铁棒锤中的二萜生物碱

Diterpenoid Alkaloids from Aconitum pendulum Busch

摘要: 目的：研究铁棒锤Aconitum pendulum Busch的化学成分。方法：铁棒锤提取物采用大孔树脂，硅胶柱层析以及半制备高效液相色谱对其进行分离纯化，根据其波谱数据进行结构解析。结果：从其中分离得到10个化合物，分别鉴定为Songorine (1)、15-acetylsongorine (2)、12-epi-lucidusculine (3)、14-O-acetylneoline (4)、benzoylaconitine (5)、aconitine (6)、3-deoxyaconitine (7)、mesaconitine (8)、10-aconifine (9)、flavaconitine (10)。

Abstract: Objective: This study aims to analyze the chemical composition of Aconitum pendulum Busch. Methods: The extracts obtained from Aconitum pendulum Busch were purified using macroporous resin, silica gel column chromatography, and semi-preparative high-performance liquid chromatography. The structural analyses were conducted based on their spectral data. Results: Ten compounds were isolated from them and identified as Songorine (1), 15-acetylsongorine (2), 12-epi-lucidusculine (3), 14-O-acetylneoline (4), benzoylaconitine (5), aconitine (6), 3-deoxyaconitine (7), mesaconitine (8), 10-aconifine (9), flavaconitine (10).

1. 引言

铁棒锤(Aconitum pendulum Busch)为毛茛科，乌头属多年生草本植物。植物智中记载其别名，铁牛七、雪上一枝蒿、一支箭。根呈块根倒圆锥形，茎高26~100厘米，无毛，叶片形状似伏毛铁棒锤，7~9月开花。主要分布于西藏、云南西北部、四川西部、青海、甘肃南部、陕西南部及河南西部。生海拔2800~4500米，山地或林边。《陕西中草药》中记载其块根有剧毒、供药用、治疗跌打损伤、骨折、风湿腰痛、冻疮等。铁棒锤主要活性成分为二萜生物碱、黄酮、多糖、甾体等活性成分。现代药理研究发现该植物所含乌头类生物碱成分，具有显著的镇痛麻醉、抗炎、抗肿瘤等作用[1] [2] [3]，并且其所含的二萜生物碱具有优良的杀虫效果[4]。铁棒锤是从亳州市场购买所得，将其干燥母根粉碎后用甲醇浸泡，通过减压浓缩得到总浸膏，对总浸膏通过调节pH值使用二氯甲烷进行萃取，得到二氯(酸萃取)部分和二氯(碱萃取)部分。进行减压浓缩后，通过薄层色谱分析(TLC)观察化合物极性大小，使用不同的色谱柱层析和半制备高效液相色谱(HPLC)进行分离纯化得到单体化合物，利用核磁共振波谱(NMR)、质谱、红外、紫外进行化合物结构解析。通过以上方法，分离纯化鉴定出10个单体化合物。

2. 结果与讨论

2.1. 化合物的结构鉴定

根据化合物的理化性质，通过核磁共振氢谱、碳谱、二维谱图等对分离出的10个单体化合物进行结构解析。

1) songorine

白色无定形粉末，易溶于甲醇和DMSO，改良碘化铋钾呈阳性；综合¹H-NMR与¹³C-NMR数据推测该化合物分子式为C₂₂H₃₁NO₃。化合物3的¹H-NMR (500 MHz, Dimethyl Sulfoxide-d₆)显示了环外双键[δ_H5.06 1H, brs, H-17a; δ_H5.11 1H, brs, H-17b; δ_C150.0; δ_C110.8; ]和N-乙基[δ_H 1.33 (3H, t, J = 7. 1 Hz)]的信号。¹³C-NMR (125 MHz, Dimethyl Sulfoxide-d₆) δc：67.4(C-1)，29.7(C-2)，35.8(C-3)，35.0(C-4)，46.6(C-5)，21.5(C-6)，42.9(C-7)，47.6(C-8)，36.2(C-9)，52.4(C-10)，37.4(C-11)，208.1(C-12)，53.2(C-13)，30.7(C-14)，75.0(C-15)，150.0(C-16)，110.8(C-17)，24.9(C-18)，55.1(C-19)，65.0(C-20)，53.4(C-21)，9.7(C-22)。通过查阅文献[5]。与其报道的数据一致，确定该化合物为songorine。

2) 15-acetylsongorine

无色晶体，易溶于甲醇和二氯，改良碘化铋钾呈阳性；通过¹H-NMR与¹³C-NMR数据推测该化合物分子式为C₂₄H₃₃NO₄。化合物4的¹H-NMR (500 MHz, Chloroform-d)显示了环外双键[δ_H4.98 1H, brs, H-17a; δ_H5.30 1H, brs, H-17b; δ_C144.2; δ_C113.8;]，N-乙基[δ_H 1.33 (3H, t, J = 7. 1 Hz)]和乙酰基[δ_H0.923H, s, OCH₃; δ_C170.4; δ_C21.6]的信号。¹³C-NMR (125 MHz, Chloroform-d)δc：68.4(C-1)，29.4(C-2)，32.3(C-3)，35.8(C-4)，48.3(C-5)，23.6(C-6)，43.6(C-7)，53.9(C-8)，37.0(C-9)，48.3(C-10)，38.3(C-11)，207.6(C-12)，55.1(C-13)，37.4(C-14)，76.0(C-15)，144.2(C-16)，113.8(C-17)，25.8(C-18)，56.0(C-19)，66.3(C-20)，53.6(C-21)，10.3(C-22)，170.4(COCH₃)，21.6(COCH₃)。通过查阅文献[6]。与其报道的数据一致，确定该化合物为15-acetylsongorine。

3) 12-epi-lucidusculine

白色无定形粉末，易溶于甲醇，改良碘化铋钾呈阳性；通过¹H-NMR与¹³C-NMR数据推测该化合物分子式为C₂₄H₃₅NO₄。化合物7的¹H-NMR (500 MHz, Methanol-d4)显示了环外双键[δ_H5.13 1H, brs, H-17a; δ_H5.63 1H, brs, H-17b; δ_C 148.4; δ_C114.8;]，N-乙基[δ_H 1.39 (3H, t, J = 7. 2 Hz)]和乙酰基[δ_H 0.92 3H, s, OCH₃; δ_C 170.8; δ_C 21.8]的信号。¹³C-NMR (125 MHz, Chloroform-d)δc：68.6(C-1)，29.8(C-2)，37.0(C-3)，35.8(C-4)，47.5(C-5)，24.0(C-6)，44.1(C-7)，49.1(C-8)，41.0(C-9)，54.7(C-10)，29.8(C-11)，66.5(C-12)，44.1(C-13)，32.7(C-14)，76.0(C-15)，148.4(C-16)，114.8(C-17)，26.0(C-18)，56.5(C-19)，65.9(C-20)，53.9(C-21)，10.4(C-22)，170.8(COCH₃)，21.8(COCH₃)。通过查阅文献[6]。与其报道的数据一致，确定该化合物为12-epi-lucidusculine。

4) 14-O-acetylneoline

白色无定形粉末，易溶于甲醇和氯仿，与改良碘化铋钾试剂呈现阳性反应；通过¹H-NMR与¹³C-NMR数据推测该化合物分子式为C₂₆H₄₆NO₇。化合物8的¹H-NMR(500MHz, Methanol-d4)显示了单取代乙酰基[δ_H2.06(3H, s, COMe)]和一个氮乙基[δ_H 1.17(3H, t, J = 7.2Hz)]的信号，三个甲氧基[δ_H3.38、3.34和3.35(各3H, s)]。δc：73.7(C-1)，30.5(C-2)，30.7(C-3)，39.3(C-4)，45.4(C-5)，84.7(C-6)，55.0(C-7)，75.0(C-8)，45.6(C-9)，44.6(C-10)，50.7(C-11)，30.32(C-12)，39.2(C-13)，77.7(C-14)，42.4(C-15)，84.2(C-16)，64.0(C-17)，81.2(C-18)，58.4(C-19)，49.1(C-20)，13.4(C-21)，58.3(6-OMe)，56.5(16-OMe)，59.4(18-OMe)，170.8(COCH₃)，21.8(COCH₃)。通过查阅文献[6]，与其报道的数据一致，确定该化合物为14-O-acetylneoline。

5) benzoylaconitine

白色无定形粉末，易溶于甲醇，与改良碘化铋钾试剂呈现阳性反应；通过¹H-NMR与¹³C-NMR数据推测该化合物分子式为C₃₂H₄₅NO₁₀。化合物10的¹H-NMR(500 MHz, Methanol-d4)显示了单取代芳环[δ_H8.10(2 H, d, J = 7.5Hz), 7.61(1 H, t, J = 7.5Hz), 7.48(2 H, t, J = 7.5 Hz)]，四个甲氧基[δ_H3.33、3.36、3.40和3.71(各3 H，s)]和一个氮乙基[δ_H 1.42(3H, t, J = 7.2Hz)]。δc：81.7(C-1)，30.2(C-2)，70.7(C-3)，44.4(C-4)，41.7(C-5)，80.7(C-6)，51.0(C-7)，76.2(C-8)，45.4(C-9)，44.1(C-10)，50.1(C-11)，37.3(C-12)，78.9(C-13)，83.1(C-14)，80.7(C-15)，94.0(C-16)，65.4(C-17)，78.2(C-18)，51.7(C-19)，51.3(C-20)，11.2(C-21)，55.2(1-OMe)，58.2(6-OMe)，61.2(16-OMe)，59.2(18-OMe)，167.6(Ar-CO)131.5(C-1’)，129.5(C-2’,6’)，131.0(C-3’,5’)，134.3(C-4’)。通过查阅文献[7]，与其报道的数据一致，确定该化合物为benzoylaconitine。

6) aconitine

白色无定形粉末，易溶于甲醇和氯仿，与改良碘化铋钾试剂呈现阳性反应；通过¹H-NMR与¹³C-NMR数据推测该化合物分子式为C₃₃H₄₇NO₁₀。化合物11的¹H-NMR (500 MHz, Chloroform-d)显示了单取代芳环[δ_H8.01(2 H, d, J = 7.5 Hz)、7.57(1 H, t, J = 7.5 Hz)、7.45(2 H, t, J = 7.5Hz)]，单取代乙酰基[δ_H1.39 3H, s, OCH₃; δ_C 172.6; δ_C 21.5]，四个甲氧基[δ_H3.16, 3.26, 3.29和3.74(各 3H，s)]和一个氮乙基[δ_H 1.12(3H, t, J = 7.1 Hz)]。δc：82.2(C-1)，33.3(C-2)，71.5(C-3)，43.2(C-4)，46.4(C-5)，83.4(C-6)，44.8(C-7)，92.0(C-8)，44.2(C-9)，40.9(C-10)，50.2(C-11)，35.8(C-12)，74.2(C-13)，79.0(C-14)，78.9(C-15)，90.1(C-16)，61.3(C-17)，76.8(C-18)，47.5(C-19)，49.1(C-20)，13.2(C-21)，56.0(1-OMe)，58.2(6-OMe)，61.3(16-OMe)，59.2(18-OMe)，8-OAc(172.6, 21.5)167.2(Ar-CO)129.8(C-1’)，129.7(C-2’,6’)，128.8(C-3’,5’)，133.5(C-4’)。通过查阅文献[8]，与其报道的数据一致，确定该化合物为benzoylaconitine。

7) 3-deoxyaconitine

白色无定形粉末，易溶于甲醇和氯仿，与改良碘化铋钾试剂呈现阳性反应；通过¹H-NMR与¹³C-NMR数据推测该化合物分子式为C₃₄H₄₇NO₁₀。化合物12的¹H-NMR(500 MHz, Chloroform-d)显示了单取代芳环[δ_H8.02(2 H, d, J = 7.5Hz), 7.57(1 H, t, J = 7.5Hz), 7.45(2 H, t, J = 7.5 Hz)]，单取代乙酰基[δ_H1.37 3H, s, OCH₃; δ_C 172.6; δ_C 21.5]，四个甲氧基[δ_H3.16、3.27、3.28和3.73(各3 H，s)]和一个氮乙基[δ_H 1.09(3H, t, J = 7.1Hz)]。δc：85.4(C-1)，26.5(C-2)，35.4(C-3)，39.2(C-4)，49.2(C-5)，83.4(C-6)，45.3(C-7)，92.3(C-8)，44.7(C-9)，41.1(C-10)，49.4(C-11)，36.8(C-12)，74.3(C-13)，79.0(C-14)，79.1(C-15)，90.3(C-16)，61.5(C-17)，80.4(C-18)，53.3(C-19)，50.1(C-20)，13.6(C-21)，56.4(1-OMe)，58.2(6-OMe)，61.2(16-OMe)，59.2(18-OMe)，8-OAc(172.6, 21.6)166.3(Ar-CO)130.0(C-1’)，129.8(C-2’,6’)，128.8(C-3’,5’)，133.4(C-4’)。通过查阅文献[8]，与其报道的数据一致，确定该化合物为3-deoxyaconitine。

8) mesaconitine

白色无定形粉末，易溶于甲醇和氯仿，与改良碘化铋钾试剂呈现阳性反应；通过¹H-NMR与¹³C-NMR数据推测该化合物分子式为C₃₃H₄₅NO₁₁。化合物14的¹H-NMR(500 MHz, Chloroform-d)显示了单取代芳环[δ_H8.03(2 H, d, J = 7.5Hz), 7.57(1 H, t, J = 7.5Hz), 7.45(2 H, t, J = 7.5 Hz)]，单取代乙酰基[δ_H1.38 3H, s, OCH₃; δ_C 172.6; δ_C 21.6]，四个甲氧基[δ_H3.16、3.28、3.30和3.74(各3 H，s)]和一个氮甲基[δ_H2.34(3H, s)]。δc：83.3(C-1)，35.9(C-2)，71.4(C-3)，43.6(C-4)，46.8(C-5)，82.6(C-6)，44.4(C-7)，92.0(C-8)，43.8(C-9)，41.0(C-10)，49.6(C-11)，34.3(C-12)，74.2(C-13)，79.0(C-14)，79.0(C-15)，90.2(C-16)，61.2(C-17)，76.6(C-18)，50.1(C-19)，42.6(C-20)，56.5(1-OMe)，58.1(6-OMe)，62.3(16-OMe)，59.3(18-OMe)，8-OAc(172.6, 21.6)，166.3(Ar-CO)，129.9(C-1’)，129.8(C-2’,6’)，129.7(C-3’,5’)，133.5(C-4’)。通过查阅文献[9] [10]，与其报道的数据一致，确定该化合物为mesaconitine。

9) 10-aconifine

白色无定形粉末，易溶于甲醇和氯仿，与改良碘化铋钾试剂呈现阳性反应；通过¹H-NMR与¹³C-NMR数据推测该化合物分子式为C₃₄H₄₇NO₁₂。化合物15的¹H-NMR (500 MHz, Chloroform-d)显示了单取代芳环[δ_H8.00(2 H, d, J = 7.5 Hz)、7.59(1 H, t, J = 7.5 Hz)、7.46(2 H, t, J = 7.5 Hz)]，单取代乙酰基[δ_H1.44 3H, s, OCH₃; δ_C 172.5; δ_C 21.3]，四个甲氧基[δ_H3.20、3.29、3.33和3.76(各3 H，s)]和一个氮乙基[δ_H 1.30(3 H, t, J = 7.1 Hz)]。δc：80.8(C-1)，35.3(C-2)，70.4(C-3)，43.7(C-4)，43.2(C-5)，82.3(C-6)，44.8(C-7)，89.8(C-8)，55.3(C-9)，78.5(C-10)，55.9(C-11)，44.8(C-12)，74.0(C-13)，78.5(C-14)，78.6(C-15)，89.8(C-16)，62.3(C-17)，76.3(C-18)，50.2(C-19)，50.3(C-20)，11.8(C-21)，58.5(1-OMe)，59.2(6-OMe)，61.6(16-OMe)，51.0(18-OMe)，8-OAc(172.5, 21.3)166.1(Ar-CO)129.7(C-1’)，129.4(C-2’,6’)，128.9(C-3’,5’)，133.7(C-4’)。通过查阅文献[10]，与其报道的数据一致，确定该化合物为10-aconifine。

10) flavaconitine

白色无定形粉末，易溶于甲醇和氯仿，与改良碘化铋钾试剂呈现阳性反应；通过¹H-NMR与¹³C-NMR数据推测该化合物分子式为C₃₁H₄₁NO₁₁。化合物16的¹H-NMR (500 MHz, Dimethyl Sulfoxide-d₆)显示了单取代芳环[δ_H7.98(2 H, d, J = 7.5Hz), 7.69(1 H, t, J = 7.5 Hz), 7.58(2 H, t, J = 7.5 Hz)]，单取代乙酰基[δ_H1.35 3H, s, OCH₃; δ_C 172.4; δ_C 21.5]和三个甲氧基[δ_H3.14、3.25和3.59(各3 H，s)]。δc：67.0(C-1)，27.4(C-2)，29.2(C-3)，36.6(C-4)，38.6(C-5)，81.7(C-6)，48.2(C-7)，90.5(C-8)，51.6(C-9)，78.4(C-10)，53.1(C-11)，47.1(C-12)，74.6(C-13)，77.9(C-14)，77.2(C-15)，87.4(C-16)，61.4(C-17)，79.2(C-18)，47.6(C-19)，57.0(6-OMe)，58.7(16-OMe)，58.1(18-OMe)，8-OAc(171.4, 20.9)，165.1(Ar-CO)，129.2(C-1’)，129.4(C-2’,6’)，128.9(C-3’,5’)，133.7(C-4’)。通过查阅文献[6]，与其报道的数据一致，确定该化合物为flavaconitine。

2.2. 讨论

本次研究主要从铁棒锤的干燥母根提取分离出10个已知化合物包括三个C₂₀-二萜生物碱Songorine (1)、15-acetylsongorine (2)、12-epi-lucidusculine (3)；七个C₁₉-二萜生物碱：14-O-acetylneoline (4)、benzoylaconitine (5)、aconitine (6)、3-deoxyaconitine (7)、mesaconitine (8)、10-aconifine (9)、flavaconitine (10)。实验结果发现铁棒锤中生物碱主要以C₁₉-二萜生物碱为主，C₂₀-二萜生物碱次之。根据相关文献报道C₁₉-二萜生物碱具有一定的抗肿瘤、抗炎、抑菌和杀虫等生物活性[11]，所以此次实验对铁棒锤的化学成分研究具有重要意义，为铁棒锤的开发利用提供参考。

3. 提取与分离

将铁棒锤的根(10 kg)研磨成粉末，然后用甲醇提取三次，减压浓缩后得到甲醇提取物1.3 kg。将得到的提取物溶于温水中(50℃)，用4% 盐酸调节pH值至2~3，再用二氯萃取三次，减压浓缩得到生物碱粗提物X (131.3 g)。水相用4%氢氧化钠调节pH值至11，再用二氯萃取三次得到生物碱粗提物Y (40.23 g)。

将生物碱粗提取物X用大孔树脂进行除色素和分段，洗脱液为甲醇和水(30%甲醇，50%甲醇，80%甲醇，100%甲醇)进行梯度洗脱，得到5个组分(A~E)，将组A (10.3 g)溶于温水中(50℃)用4%氢氧化钠调节pH值至13，用二氯萃取三次得到组分A-1，经过正相柱层析洗脱(二氯：甲醇，100:1~5:1)得到化合物2。组分B (10.5 g)进行正相柱层析洗脱(二氯：甲醇，50:1~2:1)得到化合物1。组分C (23.42 g)进行反相硅胶柱层析，洗脱剂为甲醇和水(0%甲醇-100%)进行梯度洗脱得到组分(C1~C10)。C1 (8.5 g)组分经过正相硅胶柱层析洗脱，用二氯和甲醇(100:1~20:1)洗脱得到(C1-1~C1-6)，C1-1 (0.1 g)经过葡聚糖凝胶柱，洗脱剂为二氯：甲醇(1:1)得到化合物3，C1-2 (1.82 g)经过正相硅胶柱层析洗脱(二氯：甲醇，60:1~40:1)得到化合物4，C1-3 (0.81 g)经过正相硅胶柱层析(二氯：甲醇，70:1~15:1)洗脱得到化合物5，C1-4 (1.4 g)经过正相硅胶柱层析(二氯：甲醇，50:1~20:1)洗脱得到化合物6。C3(3.16 g)经过正相硅胶柱层析(二氯：甲醇，80:1~5:1)洗脱得到化合物7。C4 (1.14 g)经过正相硅胶柱层析(二氯：甲醇，80:1~20:1)洗脱有白色晶体析出为化合物8。C5 (2.44 g)经过正相硅胶柱层析(二氯：甲醇，60:1~5:1)洗脱后有白色晶体析出得到其化合物9。C6 (1.71 g)经过正相硅胶柱层析(二氯：甲醇，50:1~5:1)洗脱后有白色晶体析出为化合物10。

4. 结论

从铁棒锤中提取分离出10个二萜生物碱，通过核磁共振波谱数据与文献进行结构鉴定，得出6个C-₁₉二萜生物碱和4个C-₂₀二萜生物碱，分别为Songorine (1)、15-acetylsongorine (2)、12-epi-lucidusculine (3)、14-O-acetylneoline (4)、benzoylaconitine (5)、aconitine (6)、3-deoxyaconitine (7)、mesaconitine (8)、10-aconifine (9)、flavaconitine (10)。