预冻温度对罗非鱼皮胶原纤维海绵结构及性能影响

Effect of Pre-Freezing Temperature on the Structure and Properties of Tilapia Skin Collagen Fiber Sponge

摘要: 本研究以罗非鱼皮为原料，探究预冻温度−20℃ (CFS/−20)、−40℃ (CFS/−40)、−60℃ (CFS/−60)、−80℃ (CFS/−80)以及液氮速冻(CFS/LN)对自组装胶原纤维海绵(CFS)结构及性能的影响。扫描电子显微镜(SEM)和X射线衍射图谱(XRD)结果表明，随着预冻温度降低，罗非鱼皮自组装胶原纤维海绵结构致密度逐渐减小，CFS/−20最为致密，且海绵的纤维直径逐渐变大。通过测定胶原纤维海绵的孔隙率、吸水率和保水率，发现CFS/−20、CFS/−40、CFS/−60、CFS/−80、CFS/LN的孔隙率和吸水率逐渐增大。ATR-FTIR结果显示，CFS/−20到CFS/−80于酰胺A带波数略有增加，表明氢键作用减弱。且随着温度降低，压缩强度减小，机械性能下降，抗酶解性减弱。综上所述，预冻温度对罗非鱼皮胶原纤维海绵的结构及性能具有显著影响。

Abstract: This study investigates the effect of pre-freezing temperatures (−20°C (CFS/−20), −40°C (CFS/−40), −60°C (CFS/−60), −80°C (CFS/−80), and liquid nitrogen flash freezing (CFS/LN)) on the structure and properties of self-assembled collagen fiber sponge (CFS) derived from tilapia skin. Scanning electron microscopy (SEM) and X-ray diffraction (XRD) results indicate that with decreasing pre- freezing temperature, the structure density of tilapia skin self-assembled collagen fiber sponge gradually decreases, with CFS/−20 being the most dense, and the fiber diameter of the sponge gradually increases. The porosity, water absorption rate, and water retention rate of the collagen fiber sponge increase gradually from CFS/−20 to CFS/−80 and CFS/LN. ATR-FTIR results show a slight increase in the wave number of the amide A band from CFS/−20 to CFS/−80, indicating a weakening of hydrogen bonding. Furthermore, with decreasing temperature, the compressive strength decreases, mechanical properties decline, and resistance to enzymatic degradation weakens. In conclusion, pre-freezing temperature significantly affects the structure and properties of tilapia skin collagen fiber sponge.

1. 引言

胶原蛋白是一类广泛存在于哺乳动物的软骨、皮肤以及其他结缔组织中的天然大分子蛋白。因其具有生物相容性、生物降解性、生物安全性、低免疫性和止血性等良好的生物学性能，被广泛应用于食品、化妆品、生物材料、医药等领域[1]。传统上，陆生动物如猪、牛等一直是胶原蛋白类产品的主要来源，然而，陆地动物来源的胶原蛋白由于受到诸如口蹄疫(FMD)、疯牛病(TSE)等人兽共患病的威胁，以及宗教信仰的限制，如伊斯兰教对猪肉制品的禁令，使其在应用上受到限制[2]。因此，水产动物以其安全性高、胶原蛋白含量高、来源广泛、易于提取和无宗教限制等优点越来越受到关注，被视为陆生动物胶原蛋白的重要替代来源[3]。罗非鱼因其生长快速、繁殖力强、产量高、适应性强等优点，得到了联合国粮农组织的推广[4]。我国是世界上最大的罗非鱼养殖国，也是最大的罗非鱼出口国[5]。罗非鱼在加工产品过程中会产生大量的副产物例如鱼鳞、鱼皮等，这些副产物大多被丢弃，基本没有被充分利用[6]。鱼皮是水产品加工中丰富的副产物之一，罗非鱼皮胶原蛋白含量高，脂肪含量较低，是提取胶原蛋白的理想原材料[7]。综合研究和利用罗非鱼皮胶原蛋白，有助于实现罗非鱼皮副产物的高值化利用，减少环境污染和资源浪费，提高经济利润和社会效益。

胶原纤维是由交错的微原纤维组合而成的具有层层缠绕状结构的蛋白，在罗非鱼皮组织结构中广泛存在。在稀醋酸体系中，将鱼皮先进行酸松弛，然后利用胃蛋白酶进行水解，打开胶原纤维之间的连接键，可获得具有更多活性基团的纤维束形状的胶原纤维[8]。胶原纤维海绵制备方法主要包括两种：一种是胶原分子低温成胶后冷冻干燥形成的胶原海绵，另一种是由胶原先自聚集形成水凝胶后经冷冻干燥制备而成的胶原纤维海绵。冷冻干燥是胶原海绵制备工艺中的关键一步，是通过在真空条件下直接升华固态中的水分，获得疏松多孔的海绵结构的一种方法。冷冻干燥技术操作简便，低温条件下不会破坏胶原材料的结构和性能，是制备海绵材料的常用方法[9]。胶原纤维海绵的高孔隙率，优异的生物相容性和促凝特性，使其在伤口敷料和药物缓释等生物医用材料领域具有广阔的应用前景。目前对于胶原纤维海绵的研究，主要集中在胶原纤维海绵的改性。如Yan等[10]利用冻干工艺制备了氧化白芨改性的胶原纤维复合止血海绵，发现其多孔三维网络结构带来了优异的膨松性和吸水性；同时，该海绵符合细胞毒性分级标准的安全性能要求，是一种具有应用潜力的优良止血材料。此外，还发现探讨胶原海绵冻干工艺的研究。如Pawelec等[11]发现采用冻干法来制备胶原材料的过程中，所使用的模具的散热速率对于材料的孔隙结构有着显著的影响。通过模具设计控制冷冻干燥中的散热速率，能够有效地调控胶原材料的孔隙结构，优化其性能。通常，冷冻干燥过程分为预冻和冷冻干燥两个阶段。预冻阶段的条件对海绵的表面和内部结构以及物理化学性能有极大的影响，即不同的预冻条件产生不同品相的海绵。但是目前关于预冻温度对胶原纤维海绵结构和性能影响的研究较少。本研究拟采用−20℃、−40℃、−60℃、−80℃以及液氮预冻处理罗非鱼皮胶纤维海绵，采用扫描电镜、红外光谱、X射线衍射光谱对海绵结构和形貌特征进行表征。并对其性能进行了评价，包括机械性能、孔隙率、抗酶解性、吸水率和保水率等。明确预冻温度变化对罗非鱼皮胶原纤维海绵的结构和性能的影响，为胶原基生物材料的制备和开发提供依据和参考。

2. 实验部分

2.1. 材料与试剂

罗非鱼皮采购于广东水产品加工厂，−20℃保存；氢氧化钠，国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；磷酸氢二钠，国药集团化学试剂有限公司；磷酸二氢钠，国药集团化学试剂有限公司；胃蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司；I型胶原酶，德国Biofroxx生物试剂。

2.2. 仪器与设备

真空冷冻干燥机，FD5型，北京金西盟仪器有限公司；扫描电子显微镜，JSM-6700F型，日本JEOL公司；衰减全反射傅里叶变换红外光谱仪，Nicolet 6700型，美国Thermo Fisher Scientific公司；X射线衍射仪，D/MAX/2500 PC型，日本Rigaku公司；电子万能试验机，UTM6000型，深圳三思纵横科技股份有限公司；高速冷冻离心机，CT14RD Ⅱ型，上海天美科学仪器有限公司；医用低温冰箱，HD-86L390型，海信集团有限公司。

2.3. 实验方法

2.3.1. 罗非鱼皮酶促溶性胶原的制备

罗非鱼皮酶促溶性胶原的制备参考Xiang [12]的方法。取适量鱼皮剪成块状，按照料液比1:20加入10%正丁醇溶液，在4℃下脱脂8 h，并重复三次；用蒸馏水冲洗干净后，再按照相同比例加入0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡24 h以除去非胶原成分。水洗至中性后按照1:50的比例在鱼皮中加入0.5 M的醋酸溶液，并加入鱼皮质量0.5%的胃蛋白酶于4℃条件下搅拌提取48 h，离心收集上清液。加入NaCl至终浓度为0.9 M盐析，离心收集沉淀溶于0.5 M醋酸溶液中，用0.02 M的Na₂HPO₄溶液透析24 h，再用0.1 M醋酸溶液透析24 h，最后用蒸馏水透析48 h，冻干得酶促溶性胶原(Pepsin-soluble collagen, PSC)。

2.3.2. 胶原纤维海绵的构建

将一定质量胶原加入浓度为0.5 M的醋酸溶液中，在4℃下搅拌溶解24 h制备质量浓度10 mg/mL的胶原溶液。加入等体积的40 mM磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4)于冰浴中混合，调节pH 7.4。取3 mL加入12孔板中，立即置于28℃条件下自聚集过夜，用蒸馏水浸泡脱盐48 h。将水凝胶分别于−20℃、−40℃、−60℃、−80℃以及液氮条件下预冻48 h，然后冻干得海绵。为表述方便，所得胶原纤维海绵分别标记为CFS/−20、CFS/−40、CFS/−60、CFS/−80和CFS/LN。

2.3.3. 扫描电子显微镜(SEM)

将海绵在真空状态下喷金，用SEM观察海绵的微观结构，设置电子束的加速电压为10 KV。

2.3.4. 衰减全反射傅里叶变换红外光谱分析(ATR-FTIR)

用ATR-FTIR对海绵进行红外光谱扫描，波长为4000~500 cm⁻¹，扫描64次，分辨率为2 cm⁻¹。

2.3.5. X射线衍射图谱(XRD)

采用XRD检测海绵结构，扫描速度为10 ˚/min，扫描角度为5~40˚ (2θ)，X射线源为Cu Ka，电压为40 KV。

2.3.6. 海绵的孔隙率

参考Feng [13]的方法测定罗非鱼皮胶原纤维海绵的孔隙率。首先称量海绵样品的质量，将无水乙醇装满于15 mL的玻璃容器称重，其次将海绵放入玻璃容器中浸泡，超声5 min以去除海绵孔隙中的空气，随后称量再次倒满无水乙醇的玻璃容器质量。将海绵取出后，称量玻璃容器和剩余无水乙醇的质量。按照公式(1)计算海绵孔隙率：

$\text{Porosity = }\frac{{\text{W}}_{\text{2}}-{\text{W}}_{\text{3}}-{\text{W}}_{\text{0}}}{{\text{W}}_{\text{1}}-{\text{W}}_{\text{3}}}\times 100\%$ (1)

式中：W0为海绵的质量；W1为装满无水乙醇的玻璃容器质量；W2为海绵脱气后装满无水乙醇的玻璃容器质量；W3为取出海绵后剩余无水乙醇和玻璃容器的质量。

2.3.7. 海绵的吸水率和保水率

参考Xiang [12]的方法测定罗非鱼皮胶原纤维海绵的吸水率和保水率。首先称量海绵样品的质量，取40 mM的PBS溶液(pH 7.4)，预热至37℃。然后将海绵放入其中，在37℃下恒温孵育24 h，用镊子将海绵取出悬停1 min，沥干表面水分后称重。将滤纸铺垫于离心管底部，然后将海绵放入其中，500 r/min离心5 min后称重。按照公式(2)和(3)计算海绵吸水率和保水率：

$\text{Water absorption ratio}=\frac{{\text{W}}_{\text{1}}-{\text{W}}_{\text{0}}}{{\text{W}}_{\text{0}}}\times \text{100\%}$ (2)

$\text{Water retention ratio}=\frac{{\text{W}}_{\text{2}}-{\text{W}}_{\text{0}}}{{\text{W}}_{\text{0}}}\times \text{100\%}$ (3)

式中：W0为海绵的质量；W1为恒温孵育后海绵的质量；W2为离心后海绵的质量。

2.3.8. 海绵的机械性能

参照Xiao [14]的方法测定胶原纤维海绵的机械性能。采用电子万能试验机测定胶原纤维海绵的压缩强度。测试速度为5 mm/s，最大应变量为80%。

2.3.9. 海绵的抗酶解性能

参考Fernandes [15]的方法测定胶原纤维海绵的抗酶解性能。将I型胶原酶(≥125 U/mg)溶于50 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4, 0.36 mM CaCl2)中。精确称取一定质量的冻干圆片状胶原纤维海绵，将其浸没于酶液中，使酶与海绵的比值为2 U/mg。于37℃条件下静置，每隔一段时间取出，然后置于冰浴中终止酶解反应。将海绵用蒸馏水冲洗三次后冻干、称量质量，则海绵的降解率按照公式(4)进行计算：

$\text{Enzymatic degradation ratio}=\frac{{\text{W}}_{\text{0}}-\text{W1}}{{\text{W}}_{\text{0}}}\times \text{100\%}$ (4)

式中：W0为酶降解前海绵的初始质量；W1为降解后海绵在预定时间的质量。

2.3.10. 数据分析

每组实验设3个平行实验，采用Excel 2021进行数据统计分析，Origin 2018作图。

3. 结果与讨论

3.1. 预冻温度对胶原纤维海绵微观结构的影响

罗非鱼皮胶原纤维海绵是由胶原经过自组装形成的，如图1所示，经不同预冻温度处理后，其微观结构均为由胶原纤维形成的三维网络结构，与鲫鱼皮胶原蛋[16]和牛皮胶原蛋白[17]自聚集形成的结构类似。然而，可以明显发现网络结构中胶原纤维致密度的不同，随着预冻温度的降低，胶原纤维的密度逐渐降低。这是因为若预冻温度较高，凝胶经预冻后存在明显的体积缩小的现象。海绵的胶原纤维致密度的变化，将对其机械性能、孔隙率、溶胀性等产生重要的影响[18]。已有研究表明，胶原纤维的组装成束及纤维结构的构象可能会受到单个胶原纤维之间的静电相互作用影响[19]。CFS/−20、CFS/−40、CFS/−60、CFS/−80和CFS/LN的纤维平均直径为318.86 ± 111.62、341.59 ± 106.49、372.01 ± 111.53、408.25 ± 135.43和442.29 ± 160.14 nm，随着预冻温度降低，纤维直径逐渐变粗。该研究结果与PC交联导致鱼皮胶原纤维变细的报道不同[12]。胶原纤维海绵的三维网络结构使其具有良好的生物降解性、生物相容性及低免疫原性等生物学特性[10]。

Figure 1. SEM images and distributions of diameters of collagen fibrillar sponge

图1. 胶原纤维海绵的SEM图和纤维直径分布图

3.2. 预冻温度对胶原纤维海绵ATR-FTIR的影响

如图2所示，经不同预冻温度处理后，胶原纤维海绵ATR-FTIR图主要包括酰胺A、B、I、II和III五个特征吸收带。酰胺A带主要由N-H键的伸缩振动引起，其波数范围为3400~3450 cm⁻¹，但当N-H基团参与氢键形成时，酰胺A带会向低波数移动，通常在3300 cm⁻¹左右[20]。酰胺B带位于2930 cm⁻¹左右，由CH2基团的不对称伸缩振动产生。酰胺I带一般在1625~1690 cm⁻¹范围内，主要与C = O的伸缩振动有关。酰胺II带通常在1530~1600 cm⁻¹范围内，由N-H平面弯曲和C-N伸缩振动耦合形成。酰胺Ⅲ带的吸收峰位于1240 cm⁻¹附近，是由C-N伸缩振动以及C-N-H面内键合引起的[21]。CFS/−20、CFS/−40、CFS/−60、CFS/−80和CFS/LN的酰胺A带分别位于3307 cm⁻¹、3311 cm⁻¹、3315 cm⁻¹、3317 cm⁻¹和3311 cm⁻¹，表明N-H键参与氢键的形成。酰胺III带与胶原的三螺旋结构紧密相关，当酰胺III带与1454 cm⁻¹的透射峰比值(IR)为1.0时，表明胶原蛋白的三螺旋结构保存完整[22]。不同预冻温度下，胶原纤维海绵的IR值均大于1，因此可以认为预冻温度不影响胶原蛋白三螺旋结构。

Figure 2. Effect of pre-freezing temperature on ATR-FTIR of collagen fibrillar sponge

图2. 预冻温度对胶原纤维海绵ATR-FTIR的影响

3.3. 预冻温度对胶原纤维海绵XRD的影响

如图3所示，经不同预冻温度处理后的胶原纤维海绵均出现两个峰。第一个峰为尖锐的衍射峰，位于6˚~8˚附近，是由纤维海绵的结晶区产生的[23]。第二个为宽且大的衍射峰位于20˚~25˚之间，与海绵内无定形区域产生的漫散射有关。胶原分子一般自组装形成微纤丝，然后通过分子间交联形成胶原纤维，从而形成特有的分层交织结构[24]。从CFS/−20到CFS/−80，随预冻温度的降低，第一个峰表现出更尖锐、强度更高的衍射峰。表明温度降低，海绵的结晶区增大，三螺旋含量增加[22]。原因可能是温度降低导致胶原纤维海绵氢键作用减弱。而CFS/LN出现较平坦的衍射峰，强度降低，可能是由于存在较强的氢键作用。这与ATR-FTIR的结果一致。根据布拉格方程，从CFS/−20到CFS/−80，布拉格衍射角θ向右移动，表明海绵的无定形区减少且更加有序[25]。

Figure 3. Effect of pre-freezing temperature on XRD of collagen fibrillar sponge

图3. 预冻温度对胶原纤维海绵XRD的影响

3.4. 预冻温度对胶原纤维海绵孔隙率的影响

孔隙率是医用生物材料的重要参数，是检测材料是否满足细胞生长要求的初步指标[26]。高孔隙率的结构能够促进细胞的附着和增殖，在营养物质的运输和代谢物质的排出中起着重要作用，然而高孔隙率往往对材料的机械性能表现负面影响[27]。如图4所示，CFS/−20的孔隙率为83.07% ± 3.81%，随着预冻温度的降低，海绵的孔隙率逐渐增大，可能与胶原纤维海绵的致密度减小有关。CFS/−60、CFS/−80和CFS/LN的孔隙率无显著性差异，分别为95.16% ± 2.55%、96.37% ± 2.67%、97.17% ± 1.93%，与鲨鱼胶原支架的孔隙率相似[28]。用鱼鳞胶原蛋白制成的海绵具有90%以上的孔隙率，可用于皮肤浅表伤口的止血治疗[29]，由此推测−60℃、−80℃和液氮预冻的海绵更有利于在止血材料领域的应用。

Figure 4. Effect of pre-freezing temperature on porosity of collagen fibrillar sponge

图4. 预冻温度对胶原纤维海绵孔隙率的影响

3.5. 预冻温度对胶原纤维海绵吸水率和保水率的影响

吸水和保水性是生物材料的重要特征之一。高吸水性不仅有利于细胞的粘附和生长，而且有利于营养物质在细胞间的运输和代谢产物的排出[30]。预冻温度对胶原纤维海绵吸水率和保水率的影响如图5所示。CFS/−20、CFS/−40、CFS/−60、CFS/−80和CFS/LN的吸水率分别为1779.52% ± 107.29%、1867.74% ± 41.64%、1969.81% ± 80.63%、2003.73% ± 35.57%和2097.81% ± 171.51%，可以看出随着预冻温度的降低，海绵的吸水率呈现增长趋势，原因主要是海绵的孔隙率逐渐增大。并且海绵的吸水率明显高于鲨鱼胶原/羟基磷灰石支架[28]、鲨鱼胶原/壳聚糖支架[28]、鱼胶原/海藻酸盐/壳寡糖复合海绵支架[31]。然而，不同预冻温度下海绵的保水率没有显著差异，主要与预冻未影响网络结构中亲水性基团密切相关[32]。

Figure 5. Effect of pre-freezing temperature on water absorption ratio and water retention ratio of collagen fibrillar sponge

图5. 预冻温度对胶原纤维海绵吸水率和保水率的影响

3.6. 预冻温度对胶原纤维海绵机械性能的影响

Figure 6. Typical compression stress-strain curves of collagen fibrillar sponge

图6. 胶原纤维海绵的典型压缩应力-应变曲线

胶原基材料的机械性能对其在组织工程中的应用非常重要，特别是在填充空间和保持形状方面[33]。为了进一步探究预冻温度对胶原纤维海绵的机械性能的影响，本研究采用压缩试验进行表征，所得应力–应变曲线如图6所示。可以看出随着预冻温度的降低，海绵的最大压缩应力逐渐降低。CFS/−20和CFS/−40的最大压缩应力相近，分别为11.13 ± 0.64 KPa和11.08 ± 0.86 KPa，该结果与氧化硫酸软骨素/胶原纤维凝胶的压缩强度相似[33]。随着预冻温度的降低，海绵的最大压缩应力逐渐降低。当用液氮预冻时，海绵的最大压缩应力为4.28 ± 0.21 KPa，原因主要是液氮预冻较好的保持了纤维海绵的形状，未出现体积收缩现象，从而使得三维网络结构中纤维的致密度低于其他预冻温度。

3.7. 预冻温度对胶原纤维海绵抗酶解性能的影响

抗酶解性能对于生物材料的应用具有重要意义。如作为伤口敷料应用，海绵的适度降解不仅有利于保持伤口的持续修复效果，而且能够避免愈合过程中频繁换药造成的二次伤害[34]。此外，生物材料的降解还与细胞分化密切相关。研究表明，体外快速降解可以更有效地促进软骨分化，而慢速降解在维持软骨表型和体内软骨基质保留方面更具优势[35]。胶原纤维结构稳定，不易被中性蛋白酶、碱性蛋白酶等常见蛋白酶所降解，然而胶原酶可通过切割三螺旋结构域中775和776氨基酸残基形成的肽键从而降解胶原蛋白[36]。因此，本研究采用I型胶原酶对胶原纤维海绵的体外降解行为进行评价，结果如图7所示。可以看出样品的降解率均随时间的延长而增加。当降解时间达到8 h时，CFS/−20、CFS/−40、CFS/−60、CFS/−80和CFS/LN的降解率分别达到89.81% ± 0.87%、90.89% ± 0.71%、93.99% ± 0.74%、94.66% ± 0.13%和95.06% ± 0.76%，说明随着预冻温度的降低，海绵的酶降解率逐渐增加。研究表明海绵的降解速率取决于凝胶的交联程度、孔隙率以及降解介质中酶的浓度[36]。本研究中，CFS/−20表现出较好的抗酶解性能，主要与纤维网络结构致密度较大有关，这种空间位阻阻碍了胶原酶达到胶原纤维的酶切位点[30]。

Figure 7. Effect of pre-freezing temperature on enzymatic degradation ratio of collagen fibrillar sponge

图7. 预冻温度对胶原纤维海绵酶降解率的影响

4. 结论

预冻温度对罗非鱼皮胶原纤维海绵的结构和性能具有显著影响。在较高的预冻温度下，胶原纤维海绵存在明显的体积缩小的现象，从而导致纤维网络结构致密度的增大，进而导致海绵性能的变化。−20℃和−40℃的预冻温度有利于纤维海绵机械性能和抗酶解性能的增强，但是对孔隙率和吸水性表现负面影响。−80℃和液氮预冻处理使海绵的孔隙率和吸水性达到最大值，但是却使机械性能和抗酶解性能低于其他条件。综合分析上述性能，液氮预冻处理的海绵表面更加平整光滑，形貌更加均匀，且表现较高的孔隙率和吸水性，更有利于细胞迁移和营养物质的扩散，其较低的机械性能和抗酶解性能可通过交联等方法改进。该研究为胶原纤维海绵材料的开发和应用提供基础和参考。

基金项目

山东省自然科学基金面上项目：绿原酸和原花青素交联罗非鱼皮胶原纤维水凝胶的构建及生物学性能，项目编号：ZR2021MD050。

NOTES

^*通讯作者。