康产生影响[4]。S. aureus在生长过程中，不断向外界分泌毒力因子，这些毒力因子包括黏附素(adhesins)、毒素(toxin)、胞外酶、纤连素结合蛋白(FNB)、荚膜多糖(capsular polysaccharide, CP)、葡萄球菌蛋白A (spa)和生物被膜。这些表面蛋白能够促使S. aureus黏附到宿主细胞表面，从而发生定殖，引发细菌感染、增殖[4]-[6]。S. aureus生物被膜的形成是一个动态过程，包括细菌自身黏附、成熟和分散期等阶段，其发育阶段已被许多文献定义，并且可以被划分成至少三个主要活动：初始附着，生物被膜成熟和散布。因此本课题组从当地呼市周边6个不同地区的牧场中采集患有临床型乳房炎病牛的牛乳，进行细菌的分离鉴定，确定S. aureus的具体分型，并通过刚果红培养基及结晶紫试验确定金黄色葡萄酒生物被膜形成能力的检测，最终对其耐药性进行分析。
2. 材料与方法
2.1. 试验材料
样品收集
位于内蒙古呼和浩特市周边规模化奶牛牧场，患有临床性乳腺炎的奶牛，2018年至今，陆续收集乳样共63例，乳样有明显白色絮状沉淀，少数带血。
2.2. 主要试剂
50%甘油，青霉素药敏纸片(QMS)，红霉素药敏纸片(HMS)，环丙沙星药敏纸片(HBSX)，庆大霉素(低)药敏纸片(QDMS)，头孢噻肟药敏纸片(TBSW)，卡那霉素药敏纸片(KNMS)，阿莫西林药敏纸片(AMSL)，左氧氟沙星药敏纸片(ZYFSX)，氨苄西林药敏纸片(ABSL)，丙三醇，普通琼脂培养基，伊红美蓝培养基，高盐甘露醇培养基，脑心浸出液培养基(BHI)，纤维素刚果红培养基(青岛海博)，蔗糖，麦康凯培养基(依科塞，250 g)，10%氢氧化钠溶液，蒸馏水，蛋白胨，牛肉膏粉，氯化钠，普通肉汤培养基，革兰氏染液，结晶紫染液，PBS，细菌基因组DNA提取盒(天根)，溶菌酶溶液(天根，50 mg/ml)，DNA Loading Buffer，蛋白酶K，DNA Marker (天根，D2000)，核酸染料(百泰克)，Taq PCR Master Mix，上游通用引物27F，下游通用引物R，琼脂粉(Agarose)，TBE。
2.3. 主要仪器
细胞培养版96孔(BIOFIL)，1 L锥形瓶，高压锅，玻璃棒，PH试纸，超净台，试管，无菌试管塞，酒精灯，取菌环，75%酒精，300 μL移液器，无菌EP管，无菌枪头，高压锅，离心机，恒温培养箱，凝胶成像系统(ChampGe 1500)，电泳槽，全波长酶标仪(1510)，双层台式空气恒温振荡器(HZQ-C)，PCR仪(Gene Company Limited)，微波炉。
2.4. 试验方法
将预先采集好的样品在麦康凯、普通琼脂、高盐甘露醇、伊红美蓝培养基上进行分离细菌，再进行多次接种于营养肉汤和营养琼脂培养基，纯化增菌。待得到单克隆菌株后，显微镜面观察菌落形态，发现单个圆形不规则金黄色光滑菌落，直径6⁓8 mm，保存该菌株。按照上述方法，多次分离纯化，根据美国临床与实验室标准化协会(CLSI) 2015年版标准进行药敏实验；将菌株接种到纤维素刚果红培养基上进行培养观察；随后将菌液接种到96板孔上进行结晶紫试验，在酶标仪下检测其波长为570 nm的OD值；将分离纯化好的菌液进行DNA提取，提取后通过PCR扩增仪进行扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳试验，将琼脂糖凝胶在凝胶成像系统下进行观察并将目标区域的进行基因序列对比来确认菌型。
2.4.1. 细菌的分离鉴定
将2018年4月⁓2022年11月采集的牛乳样，共63样。在无菌条件下，用取菌环蘸取奶样，每种分别接种于麦康凯固体培养基，普通琼脂固体培养基，高盐甘露醇固体培养基，伊红美蓝固体培养基。倒置于37℃恒温培养箱培养24小时。同批次未长出菌落的进行重复实验。
2.4.2. 纯化增菌及鉴定
在无菌条件下，用取菌环挑取预增菌中，典型的单克隆菌落接种于相应固体培养基上进行纯化，37℃恒温培养箱培养18 h观察。选取平板上典型菌落接种于预先配置好的肉汤中继续纯化增菌，重复上述步骤3⁓4次。肉眼观察菌落，疑似S. aureus进行革兰染色法染色，油镜下，呈单个球形蓝紫色单克隆，直径6⁓8 mm，保存该菌株。
2.4.3. 生化试验
对分离出的疑似S. aureus进行生化鉴定，包括过氧化氢试验，葡萄球菌血浆凝固酶实验等。挑取待检菌落进行革兰氏染色镜检，将新鲜菌苔接种于普通肉汤37℃培养18⁓24 h或用0.9%无菌生理盐水稀释0.5 McFa-rland (约10 cfu/mL)，各吸取0.05⁓0.08 mL (约1⁓2滴)的肉汤培养物或菌悬液加入每种微量西林瓶内。将已接种的西林瓶再套上胶塞，一般采用全加塞。在无菌条件下，将肉汤培养物分别加入葡萄糖、5%乳糖、甘露醇微量西林瓶内，次日后观察。挑取固体培养基上的菌落，置于试管内，滴加3%过氧化氢溶液2 ml，观察是否有气泡产生。无菌条件下，冻干血浆西林瓶内加入适量生理盐水，溶解后加入S. aureus肉汤培养物，2 h⁓6 h后观察。未出现预期现象的进行重复实验。
2.4.4. 药敏试验
吸取配置好的菌液50 μL，滴在培养基上，用灭菌的玻璃推棒均匀涂布于固体琼脂板上，将平板平均分为四区，每区用无菌镊放置一片药敏片，置于37℃恒温培养箱培养18 h，测量菌环直径。目前，S. aureus呈现多重耐药、强耐药，临床治疗S. aureus引起的感染十分困难，为减少S. aureus耐药菌株的出现，达到最好的治疗效果，在药敏实验的基础上，合适地选用有效首选药十分重要。
2.4.5. 金黄色葡萄球菌分离株的基因16S rRNA鉴定
运用16S rRNA基因的通用扩增引物，见表1，上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，扩增目的片段大小约为1500 bp。PCR反应体系为：PCR MasterMix 10.0 μL，模板1.0 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O补充至20 μL。PCR反应条件为：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸90 s，共35个循环；72℃再延伸10 min；4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
Table 1. Universal primers for gene amplification
表1. 基因扩增通用引物
Lot No |
Oligo Name |
Sequence (5’ to 3’) |
2600292577 |
27F |
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG |
2600292578 |
27R |
AAGGAGGTGATCCAGCCGCA |
3. 结果
3.1. 金黄色葡萄球菌的分离及形态学观察
疑似患病样本中，分离菌株在选择性培养基上培养24 h后，多个表面隆起的金黄色菌落，革兰氏染色后，有6株为典型的革兰氏阳性菌，镜检，呈葡萄串状排列，见图1。
Figure 1. Microscopy of morphology of isolates (10 × 100)
图1. 分离菌形态的镜下观察(10 × 100)
3.2. 金黄色葡萄球菌分离株的在刚果红培养基上的菌落特性
金黄色葡萄球菌的分离菌株在刚果红培养板上可见白色隆起的菌落，且菌落光滑，表面该鉴定菌株可能有产生生物被膜的能力，有待进一步验证，见图2。
Figure 2. Colony growth morphology of isolates on Congo red culture medium
图2. 分离菌在刚果红培养基上的菌落形态
3.3. 分离菌株的生化试鉴定
结果显示，甘露醇试验阳性率为33.33%，葡萄糖试验阳性率为66.67%，5%乳糖试验阳性率为100%，过氧化氢试验阳性率为100%，葡萄球菌血浆凝固酶试验阳性率为100%，见图3。
Figure 3. Biochemical identification results of isolated bacteria
图3. 分离菌生化鉴定结果
3.4. 分离株药物敏感性试验
结果显示S. aureus对头孢噻肟最敏感，然后依次是环丙沙星，左氧氟沙星，庆大霉素，阿莫西林，红霉素，青霉素，氨苄西林，对卡那霉素最不敏感。见图4。
(a) (b)
Figure 4. Drug sensitivity test results
图4. 药物敏感试验结果
3.5. 分离株16s rRNA序列的检测
将分离株经过16s rRNA基因PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见在1500 bp的条带附近，有明显的目的条带，扩增产物序列与金黄色葡萄球菌大小与预期一致，见图5。
Figure 5. Electrophoretic profile of PCR product of 16S rRNA
图5. 16S rRNA PCR产物电泳图
4. 讨论
随着抗生素的滥用，细菌的多重耐药性，进一步使医院感染的有效治疗变得复杂，耐药性不断增强[1] [7] [8]。食物、水源、医院及社区感染金黄色葡萄球菌的风险也在提高，随着人民生活水平提高，食物来源的污染，是否也增加了人类对于金黄色葡萄球菌耐药性的问题，始终是困扰人们的问题[9]-[12]。因此，对于不同感染来源的菌株收集十分有必要，今后是对细菌进化分析的基础[13]-[15]。本研究对呼市周边疑似患有乳腺炎的奶牛，其乳源来源的样本进行收集，从63个样本中，进行生化检测、免疫学检测法及分子生物学检测等分离鉴定出8金黄色葡萄球菌，其中药物敏感性试验发现对头孢噻肟最敏感，然后依次是环丙沙星，左氧氟沙星，庆大霉素，阿莫西林，红霉素，青霉素，氨苄西林，对卡那霉素最不敏感。其中2株金葡菌能产生生物被膜，且能力较强，有待进一步对分离株进行进化分析及致病性研究。
基金项目
本文受内蒙古医科大学青年培育项目(YKD2021QN010)，内蒙古医科大学科研项目(YKD2024MS004)资助。
NOTES
*通讯作者。