1. 引言
Thaumatin蛋白源自西非植物Thaumatococcus daniellii，具有甜味，因此也称为甜蛋白[1]。与Thaumatin蛋白同源的TLPs因此被命名为thaumatin-like proteins (TLPs)，即类甜蛋白，但与Thaumatin不同，TLPs本身不具甜味。这些蛋白通常分子量在20至26 kDa之间，并且被广泛描述为致病相关蛋白(PRs)。植物中的TLPs不仅调节植物对疾病的防御反应，还在应对非生物胁迫和发育过程中发挥重要作用[2] [3]。TLPs是一个庞大且高度复杂的基因家族，在真菌、植物和动物中参与宿主防御和多样的发育过程。
大量的转基因过表达、体外抗真菌活性测试以及相关蛋白活性分析提供了越来越多的证据，支持TLPs在宿主防御和其他生理过程中的作用。例如，一种名为PR-NP24的TLP在番茄外果皮中表达具有特异性，在受NaCl处理诱导时其积累增加，从而增强植物对入侵真菌病原体的抗性[4]。真菌来源的效应蛋白Pt_21通过直接靶向小麦TaTLP1蛋白并抑制其抗真菌活性，从而对宿主防御系统产生了抑制作用[5]。早期的研究主要阐明了TLPs在植物抗病中的作用，但近年来的研究越来越多地发现，TLPs在植物抗非生物胁迫和发育过程中也具有功能性作用。举例来说，CsTLP是一种源自茶叶的膜定位thumatin样蛋白。在拟南芥中，CsTLP的过表达已被证明能够提高植物在干旱胁迫条件下的存活率和产量[6]。在一项针对水稻中TLP (RTLP1)的研究中发现，RTLP1的启动子区域包含(转录因子WRKY蛋白结合位点)中的W-box元件，这些元件是RTLP1对非生物胁迫做出反应所必需的。此外，RTLP1还可被水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、机械伤害或稻瘟病真菌的诱导子所诱导[7]。在拟南芥中过度表达西兰花(Brassica oleracea L. var. Italica)中的bolTLP1，可以增强拟南芥对高盐和干旱条件的耐受性。转录组数据分析显示，bolTLP1可能通过调节植物激素(ABA、乙烯和生长素)介导的信号通路、水解酶和氧化还原酶活性、硫化合物合成以及组蛋白变体的差异表达来发挥作用[8]。
尽管对TLP蛋白功能的研究日益增多，但其作用机制仍知之甚少。为了进一步探究和解析特青籼稻中OsTLP12的功能和作用机制，本研究成功克隆了OsTLP12TQ的起始密码子上游1985 bp的启动子区域，并对其顺式作用元件进行了分析。同时，构建了启动子与GUS标记基因的融合表达载体，将融合载体转化进入水稻中，为研究OsTLP12TQ的表达模式奠定了基础。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 试验材料
籼稻品种特青(Oryza sativa subsp. Indica cv. TQ)，含有GUS标记基因的表达载体DX2181-eGFP (由湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室提供)，大肠杆菌菌株：DH5α (购自北京擎科生物科技有限公司)。EHA105农杆菌感受态细胞(武汉伯远生物科技有限公司)。
2.1.2. 试剂与药品
高保真酶TransStartFastPfu DNA Polymerase、质粒提取试剂盒Plasmid MiniPrep Kit购自北京全式金生物技术股份有限公司。限制性内切酶FastDigest购自赛默飞世尔科技(中国)公司。同源重组酶(SoSoo Cloning Kit)、DNA凝胶回收试剂盒购自北京擎科生物科技有限公司。引物合成由北京擎科生物科技有限公司完成，测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。
2.2. 试验方法
2.2.1. OsTLP12TQ启动子克隆
为克隆OsTLP12TQ基因的启动子片段，在NCBI数据库中根据日本晴(以下简称为NPB)中Os12g0630100起始密码子上游2000 bp序列分别设计正向克隆引物pTLP12-GUS-F和反向克隆引物pTLP12-GUS-R，在引物前端加上含有BamHⅠ酶切位点的DX2181-eGFP载体的同源臂序列，引物序列：pTLP12-GUS-F，tggctgcaggtcgacggatccCCGGTCTGACCGGCCAC；pTLP12-GUS-R，ggactgaccacccggggatccTGTTGCTTGCTTTCTTCTAATCTTTG (小写字母为同源臂序列)。以籼稻品种TQ基因组DNA为模板，使用TransStartFastPfu DNA聚合酶配制PCR扩增体系(20 μl)：5 × TransStart FastPfu Buffer 4 μl，dNTPs (2.5 Mm/L)1.6 μl，DNA Polymerase 0.4 μl，pTLP12-GUS-F和pTLP12-GUS-R (10 μmol/L)各0.5 μl，模板DNA 2 μl，无菌去离子水补充至20 μl。PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸60s，31个循环，72℃终延伸5 min。反应结束后使用1%琼脂糖凝胶电泳(120 V, 20 min)。选择大小为2000 bp的单一片段使用DNA凝胶回收试剂盒纯化。
2.2.2. pTLP12::GUS融合载体的构建
将DX2181-eGFP质粒进行单酶切，选用BamHI作为酶切位点，并配置酶切反应体系(总体积10 μl)：DX2181-eGFP质粒DNA 5 μl，10 × CutSmart缓冲液1 μl，BamHⅠ内切酶1 μl，无菌去离子水补至10 μl，37℃反应3小时。反应结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳(120V，20分钟)，使用DNA凝胶回收试剂盒纯化线性载体。接着使用同源重组酶连接线性质粒和目的片段，连接反应体系为：线性化载体DX2181-eGFP 3 μl，启动子片段7 μl，50℃反应20分钟。将连接产物转化至大肠杆菌感受态DH5α，使用含有Kanamycin的LB培养基过夜培养。挑取阳性单克隆菌落，进行PCR鉴定(参考步骤2.2.1)，摇菌，提取质粒。进行酶切验证，并将样品送至生工生物公司进行测序验证。验证结果为正确的重组质粒命名为pTLP12::GUS。
2.2.3. OsTLP12TQ启动子顺式作用元件分析
对测序后的OsTLP12TQ启动子序列与NCBI数据库中的OsTLP12NPB序列比对，并利用PlantCARE数据库分析其顺式作用元件。
2.2.4. pTLP12::GUS融合载体的遗传转化
通过电转法将pTLP12::GUS质粒转入到EHA105农杆菌感受态细胞中，将转化液置于含卡那霉素的培养基中培养(50 mg/L)，利用PCR反应来检测质粒转入情况。挑取阳性农杆菌于侵染液中，制备重悬液，挑取诱导的愈伤于农杆菌重悬液，侵染10~15 min。筛选单克隆愈伤组织，将阳性愈伤接种至分化培养基。待分化出2~5cm的芽后接种至生根培养基，30℃光照培养7~10天。
2.2.5. GUS染色
收获T0代种子，种植于含潮霉素(50 mg/L)的1/2MS培养基上，取培养至一心期幼苗置于GUS染液(50 Mm pH7.0的磷酸钾缓冲液、10 mM Na2-EDTA、0.1% Triton X-100、1mg/mlX-Gluc、100 μg/ml氯霉素、1 mM的铁氰化钾、1mM的亚铁氰化钾及20%的甲醇)中，37℃避光过夜。用95%乙醇脱色，然后拍照记录。
3. 结果与分析
3.1. OsTLP12TQ启动子克隆
根据日本晴基因组序列设计扩增OsTLP12TQ启动子的特异性引物，以籼稻特青基因组DNA为模板进行PCR反应，最终获得一条长为2000 bp的片段(图1)。
M. DL5000 DNA Marker；1. OsTLP12TQ启动子片段。
Figure 1. The electrophoresis results of the OsTLP12TQ promoter amplification
图1. OsTLP12TQ启动子扩增电泳结果
3.2. pTLP12::GUS融合载体的构建
将扩增到的启动子片段胶回收纯化，连接到BamHⅠ酶切的线性载体DX2181-eGFP中，转化大肠杆菌。为验证目的片段是否成功连接到表达载体上，选用BamHⅠ酶切重组质粒，酶切产物中出现条带大小为2000 bp的目的片段(图2)，这个结果充分说明OsTLP12TQ成功连接至DX2181载体上。然后将重组质粒送至生工生物公司测序验证，成功获得了OsTLP12TQ启动子驱动GUS标记基因表达的重组质粒pTLP12::GUS (图3)。
M. DL5000 DNA Marker；1. pTLP12::GUS重组质粒；2. 酶切后生成的片段。
Figure 2. Validation results of pTLP12::GUS recombinant plasmid enzyme digestion
图2. pTLP12::GUS重组质粒酶切验证结果
Figure 3. Map of the pTLP12::GUS expression vector
图3. pTLP12::GUS表达载体图谱
3.3. OsTLP12启动子顺式作用元件分析
利用PlantCARE数据库分析OsTLP12TQ启动子上的顺式作用元件，结果如表1所示，OsTLP12TQ启动子区域除启动子和增强子区域中常见的顺式作用元件(CAAT-box)外，还具有多个生物和非生物逆境反应相关顺式元件，包括WRKY转录结合位点(W-box)、响应脱落酸反应的ABRE元件、响应茉莉酸反应的CGTCA/TGACG motifs、响应干旱反应的MBS元件和参与厌氧诱导的ARE元件(图4)。这说明了OsTLP12可能在响应逆境胁迫方面具有重要功能。将OsTLP12TQ启动子序列测序结果与NPB中的OsTLP12基因启动子进行序列比对，结果显示二者相似，两者之间的序列存在一个片段的缺失和3个单核苷酸的替换，并未造成顺势作用元件的变化(图5)。这说明籼稻TQ与粳稻NPB中OsTLP12的启动子在结构上相对保守。
Table 1. The cis-acting elements in the promoter region of OsTLP12TQ
表1. OsTLP12TQ启动子区域的顺势作用元件
顺式元件 |
基序(5’-3’) |
位置 |
数量 |
功能 |
ABRE |
ACGTG |
874+、1735+、1638+ |
3 |
参与脱落酸反应 |
ARE |
AAACCA |
273+ |
1 |
参与厌氧诱导 |
AT-rich element |
ATAGAAATCAA |
1479− |
1 |
DNA结合蛋白(ATBP-1)的结合位点 |
CAAT-box |
CCAATT |
1036+、1375+、1661−、1698+ |
4 |
启动子和增强子区域 |
CAAAT |
318−、965+…… |
9 |
CGTCA-motif |
CGTCA |
321−、324+、783+、389− |
4 |
参与茉莉酸甲酯反应 |
G-box |
TACGTG |
1734+、1673+、873+ |
3 |
参与光反应 |
CACGAC |
1087− |
1 |
TAACACGTAG |
94− |
1 |
HD-Zip 1 |
CAAT (A/T) ATTG |
1153− |
1 |
参与叶肉栅栏组织分化的元件 |
GT1-motif |
GGTTAA |
1518−、803+ |
2 |
光响应元件 |
GGTTAAT |
668+ |
1 |
MBS |
CAACTG |
1459+ |
1 |
与干旱诱导有关的MYB结合位点 |
O2-site |
GATGATGTGG |
257− |
1 |
参与玉米醇溶蛋白代谢调节 |
GATGA(C/T)(A/G)TG(A/G) |
1623+ |
1 |
GTTGACGTGA |
321− |
1 |
RY-element |
CATGCATG |
661+、1430− |
2 |
参与种子特异性调节 |
TATA-box |
TATATA |
1899+、181+、1901−、1945−、279+、507+ |
6 |
转录开始的−30 bp左右的核心启动子元件 |
ATATAA |
181+、508+、438+、751+、437+、656− |
6 |
ATATAT |
903+…… |
9 |
TACAAAA |
954+、955+、957+、1141+ |
4 |
TATA |
1142−、1167−…… |
19 |
TATACA |
1559−、182+ |
2 |
TATAA |
1276− |
1 |
TCTATAAATAGG |
1899+ |
1 |
W-box |
TTGACC |
204−、562+ |
2 |
WRKY蛋白结合位点 |
注：AREB，参与脱落酸反应的元件；W-box，WRKY蛋白结合位点；ARE，参与厌氧诱导的元件；G-box，参与光反应的元件；MBS，与干旱诱导有关的MYB结合位点；CGTCA-motif，参与茉莉酸甲酯反应的元件。
Figure 4. The cis-acting elements in the promoter region of OsTLP12TQ
图4. OsTLP12TQ启动子区域的部分顺式作用元件
Figure 5. Alignment results of the promoter sequences of the OsTLP12 Gene between TQ and NPB
图5. TQ与NPB中OsTLP12基因的启动子序列比对结果
3.4. pTLP12::GUS表达载体的遗传转化
通过电转法将重组质粒转入农杆菌细胞中，利用PCR来检测转入情况，结果如图6所示，阳性对照及样品的电泳条带清晰、大小正确，且阴性对照均无条带，挑选阳性农杆菌进行扩大培养，制备重悬液，侵染籼稻特青野生型愈伤组织中。在含50 mg/L潮霉素1/2 MS固体培养基上筛选单克隆愈伤组织，将阳性愈伤接种至分化培养基(图6)。待分化出芽后接种至生根培养基，30℃光照培养7~10天，获得pTLP12::GUS表达载体T0代转基因植株。
A. 农杆菌菌落PCR。M. DL5000 DNA Marker；条带1~5为阳性克隆；B. 阳性愈伤组织分化。
Figure 6. pTLP12::GUS recombinant plasmid Agrobacterium-mediated transformation of rice
图6. pTLP12::GUS重组质粒农杆菌转化水稻
3.5. 转基因植株GUS染色
转pTLP12::GUS的T0代种子种植于含50 mg/L潮霉素1/2 MS固体培养基上，成功发芽的种子浸入GUS染色液中。结果如图7所示，OsTLP12基因启动子GUS表达载体的转基因植株中，根和胚芽鞘被染成深蓝色，表明GUS基因在根和胚芽鞘中有较强的表达。而嫩芽上有少量表达。
Figure 7. Transgenic plant GUS staining phenotyp
图7. 转基因植株GUS染色表型
4. 讨论
构建启动子-GUS表达载体是研究基因启动子功能和调控机制的重要工具，有助于深入理解基因的调控网络和生物学功能。通过将目标基因启动子与GUS基因结合，可以在植物细胞中表达GUS报告基因，从而研究基因启动子的活性和调控机制[9]。利用GUS染色或荧光素酶报告基因分析转基因植物中GUS活性的分布情况，评估基因启动子在不同组织或发育阶段的特异性表达，通过转化植物材料并诱导不同的胁迫条件，可以评估基因启动子在应激条件下的表达模式，从而研究启动子在抗逆反应中的作用[10] [11] [12]。各种环境胁迫诱导thaumatin-like proteins (TLPs)表达，使TLPs在植物体内积累。在蔷薇(Rosa chinensis)中鉴定了27个RcTLPs，所有RcTLPs的启动子中都发现了包括与生长、发育和激素反应以及非生物和生物反应相关的调控元件 (Cis-regulatory elements, CEs)，表明它们在玫瑰中发挥着不同的作用。转录组学分析发现，一些根特异表达的RcTLPs对干旱和盐分胁迫有反应，并且敲除RcTLP 6导致玫瑰对盐胁迫的耐受性降低[13]。启动子顺式作用元件是基因调控中的重要组成部分，参与控制各种生物过程(包括非生物应激反应，激素反应和发育过程)的基因活动的动态网络的转录调控，在转录调控中起着关键的作用[14]。WRKY超家族，其中的WRKY蛋白通常结合到W-box上，并参与调控植物的防御反应[15] [16]。ABRE (ABA responsive element)元件是植物中响应脱落酸(ABA)信号的重要顺式作用元件，调控着植物渗透胁迫和低温胁迫[14]。ARE (Antioxidant Response Element)元件是一种与植物响应氧化逆境相关的顺式作用元件，在植物抗氧化应激和逆境响应中的重要作用[17]。
5. 结论
本研究成功克隆了水稻中类甜蛋白OsTLP12基因的启动子并构建了相应的GUS表达载体，通过酶切验证和序列分析，确保了构建的表达载体的准确性和稳定性，这为进一步的转基因植物研究奠定了基础。对OsTLP12基因启动子的结构和功能进行了初步分析，发现其中具有多个生物和非生物逆境反应相关顺式元件。并为进一步研究该基因在水稻生长发育过程中的调控机制提供了基础。通过序列比对和分析，确认了所克隆启动子的一致性和完整性。这为后续的功能研究提供了可靠的实验材料。GUS染色结果显示，本研究成功构建了OsTLP12基因启动子GUS表达载体及转基因材料，在转基因材料中，根及胚芽鞘有较强的表达，说明OsTLP12可能在水稻种子发芽时具有重要作用，但对其在水稻生长发育中的具体调控机制仍需进一步深入的研究。总的来说，本研究为进一步探究水稻中类甜蛋白OsTLP12基因的功能和调控机制提供了重要的实验基础，也为水稻品种改良和生产提供了潜在的应用价值。
基金项目
本研究获得了国家自然科学基金的资助(32172088)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。