1. 引言
《黄帝内经》中记载:“脂者,食之不化者也;膏者,食之不运者也。”《诸病源候论》亦言“膏粱之疾,则脂液留滞,留滞则湿盛,湿盛则生痰”。在中医理论体系中,学者们对脂质代谢异常的病机具有不同的认识,但基本都以“本虚标实”、“虚实夹杂”为核心[1]-[4],即肝失疏泄、脾失健运、肾气亏虚为本,痰浊瘀血为标。
益智仁属药食同源,具有温脾止泻摄涎,暖肾缩尿固精之功[5]。本团队在前期研究中发现[6] [7],益智仁乙醇提取物可有效延缓N2野生型秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, C. elegans)的衰老,并可改善C. elegans体内肠道脂类物质的沉积情况。随后,本团队以我国四大南药之一——益智仁为君药,研发出具有地域特色的专利方剂——缩泉益肾方[8] (Suoquan Yishen Prescription, SQYSP)。该方以益智仁、乌药、赤芍、苍术、丹参、天花粉、茯苓为组成成分,君臣佐使俱全,配伍严谨,具有温化肾气、温补肾阳、化瘀活血之功[8] [9] [10]。在动物实验中[8] [11],SQYSP可有效降低糖尿病肾病小鼠的血糖和甘油三脂含量。此外,多项研究表明[12]-[19],SQYSP中的乌药、赤芍、丹参、天花粉、茯苓等多数中药具有降脂、降糖、抗氧化等作用,可能在一定程度上协同益智仁调节脂质代谢。
目前,研究发现[20] [21] [22],C. elegans的基因与人类基因高度同源,线虫体内参与脂质合成和代谢的机制可与人体联系,能够作为功效成分降脂作用的评价模型。因此,本研究拟在前期研究的基础上,以N2野生型线虫为模式生物,深入探讨SQYSP对脂质代谢的影响及相关作用机制,为SQYSP的进一步研究提供数据支持。
2. 材料与方法
2.1. 实验动物
N2野生型线虫由昆明植物研究所罗怀容教授课题组。
2.2. 实验仪器
S219030537Motic显微镜(北京普瑞赛司仪器有限公司);LDZF-50L-II高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂);SCILOGEX离心机(美国塞洛捷克公司);PTX-FA210S电子天平(福州华志科学仪器有限公司);LHS-250HC-1恒温恒湿箱(海南光威科技有限公司)。
2.3. 药品与试剂
缩泉益肾方(海南海口龙昆南北京同仁堂店);大肠杆菌(Escherichia coli OP50, OP50)来源与1.1相同。琼脂粉(sigma-Aldrich公司);油红O染液(南京建成生物工程研究所);实时荧光定量PCR试剂盒(YEASEN公司)。
2.4. SQYSP 提取物的制备
缩泉益肾方处方为:盐益智仁10 g、乌药10 g、赤芍10 g、天花粉10 g、麸炒苍术10 g、丹参15 g、茯苓15 g。
2.4.1. 乙醇提取物
80 g SQYSP干品粉碎,过40目筛,在80℃用70%乙醇溶液加热回流提取两次,料液比1:30 g/mL,每次2 h,合并滤液,滤液浓缩并烘干,得到25.38 g乙醇提取物净膏,4℃冷藏保存[23]。
2.4.2. 水提取物
80 g SQYSP干品粉碎,过40目筛,在100℃用超纯水加热回流提取两次,料液比1:10 g/mL,每次2 h,合并滤液,滤液浓缩并烘干,得到18.30 g水提取物净膏,4℃冷藏保存[8]。
2.5. 固体培养基(Nematode Growth Medium, NGM)的制备
参考庄燕苹等[21]的方法进行制备。
2.6. 各组NGM的制备
SQYSP乙醇提取物按浓度分组:20 μg/mL (低剂量组,LD(CT))、50 μg/mL (中剂量组,MD (CT))和100 μg/mL (高剂量组,HD (CT))。SQYSP水提取物按浓度分组:20 μg/mL (低剂量组,LD (ST))、50 μg/mL (中剂量组,MD (ST))和100 μg/mL (高剂量组,HD (ST))。并设立空白对照组(BC)。参考庄燕苹等[21]的方法制备各组NGM。
2.7. C. elegans同期化处理
参考庄燕苹等[21]的方法。
2.8. 寿命实验
N2野生型线虫按不同提取方式和不同浓度分为MD (CT)、HD (CT)、LD (CT)、MD (ST)、HD (ST)和LD (ST),并设立BC组,一共7组,20只/板,3板/组。参考庄燕苹等[21]的方法测定各组线虫的平均寿命,以此分析SQYSP醇提物与水提物在不同浓度下对线虫平均寿命的影响。本研究发现:SQYSP醇提物与水提物在100 μg/mL均显示寿命显著延长,因此后续的实验均在高剂量浓度下进行。
2.9. 产卵实验
同期化的L4期N2线虫分为LD (CT)、LD (ST)和BC组,一共3组,1只/板,10板/组。参考Herndon LA等[22]的方法测定SQYSP不同提取物对N2线虫生殖能力的影响。
2.10. 运动实验
分组情况同1.9,30只/板,1板/组。参考张燕芬等[24]的方法进行运动能力实验。
2.11. 油红O实验
用M9溶液(制备方法参考庄燕苹等[21]的研究)将给药4天的线虫冲洗进1.5 mL Ep管中,清洗至少3次以去除OP50。然后加入固定液,于室温下固定15~20 min,清洗至少3次以洗去固定液。油红O库存液和超纯水按3:2的比例稀释,用过滤器过滤,配置成油红O染液。将油红O染液浸没线虫,室温下染色15 min后清洗至少3次以去除染液。最后制片,在显微镜下观察拍照。
2.12. 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)
分组同1.9,1000只/板,1板/组。参考Xiao M等[6]的方法进行实验。内参基因为cdc-42,目的基因引物序列如表1所示,相对定量公式为:2−ΔΔCT。
Table 1. qRT-PCR primer sequence of Caenorhabditis elegans
表1. 秀丽隐杆线虫qRT-PCR引物序列
基因 |
上游引物 |
下游引物 |
cdc-42 |
GCGGAGTGATCGTCAATAACA |
GACCCGGTAAGGGGTAAGGT |
skn-1 |
AGTGTCGGCGTTCCAGATTTC |
GTCGACGAATCTTGCGAATCA |
sbq-1 |
GGCGGCGAAGATTGTGATTC |
CGCTCGGTTTTTGGTCTTCG |
fasn-1 |
TCGGGTCGTGTCGGGTGAAG |
CCTGAGTTGTCCGTCGTCTTGTC |
fat-7 |
CAACAGCGCTGCTCACTATT |
CACCAACGGCTACAACTGTG |
2.13. 数据处理
所有实验均重复至少3次,数据采用SPSS 25.0软件进行统计分析,多组间比较采用单因素ANOVA检验方法。使用GraphPad Prism 8.0软件绘图,寿命实验采用Kaplan-Meier生存分析法处理。采用Image J图像软件分析油红O图片。实验结果以均数 ± 标准差
表示,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001均为差异有统计学意义。
3. 结果与分析
3.1. SQYSP不同提取物对线虫寿命的影响
SQYSP不同提取物在不同浓度下对N2线虫平均寿命的影响如图1和表2所示。BC组的平均寿命为13.689 d,而MD (CT)和HD (CT)组的平均寿命分别为15.297 d和16.662 d。与对照组相比,MD (CT)和HD (CT)组分别延长了11.75%和21.72% (P < 0.05, P < 0.001),差异有统计学意义。并且,由图1可见MD (CT)和HD (CT)组的生存曲线向右平移,在第9 d时现象较为明显;相反,LD (CT)组的平均寿命是14.763 d,没有显著延缓线虫的衰老(P > 0.05)。
在SQYSP水提物的研究中,LD (ST)和MD (ST)组相比BC组均没有显著延长线虫的寿命(P > 0.05),而HD (ST)组的平均寿命为15.693 d,显著延长了线虫的平均寿命(P < 0.01)。并且,根据图1可以发现,HD (ST)组在第11 d时生存曲线明显向右平移。实验结果表明,SQYSP乙醇提取物和水提取物均可以延长N2野生型线虫的寿命,但SQYSP乙醇提取物需在50 μg/mL和100 μg/mL浓度时可以延缓线虫衰老,而SQYSP水提取物仅在100 μg/mL浓度时可以延缓线虫衰老。
Table 2. Effects of different extracts of SQYSP on the average lifespan of N2 wild type Caenorhabditis elegans (
)
表2. SQYSP不同提取物在不同浓度下对N2线虫平均寿命的影响(
)
组别 |
平均寿命(d) |
BC |
13.689 ± 0.438 |
LD (CT) |
14.763 ± 0.490ns |
MD (CT) |
15.297 ± 0.429* |
HD (CT) |
16.662 ± 0.431*** |
LD (ST) |
14.573 ± 0.475ns |
MD (ST) |
14.516 ± 0.439ns |
HD (ST) |
15.693 ± 0.438** |
注:与BC组相比:“*”表示P < 0.05,差异具有统计学意义;“**”表示P < 0.01,存在显著性差异;“***”表示P < 0.001,存在极显著差异;“ns”表示P > 0.05,差异无统计学意义;表3和表4同。
(a) (b)
注:(a) SQYSP (CT)组;(b) SQYSP (ST)组。
Figure 1. Effects of different extracts of SQYSP on the lifespan of N2 wild type Caenorhabditis elegans
图1. SQYSP不同提取物在不同浓度下对N2线虫寿命的影响
3.2. SQYSP对线虫生殖能力的影响
研究药物毒理学研究常用的指标有生殖能力和运动能力[25] [26]。如表3所示,BC组的总产卵量为30.22只,与HD (CT)组相比无统计学差异(P > 0.05)。HD (ST)组的总产卵量为30.11只,与BC组相比总产卵量稍低,但两组亦无显著性差异(P > 0.05)。由此说明,100 μg/mL的SQYQP乙醇提取物和水提取物在延长N2野生型线虫寿命的同时对线虫的生殖能力没有毒副作用。
Table 3. Effects of different extracts of SQYSP on the reproductive capacity of Caenorhabditis elegans at 100 μg/mL (
)
表3. SQYSP不同提取物在100 μg/mL下对线虫生殖能力的影响(
)
组别 |
总产卵量(只) |
BC |
30.22 ± 49.067 |
HD (CT) |
30.97 ± 52.951ns |
HD (ST) |
30.11 ± 46.057ns |
3.3. SQYSP对线虫运动能力的影响
随着年龄的增加,机体的肌肉功能逐渐下降,进而出现肌肉萎缩、运动能力下降等情况征。身体弯曲频率和头部摆动频率是线虫运动能力实验最常用的检测指标,可通过观察这两项指标的变化来判断药物是否可以通过提高线虫的运动能力,从而达到能量消耗、脂肪堆积减少的目的[27] [28]。如表4所示,BC组身体弯曲频率为3.88次/20s,HD (CT)组的身体弯曲频率为4.72次/20s,HD (CT)组比BC组显著提高了21.65% (P < 0.01)。此外,HD (ST)组的身体弯曲频率为4.45次/20s,比BC组提高了14.69% (P < 0.05),两组差异有统计学意义。
BC组的头部摆动频率为4.85次/min,HD (CT)和HD (ST)组的头部摆动频率分别为5.32次/min和5.46次/min,两组与BC组相比分别增加了9.69%和12.58%,但均无统计学差异(P > 0.05)。实验结果表明,在100 μg/mL浓度时,SQYQP乙醇提取物和水提取物均可以提高线虫的身体弯曲频率,但对线虫的头部摆动频率没有影响,说明SQYQP乙醇提取物和水提取物可能是通过改善线虫的肌肉功能,从而提高线虫的运动能力,使得能量消耗增加、脂肪堆积减少。
Table 4. Effects of different extracts of SQYSP on the exercise capacity of Caenorhabditis elegans at 100 μg/mL (
)
表4. SQYSP不同提取物在100 μg/mL下对线虫运动能力的影响(
)
组别 |
身体弯曲频率(次/20 s) |
头部摆动频率(次/min) |
BC |
3.88 ± 2.449 |
4.85 ± 4.220 |
HD (CT) |
4.72 ± 3.426** |
5.32 ± 3.684ns |
HD (ST) |
4.45 ± 2.918* |
5.46 ± 3.966ns |
3.4. 油红O实验
正常情况下,C. elegans的虫体透明,但油红O染液可对线虫体内的脂肪滴进行特异性染色,从而使脂肪滴呈现红色。研究人员常应用这种方法观察药物对线虫体内脂肪含量的变化情况[29],本研究亦采用该方法观察SQYSP不同提取物对线虫体内脂肪含量的变化。由图2和图3所示,SQYSP乙醇提取物和水提物在延缓线虫衰老的同时均可以显著改善脂肪堆积的情况(P < 0.001)。
(a) (b) (c)
注:(a) BC组;(b) SQYSP(CT)组;(c) SQYSP(ST)组;与BC组相比:“*”表示P < 0.05,差异具有统计学意义;“**”表示P < 0.01,存在显著性差异;“***”表示P < 0.001,存在极显著差异;“ns”表示P > 0.05,差异无统计学意义;图3和图4同。
Figure 2. Oil red O staining of Caenorhabditis elegans in SQYSP groups
图2. SQYSP各组线虫油红O染色图
Figure 3. Effects of different extracts of SQYSP on intestinal lipid accumulation in Caenorhabditis elegans
图3. SQYSP不同提取物对线虫肠道脂质堆积情况的影响
3.5. qRT-PCR
如图4所示,在qRT-PCR实验中,HD (CT)组与BC组相比可以显著上调skn-1 (P < 0.001),下调sbq-1 (P < 0.001)、fasn-1 (P < 0.001)和fat-7 (P < 0.01)的表达量;HD (ST)组亦可以上调skn-1 (P < 0.01),下调sbq-1 (P < 0.001)、fasn-1 (P < 0.001)和fat-7 (P < 0.001)的表达量。实验结果说明,SQYSP乙醇提取物和水提物改善线虫脂质代谢可能与skn-1、sbq-1、fasn-1和fat-7的调控有关。
Figure 4. Effects of different extracts of SQYSP on the transcription level of lipid metabolism related genes in Caenorhabditis elegans
图4. SQYSP不同提取物对线虫脂质代谢相关基因转录水平的影响
4. 讨论
近年来,由于饮食习惯及生活方式的改变,肥胖患者逐年增加,伴随出现的典型特征之一即为脂质代谢异常,而脂质代谢异常恰是2型糖尿病、高脂血症、冠状动脉粥样硬化等慢性疾病的重要危险因素[30] [31]。因此,如何有效改善脂质代谢异常是研究人员亟需解决的重点、难点。
脂质代谢异常在中医典籍中未有记载,但按其临床症状及体征,可归属于中医“痰浊”“血瘀”“脂浊”等范畴[32]。多数学者认为[1]-[4],脂质代谢异常的病机以肝失疏泄、脾失健运、肾气亏虚为本,痰浊瘀血为标。而本研究中的缩泉益肾方君臣佐使俱全,配伍严谨,相辅相成,恰能针对脂质代谢异常的病机,治以温补脾肾,化痰活血。在动物实验中发现,缩泉益肾方能有效降低血糖和甘油三酯的含量。例如姚宇剑等[11]通过研究发现,给予缩泉益肾方(最佳灌胃剂量0.01 mg/Kg) 8周后,缩泉益肾方组小鼠的血糖从(30.03 ± 1.58) mmol/L降低到(23.21 ± 1.25) mmol/L,而生理盐水组小鼠的血糖从(29.92 ± 3.11) mmol/L升高到(32.28 ± 1.78) mmol/L;与生理盐水小鼠组甘油三酯水平(8.34 ± 1.33) mmol/L相比,该组小鼠甘油三酯的水平也显著下降,为(3.89 ± 1.13) mmol/L。
缩泉益肾方中的益智仁与乌药共为君药,前者温化肾气、温补肾阳,后者行气止痛、温肾散寒,两者一散一收,共同温下元、散寒邪,使得温补脾肾、固精缩尿之功更加显著。赤芍与丹参配伍使用,具有相须、相使之效,可凉血化瘀,通经活血。苍术为臣,与赤芍、丹参一起辅助益智仁、乌药行活血化瘀止痛、燥湿健脾之功。再佐以天花粉清热生津、消肿排脓,使病邪去之有路。最后以茯苓为使,利水渗湿、健脾、宁心安神,既有助于淡渗利湿行瘀,又有助于补益脾胃之气。
众所周知,脂肪主要储存在脂滴中,并以脂滴为单位。脂肪的生成与分解处在动态平衡中,需要众多基因、酶等调控[33] [34]。在秀丽隐杆线虫体内,参与脂质代谢的通路很多[28] [29],本研究选择与脂肪合成相关的关键基因——skn-1、fasn-1、sbp-1和fat-7进行研究。
skn-1在哺乳动物体内的同源物是转录因子E2相关因子2 (Nrf-2),是机体应答氧化应激的重要组成成分,主要参与生物体氧化应激过程[35]。但已有研究证实[36] [37] [38],skn-1还参与线粒体解毒、蛋白质稳态、新陈代谢等过程。Renalison FP等[37]通过紫铆花素对秀丽隐杆线虫脂质代谢的研究证实:skn-1/Nrf途径参与线虫的脂肪生成和脂肪酸β-氧化的过程,该通路可下调线虫体内sbp-1、fasn-1和ech-1.1的表达量,从而抑制脂肪生成、干预脂肪酸β-氧化的过程。
在脂肪合成中,脂肪酸合酶(Fatty acid synthase, FAS)是合成饱和脂肪酰辅酶A (脂肪酸)的关键酶,而FAS在线虫体内的同源基因是fasn-1。乙酰辅酶A被乙酰辅酶A羧化酶羧化成丙二酰辅酶A,随后被FAS生成不同长度的脂肪酸,其中的棕榈酸可转化成甘油三酯(Triglyceride, TG),还可以通过脂肪酸延伸酶和/ 或脂肪酸去饱和酶的修饰,形成多种不饱和脂肪酸。此外,多项研究证实[38] [39],fasn-1的下调可改善线虫体内脂质物质的积累。
fat-7是哺乳动物体内调控硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCDs)的同源基因。在秀丽隐杆线虫体内,fat-7可使硬脂酸去饱和,向油酸(游离脂肪酸)转化。此外,fat-7还可与fat-5和fat-6共同维持着饱和脂肪酸/单不饱和脂肪酸的比例平衡。肖嵋方[29]、凌思凯[39]、吉鑫[40]等人的研究均证实:部分降脂类物质可通过调控fat-7起到降低脂肪沉积的作用,可见fat-7通路对脂质代谢的调节具有一定意义。
sbp-1在哺乳动物体内的同源物是固醇元件结合蛋白(SREBPs),可通过调控SCDs和其它脂肪合成基因,从而起到调节脂肪酸合成和脂质平衡的关键作用。在秀丽隐杆线虫体内,sbp-1可直接或间接诱导下游的fasn-1、fat-7、pod-2等基因来促进脂质合成[34] [38]。宁丽娜[38]等人研究发现:重组荞麦胰蛋白酶抑制剂可通过调控sbp-1来影响pod-2和fasn-1的表达量,进而出现脂肪酸合成减少的情况。
由此我们可以发现,skn-1、fasn-1、sbp-1和fat-7之间的关系如图5所示。skn-1可通过调控sbp-1
Figure 5. The relationship between skn-1, fasn-1, sbp-1 and fat-7
图5. skn-1、fasn-1、sbp-1和fat-7之间的关系
来直接或间接地影响fasn-1和fat-7的表达,进而影响线虫体内脂质堆积的情况。基于此,本研究探究缩泉益肾方乙醇提取物和水提物对秀丽隐杆线虫的降脂作用,及作用机制是否与skn-1、fasn-1、sbp-1和fat-7的调控有关。研究发现,缩泉益肾方乙醇提取物和水提物均可以延缓秀丽隐杆线虫的衰老,并能有效改善线虫体内的脂质堆积情况,其作用机制可能与脂肪合成相关基因skn-1、fasn-1、sbp-1和fat-7的调节有关。
基金项目
海南医学院大学生创新创业项目(X202211810012)。
NOTES
*共同第一作者。
#通讯作者。