脑红蛋白抗氧化应激机制和临床应用

Antioxidant Stress Mechanisms and Clinical Application of Cerebroglobin

摘要: 脑红蛋白又称神经球蛋白(Neuroglobin, NGB)，是一种新型的携氧蛋白，主要存在于大脑的神经元中，在大脑缺血和氧化应激(Oxidative Stress, OS)造成的神经元死亡过程中起着重要作用，可通过改善线粒体的功能来减轻OS反应，此外，还具有直接清除活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)自由基及活性氮(Reactive Nitrogen Species, RNS)自由基、激活细胞生存信号、阻止神经细胞凋亡等作用，是一种内源性的抗OS损害的神经保护分子。本文在探索NGB抗OS的作用机制的基础上，对多种损害神经细胞的疾病在自我恢复过程中NGB的作用相关研究进行综述，以期为临床治疗此类疾病提供帮助。

Abstract: Cerebroglobin, also known as neuroglobin (NGB), is a novel oxygen-carrying protein that is mainly found in neurons of the brain and plays an important role in neuronal death caused by ischemia and oxidative stress. In addition, it is an endogenous neuroprotective molecule against OS damage, as it directly scavenges reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) radicals, activates cell survival signals and prevents neuronal apoptosis. Based on exploring the mechanism of NGB’s anti-OS action, this article reviews the relevant studies on the role of NGB in the self-recovery process of a variety of diseases that damage nerve cells, in order to provide help for the clinical treatment of such diseases.

1. 引言

脑红蛋白(Neuroglobin, NGB)是一种内源性神经保护分子，参与多种途径介导的保护作用。研究发现，在神经组织缺血缺氧时，NGB可通过对氧的摄取、运输，提高氧气的利用率，清除氧化应激(Oxidative Stress, OS)反应产生的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)自由基等抵抗缺血/缺氧对组织的损伤[1]。体外实验表明，增加NGB水平显著保护心脏和大脑免受缺氧/缺血和氧化应激相关的损伤，而降低NGB水平导致组织损伤的加剧[2]。然而，关于NGB抗OS的作用机制的研究资料较少，现已报道的机制尚不完善；在临床应用中，虽然已经很清楚NGB过度表达对神经组织具有保护作用，但它产生的确切机制仍尚不完全明确，在治疗中是否能发挥类似的保护功能仍有待研究[3] [4]。本文就近年来相关研究，就明确NGB的抗OS作用机制及其在神经细胞损伤的各种疾病中的研究进行综述，以期对临床相关疾病的诊治提供更多可能与思考。

2. NGB与OS损害的关系

OS损害在神经元损伤中起着重要作用，神经组织缺血/缺氧导致线粒体代谢障碍、坏死组织被炎症细胞吞噬降解激活补体加强免疫应答、细胞膜通透性增强所导致的钙离子内流会促进磷脂酶降解脂质，均可产生大量的ROS [5]。ROS堆积造成组织OS损害，从而引起一系列代谢紊乱，例如：脂质、蛋白质、DNA在氧化作用下受损，以及组织细胞的水肿、变性、凋亡等[5]。而NGB在神经元中，扮演保护神经细胞的重要角色，为各种损伤神经细胞的疾病，在促进神经元自然修复方面提供广泛的内源性神经保护作用，NGB下调会降低神经元应对神经细胞兴奋增加以及随之而来的代谢紊乱和OS损害的能力[6]。

3. NGB在抗OS损害中的作用机制

3.1. NGB协助氧气扩散

在缺氧条件下，NGB和氧气有较高的亲和力，可与氧气可逆性结合并协助氧气通过血脑屏障，向低氧组织提供氧气，从而发挥保护神经细胞的作用[3]。Lin Shang [7]等研究发现NGB参与大脑中的缺氧应激反应，在缺氧时，充当调节氧气供应的代偿蛋白。一项关于胚胎鼠的研究中发现[7]：乏氧条件下的胚胎鼠中NGB较正常出生后自主呼吸的胚胎鼠含量较高，以及运动后乏氧条件下NGB阳性的神经元数量也较安静时增多。这可能是NGB参与保护神经元不受缺氧损害的证据。

3.2. NGB直接清除ROS和RON

在组织损害过程中，细胞中促氧化剂和抗氧化剂平衡失调，导致组织氧化，中性粒细胞浸润、蛋白酶分泌增加，活性氧自由基产生过多，组织遭受OS损害，同时机体也开始释放NGB进行抗氧化[8]。Amri [9]等研究发现，组织缺氧时，钙离子释放到细胞质可诱导ROS产生和细胞凋亡，NGB在低氧诱导因子-1 (Hypoxia Inducible Factor-1, HIF-1)、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)以及促红细胞生成素(Erythropoietin, EPO)作用下上调，并通过以下途径来阻止细胞凋亡，首先，NGB可直接清除ROS和抑制钙离子释放；其次，NGB可在缺氧和OS的条件下转化为5-配位亚铁脱氧-NGB，作为亚硝酸还原酶的功能使亚硝酸还原为NO，发挥抗硝化作用。在小鼠脑神经瘤细胞(Neuro-2a, N2A)中发现[4]，NGB沉默通过下调14-3-3γ，使神经元对缺血缺氧耐受性下降，使H₂O₂对神经元的OS损害增强，提示14-3-3γ参与神经瘤细胞中NGB沉默对抗异常细胞的作用。Li [10]等表示NGB具有直接的抗氧化作用，清除多种自由基，能显著降低过氧化氢(hydrogen peroxide, H₂O₂)诱导的ROS产生以及脂质过氧化程度，进而抑制H₂O₂引起的线粒体功能紊乱及相应的细胞凋亡。综上，NGB通过多种途径直接清除各种氧自由基，为缺血缺氧条件下，组织免受OS损害提供可靠的内源性保护。

3.3. 调节线粒体功能

越来越多的证据表明，线粒体受到损害，电子链传递发生变化，而ROS产生的主要途径就是细胞中被损伤的电子传递链，缺氧时，线粒体呼吸抑制的副作用即导致ROS的产生，而NGB可以保护线粒体的功能[8]。Thomas Brittain [11]阐明了在神经细胞中，NGB抗OS机制，包括NGB过度释放后激活ATP通道和蛋白激酶B (即Akt)维持ATP水平；NGB也可以调节人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)的线粒体中的钙水平，减少凋亡通路的激活。Qiu等[4]研究表明，缺氧时，线粒体产生OS损害，NGB可通过维持ATP水平、将细胞色素C还原为亚铁细胞色素C、清除ROS和RON以及抑制钙离子释放等方式，保护线粒体的功能，使线粒体损害降低，抑制细胞凋亡。

综上，线粒体作为人体内最重要的产能细胞器，在组织出现缺血缺氧时，维持其稳定对细胞的生存至关重要。而机体过表达NGB，可通过抑制OS反应，进一步抑制线粒体凋亡从而保护细胞。

3.4. 降低细胞色素C

众所周知，正常情况下，NGB与氧气结合，在乏氧条件下，NGB与血红素基团的六配位结构进行结合，这种结构允许缺氧时NGB与铁细胞色素之间的电子快速转移，可通过快速结合铁细胞色素C，维持其非凋亡水平，发挥潜在的神经保护作用[4]。Amri [9]等研究发现NGB可以直接阻止细胞色素C的释放，还可以与细胞色素C-1和细胞色素C结合，减少氧气的释放和ROS的生成，同时，亚铁NGB能与细胞质中的铁细胞色素C反应生成亚铁细胞色素C，破坏细胞色素C向胞质释放激活固有的凋亡途径，以阻止细胞凋亡，进而抗OS损害。

3.5. 抗谷氨酸兴奋性毒性

研究表明，机体内的谷氨酸升高时会诱导Ca²⁺超载导致神经兴奋性毒性、OS损害及相关炎症反应，参与神经系统疾病的病理过程[12]。Cai等[13]研究发现：过表达的NGB在海马神经元细胞系(HT22细胞系)通过抑制或调控单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)发挥抗谷氨酸损伤的作用，AMPK作为细胞能量感受器和调控器，在ATP缺乏时激活，促进ATP生成，同时抑制代谢，减少消耗，促使细胞内恢复能量平衡，这可能与NGB减轻OS、细胞凋亡的途径有关。

3.6. 保护星形胶质细胞

星形胶质细胞(Astrocytes, AS)是中枢神经系统最丰富的神经胶质细胞，对于维持中枢神经系统的正常结构及功能具有重要作用，在神经细胞受损时，转变为反应性AS增生、活跃并迁移到病变区域与中性粒细胞等炎症细胞浸润导致的高ROS水平，在活跃的AS中发现了NGB表达增加[2]。Amri等[9]在研究中也表明，NGB抑制H₂O₂诱导的OS和细胞凋亡，促进AKT磷酸化，同时NGB抑制caspase-3活性，对AS起保护作用。这一研究证实，NGB可通过降低反应性星型胶质细胞浸润进一步减少ROS水平，保护神经细胞。

4. NGB抗OS损伤的临床应用

4.1. 神经退行性疾病(Neurodegenerative Diseases)

在神经退行性疾病，例如帕金森病、阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease, AD)的病理中发现除了神经元损伤外，AS也受到了影响[14]。针对神经细胞的损害过程，Varma等[15]研究表明，神经退行性疾病是由于细胞毒性因子，例如：高水平的ROS、NO、白细胞介素和肿瘤坏死因子-α (Tumor Necrosis Factor, TNF-α)的产生和积累影响神经元线粒体的能量代谢，最终导致神经元的退行性改变，进一步研究发现在AD中，NGB通过控制OS对线粒体具有保护作用，其中血小板衍生生长因子(Platelet Derived Growth Factor, PDGF-BB)在神经元和AS中通过上调脑NGB来保护线粒体，以及不同程度降低鱼藤酮所致的损伤作用[14]。Fiocchetti [16]等进一步的研究，揭示NGB细胞内定位是一种线粒体穿梭蛋白，影响线粒体的运输，在视网膜和大脑等不同器官中运输和储存氧气，在低氧时具有信号传导、作为还原型辅酶I (Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NADH)氧化酶、清除活性氧、调节钙水平和视神经损伤后神经再生等功能，协调ATP、ROS产生和影像细胞凋亡进而保护线粒体功能，同时也依赖线粒体的保护。目前临床药物主要是针对改善患者的运动症状，因此，NGB在线粒体动力学的调节作用可能在NGB和神经退行性疾病领域开辟新的治疗途径。

4.2. 脑血管疾病和脑外伤(Cerebrovascular Disease and Traumatic Brain Injury)

脑血管疾病中脑出血和脑缺血，目前是世界范围内死亡和长期残疾的主要原因，造成了极大的经济负担[17]。Fabio等[18]通过调查发现NGB在脑血管疾病中表达上调，可通过感知低氧，结合、运输、储存氧气，清除ROS和RON，激活细胞生存信号，进一步阻止细胞凋亡，保护神经细胞。以下，在脑出血和脑梗死相关研究中也证实了NGB上调可降低脑组织损伤。贺建勋等人[19]研究表明脑出血后，NGB上调，在3小时内达高峰，与出血量的多少成正比，在脑组织中可逆性的结合、运输氧，提高脑组织对氧的利用率，大大降低了脑组织的损伤程度。Cheng等[20]在急性缺血性脑卒(Acute Ischemic Stroke, AIS)的体内外实验研究中发现，缺血后NGB上调，72小时达高峰，通过保护神经元和组织不受低氧和缺血的损害，进而影响预后。除了急性期的保护作用，在病情进展过程中NGB也具有促进细胞生存的作用[21]。Pietro等[21]在一项关于转基因小鼠实验中发现NGB过表达时，在脑缺血后第2周可减少30%梗死面积。同时，在不同严重程度颅脑损伤研究中发现[20]：轻度损伤，虽然有OS增加和抗氧化剂的失衡，但NGB升高不明显；严重脑损伤会导致5~9倍NGB基因和蛋白表达增加，以及OS和抗氧化剂的严重耗竭。以上提示NGB的表达主要取决于损伤程度和时间，如果在脑缺血发生后尽早人为干预增加NGB的表达，可以尽可能挽救更多的可逆性损伤的神经细胞，促进神经功能的恢复。综上，脑血管疾病和脑外伤患者血清中NGB含量升高和病情的严重程度以及预后有关，因此血清NGB可能成为判断患者病情的可靠指标，以及判断预后的诊断依据，并在指导治疗上提供重要作用。

4.3. 脊髓损伤(Spinal Cord Injury, SCI)

SCI，尤其是在继发性SCI中OS损伤扮演着重要的角色，ROS的堆积会导致膜脂质过氧化反应、核酸和蛋白质损伤、氧化呼吸链酶系统抑制、神经纤维退变及脱髓鞘等，最终造成脊髓功能紊乱和损伤进一步加重[2]。

Liu [22]等人研究表明，OS损伤参与继发性SCI的发生和进展，AS对SCI 后神经细胞的恢复非常重要，反应性AS在SCI后形成，可减轻OS损伤，并通过分泌营养因子和适应缺血来保护神经元，同时AS瘢痕有利于脊髓损伤后轴突的再生，而对于AS最重要的是，SCI可促进AS表达NGB，并且NGB参与抗OS损伤，促进SCI的自然恢复过程，进一步阻止神经细胞凋亡[23]。此研究为星形胶质细胞与NGB抗OS损伤治疗SCI奠定了理论基础，同时也为治疗SCI提供一个新的靶点。杨帆[24]在一项氯化血红素诱导离体的SCI中实验中，发现SCI后NGB升高并有保护神经元作用，这可能为提供了一种更方便、经济的治疗SCI的方式。

4.4. 阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(Obstructive Sleep Apnea-Hypopnea Syndrome, OSAHS)

OSAHS因其反复造成脑组织缺氧，是脑梗死独立的危险因素。Nair等人[25]在一项动物实验中发现NGB的表达在OSAHS合并急性脑梗死患者中可减少梗死面积，并且NGB的神经保护作用可以减轻间歇性缺氧引起的睡眠时OS反应和神经认知及行为损伤。这一发现可能为严重的OSAHS继发的脑梗死患者认知行为损害的机制提供新的认识。

4.5. 新生儿脑病(Neonatal Encephalopathy)

在脑缺氧状态下，血清NGB水平代偿性增加，促进氧气向线粒体传递、清除OS产生的大量自由基，改善神经组织缺氧，对神经元具有保护作用[2]。Hu等人[26]研究证明新生儿胆红素脑病(Bilirubin Encephalopathy, BE)，是由于间接胆红素(Unconjugated Bilirubin, UCB)过度OS引起的神经元损伤，BE中NGB表达上调，能够增加抗UCB的神经毒性，减少神经细胞凋亡，起保护神经作用，并且血清NGB对BE有诊断效能。宋奕等人[27]也证实在新生儿缺血缺氧性脑病中，血清中NGB的表达与病情严重程度呈正比，NGB水平越高病情越重，NGB可以提示我们其疾病的严重程度及预后。因此，在新生儿脑病中NGB的表达上调不仅提示疾病的严重程度还可以判断预后。

4.6. 肿瘤(Tumor)

OS是高增殖癌组织的共同特征，在肿瘤细胞中，NGB仅在OS条件下释放，发挥抗氧化应激和促进细胞生存等作用[8]。Fiocchetti等[28]发现在乳腺癌中，ROS和ROS生成的化合物诱导乳腺癌细胞释放高水平的NGB生成，细胞内高水平NGB对抗OS损伤及促进细胞生存发挥关键作用，细胞外NGB在OS条件下可减少活性氧生成并提高细胞对化疗治疗的耐药性。同时Fiocchetti等人[29]还发现雌二醇(E2)在OS条件下诱导NGB上调，通过阻止E2依赖的癌细胞(乳腺癌、肝癌、结肠癌细胞珠)凋亡而增加细胞存活率，有力证明了NGB可能是肿瘤细胞建立的防御机制的一部分，可以帮助细胞抵抗肿瘤环境的应激条件。Wu等人[30]也发现NGB在肝癌细胞中通过偶联OS通路及致瘤Raf/MAPK/Erk信号途径通路，来控制肿瘤细胞的增殖。综上，NGB可能是作为药物治疗肿瘤的一个新的靶点。

4.7. 癫痫(Epilepsy)

在癫痫的发生中，OS和ROS起着关键作用，自由基产生的氧化损伤参与了癫痫的发生和发展。Gøtzsche [6]在最新一项动物试验中，对照NGB下调和正常NGB小鼠癫痫的易感性和严重程度，发现NGB下调的小鼠癫痫易感性及严重程度增加，但具体机制不明，考虑NGB可能构成了一种针对神经元高兴奋性和OS的内在防御机制。基于此研究，对于癫痫患者，如果可以发现上调或启动NGB表达的方式，可能为控制和治疗癫痫发作提供新方向。

5. 小结

综上所述，NGB与OS的关系非常紧密，在OS损害中，NGB可通过协助氧气扩散、直接清除ROS和RON、调节线粒体功能、降低细胞色素C、抗谷氨酸兴奋性毒性、保护星形胶质细胞等作用来保护神经细胞，抑制细胞的凋亡，然而具体的作用机制还需进一步的探索。NGB在神经退行性疾病、脑血管疾病和脑外伤、脊髓损伤、阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征、新生儿脑病、肿瘤、癫痫等疾病中均发现其上调，抗OS产生的神经细胞损伤，因此，未来对上述疾病的诊治研究，还需不断深入探索NGB与OS之间的作用机制，发现一方面能上调NGB的表达，另一方面能减轻OS损害的治疗方式，这对于神经损害疾病的自然恢复将具有重要意义。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。