1. 前言
中华绒螯蟹俗称河蟹，是我国重要的甲壳类养殖品种。近几年由于人工养殖技术壁垒的突破，该养殖产业得到了很大的发展，如今河蟹的养殖范围覆盖了国内大部分省市[1]。但病害问题对河蟹养殖业的可持续发展造成了严重制约，其中“牛奶病”已经成为天津[2]、河北[2]、浙江[3]以及辽宁[4]等地区威胁河蟹养殖的主要病害之一，严重影响了河蟹产业的健康发展。
患“牛奶病”病蟹的典型特征为头胸甲腔内充满大量牛奶状乳白色液体，且附肢无力，活动力极差，濒临死亡，主要发生在扣蟹到成蟹养殖阶段，可以造成成蟹减产50%以上，种蟹越冬死亡70%以上[5]。2018年在辽宁盘锦地区某河蟹养殖场发现了部分头胸甲蓄积大量牛奶状液体的病蟹，2019年该地区再次出现大量同样症状的患病河蟹，且死亡率和病发率也较前年有所升高，预估总体发病率超30% [4]。2020年天津地区引自辽宁盘锦地区的暂养期间扣蟹暴发大规模“牛奶病”，死亡率在50%以上[6]，且2021年“牛奶病”再次在天津地区出现[7]。目前呈全国蔓延趋势，给养殖户造成巨大的养殖压力和经济损失。2020年马红丽等人首次从辽宁地区的患病河蟹中分离出致病原，病原菌经18SrRNA序列分析及部分生理生化特性鉴定为二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidate) [4]。2021年Bao等人通过注射感染试验证实了二尖梅奇酵母对河蟹的致病性，且最终通过26SrRNA基因序列分析确认二尖梅奇酵母即为辽宁地区河蟹“牛奶病”的致病原[8]。同年徐晓丽等人分别采用浸浴、注射、饲喂3种方式确定了天津地区河蟹“牛奶病”的致病原也为二尖梅奇酵母，排除了其它病原的混合感染的可能性[6]。至此可以确定，近几年导致河蟹“牛奶病”暴发的致病原为二尖梅奇酵母。
目前，针对河蟹二尖梅奇酵母尚无有效的治疗药物，只能从苗种、环境、饲料等方面进行综合防控，以降低患病的概率。又因该病病程较长，往往当人们发现有明显症状的患病河蟹时就已经到了中晚期，损失已无法挽回。但针对该病原的检测技术也鲜有报道，且没有相应的国家和地方标准可以参考，这使得该病的早期检测和诊断变得十分困难。因此，本文采用人工注射感染健康河蟹的方法，分时间段采集感染河蟹各类组织，通过HE染色观察分析心脏、肠、鳃、肌肉和肝胰腺的组织病理时序变化特征，明确不同感染时期各组织的病理特征，为河蟹“牛奶病”的早期诊断提供科学的理论依据，同时为进一步了解该病的致病机制提供理论支撑。
2. 材料和方法
2.1. 实验河蟹的选择
健康的河蟹采集自天津市宁河区某稻蟹混养基地，体重为15 ± 1.2 g。随机挑选3~5只河蟹进行细菌16SrDNA [9]和真菌18SrDNA的分子生物学检测[10]，然后分别挑取鳃丝、肝胰腺、附肢肌肉以及心脏组织参照SN/T 2503-2010《淡水鱼中寄生虫检疫技术规范》[11]进行寄生虫检测，确认无病原体之后通过肉眼观察，挑选体色青、活力好、附肢健全的个体开展后续实验。
2.2. 二尖梅奇酵母的人工感染实验
将挑选的健康河蟹充气暂养7天，期间每天投喂饵料2次，换水1次，养殖水温为19℃ ± 1℃。暂养结束后，将实验蟹随机分成2组(对照组和实验组)，每组设置3个平行，每个平行10只实验蟹。将二尖梅奇酵母纯培养液进行镜下染色计数后，用pH7.4的1 × PBS缓冲液进行液稀释，配制成终浓度为3.6 × 105 CFU/mL的二尖梅奇酵母菌悬液，分别向实验组中实验蟹的第三步足基部关节膜处注射50 μL菌悬液，向对照组中实验蟹的第三步足基部关节膜处注射等体积的1 × PBS缓冲液。菌悬液注射剂量和注射浓度均参照刘群[7]。
2.3. 样品的采集及石蜡切片的制备
将对照组和实验组注射后24小时内死亡的河蟹全部淘汰，不作为样品采集对象。在注射后第48小时(感染前期)、第7天(感染中期)以及第14天(感染后期)，分别从对照组和实验组的3个平行中各挑选1~2只河蟹，解剖每只蟹的鳃丝、肝胰腺、心脏、肠道和肌肉组织，浸泡于大于组织10倍体积的Davidson’s AFA固定液中固定24小时后，置于70%乙醇(体积分数)溶液中再浸泡36小时后委托南京钟鼎生物技术有限公司进行病理石蜡切片的制作。
2.4. 切片的观察分析
将制作好的切片置于荧光显微镜(奥林帕斯) 100倍、200倍及400倍镜下观察，经过分析挑选出典型病理特征的画面拍照，形成河蟹感染二尖梅奇酵母后前期、中期和后期的各组织病理对比图。
3. 结果
3.1. 人工感染河蟹的临床症状
人工感染试验中实验蟹的临床表现如图1A所示，对照组河蟹肝胰腺呈现橙黄色，鳃丝纹理清晰，呈淡黄色，心脏结构紧实，呈透明状；感染前期(图1B)肝胰腺呈暗棕色，组织结构萎缩，鳃丝纹理较清晰，仍呈淡黄色，心脏易剥离，呈苍白色；感染中期(图1C)肝胰腺进一步萎缩，鳃丝呈现苍白色，轻触后有乳白色液体渗出，心脏易剥离，呈苍黄色；感染后期(图1D)肝胰腺呈苍黄色，鳃丝及心脏组织结构模糊，轻触后有大量乳白色液体流出，头胸甲中贮存着大量牛奶状乳白色液体。
A is the control group of crabs, B is the pre infection stage of crabs, C is the mid infection stage of crabs, D is the late infection stage of crabs; The blank arrow indicates the heart of the crab, the red arrow indicates the milky white liquid filled in the head and chest armor during the later stage of infection.
其中A为对照组河蟹，B为感染前期河蟹，C为感染中期河蟹，D为感染后期河蟹；空白箭头指示河蟹心脏，红色箭头指示感染后期头胸甲充满的牛奶状乳白色液体
Figure 1. The clinical symptoms and characteristics of artificially infected crabs with Metschnikowia bicuspidate
图1. 人工感染二尖梅奇酵母的河蟹临床症状表现特征
3.2. 肝胰腺组织病理观察
A: the hepatopancreas tissue structure of the control group, B: the pathological images of the hepatopancreas in the early stage of infection, C: the pathological images of the hepatopancreas in the middle stage of infection, D: the pathological images of the hepatopancreas in the late stage of infection; Blank arrows indicate the structure of hepatic tubules.
其中A为对照组肝胰腺组织结构，B为感染初期肝胰腺病理图片，C为感染中期肝胰腺病理图片，D为感染后期肝胰腺病理图片；空白箭头指示肝小管结构
Figure 2. Pathological changes in hepatopancreas of Chinese mitten crab artificially infected with Metschnikowia bicuspidate
图2. 人工感染二尖梅奇酵母的河蟹肝胰腺病理组织变化特征
如图2A显示，对照组肝胰腺组织的结构清晰，肝小管排列紧密，且管腔间隙内无散落红细胞及细胞碎片的存在，肝小管上皮细胞排列整齐，且细胞核多位于底部，有完整的上皮及结缔组织结构，均呈椭圆。如图2B所示感染前期的肝胰腺组织结构界限依然清晰，部分肝小管结构破坏，管腔间隙聚缩，上皮细胞排列些许杂乱。如图2C所示感染中期的肝胰腺组织结构模糊，大部分肝小管结构破坏，上皮细胞排列松散，细胞间隙增大，细胞核聚集现象更加明显。如图2D所示感染后期的肝胰腺组织已无组织形态，肝小管结构完全破坏，肝小管上皮细胞瓦解，整个肝小管坏死、糜烂，大量坏死组织堆积于管腔。
3.3. 鳃组织病理观察
如图3A所示，对照组鳃组织鳃丝排列规则、紧密，鳃丝间距适中，组织结构清晰，细胞核大小及分布均一。如图3B所示，感染初期的鳃丝萎缩，鳃丝末端出现肿胀变性且鳃丝有轻微的弯折，细胞排列较杂乱，细胞核出现聚集现象。如图3C所示，感染中期的鳃丝出现明显粘连，鳃丝结构模糊呈糜烂状，细胞结构模糊且出现少量空泡现象。如图3D所示，感染后期的鳃丝粘连更加严重，已无明显鳃丝结构，鳃细胞崩解坏死，空泡现象明显。
A: the gill tissue structure of the control group, B: the pathological images of the gill in the early stage of infection, C: the pathological images of the gill in the middle stage of infection, D: the pathological images of the gill in the late stage of infection; the blank arrow indicates gill filament adhesion, the red arrow indicates vacuoles between gill tissues.
其中A为对照组鳃组织结构，B为感染初期鳃组织病理图片，C为感染中期鳃组织病理图片，D为感染后期鳃组织病理图片；空白箭头指示鳃丝黏连现象，红色箭头指示鳃组织间的空泡
Figure 3. Pathological changes in gill of Chinese mitten crab artificially infected with Metschnikowia bicuspidate
图3. 人工感染二尖梅奇酵母的河蟹鳃病理组织变化特征
3.4. 心脏组织病理观察
如图4A所示，对照组心脏组织结构紧密，纹理清晰，且横纹心肌纤维排列整齐。图4B所示，感染初期心脏结构较完整，纹理较杂乱，有少量心肌纤维出现断裂、弯曲，组织边缘出现少量细胞核聚集现象。图4C所示，感染中期的心脏组织，在初期的基础上，纹理更加杂乱，且心肌纤维断裂更加严重，排列杂乱无章，边缘细胞核聚集现象更加明显，出现少量空泡现象。图4D所示，感染后期的心脏组织，大部分心肌纤维断裂，组织边缘出现大量细胞核堆积，心肌纤维坏死严重，组织结构内出现大面积空泡现象。
A: the heart tissue structure of the control group, B: the pathological images of the heart in the early stage of infection, C: the pathological images of the heart in the middle stage of infection, D: the pathological images of the heart in the late stage of infection; the blank arrow indicates transverse myocardial fiber rupture, the yellow arrow indicates nuclear aggregation at the edge of the tissue.
其中A为对照组心脏组织结构，B为感染初期心脏组织病理图片，C为感染中期心脏组织病理图片，D为感染后期心脏组织病理图片；空白箭头指示横纹心肌纤维断裂现象，黄色箭头指示组织边缘出现的细胞核聚集现象
Figure 4. Pathological changes in heart of Chinese mitten crab artificially infected with Metschnikowia bicuspidate
图4. 人工感染二尖梅奇酵母的河蟹心脏病理组织变化特征
3.5. 肌肉组织病理观察
如图5A所示，对照组肌肉组织其肌纤维排列紧密整齐，纹理清晰。图5B所示，感染初期的肌肉组织肌纤维间的间隙增大，排列稍有松散，少部分肌纤维出现断裂现象。图5C所示，感染中期的肌肉组织，部分肌纤维聚集成团，大部分肌纤维断裂，排列杂乱。图5D所示，感染后期的肌肉组织，肌纤维的间隙进一步扩大，几乎无完整的肌肉纤维，肌纤维完全断裂，排列更加杂乱，肌肉的纹理结构消失。
A: the muscle tissue structure of the control group, B: the pathological images of the muscle in the early stage of infection, C: the pathological images of the muscle in the middle stage of infection, D: the pathological images of the muscle in the late stage of infection; The blank arrow indicates the gap between muscle fibers, the yellow arrow indicates the phenomenon of muscle fiber breakage and disorderly arrangement.
其中A为对照组肌肉组织结构，B为感染初期肌肉组织病理图片，C为感染中期肌肉组织病理图片，D为感染后期肌肉组织病理图片；空白箭头指示肌纤维间的间隙，黄色箭头指示肌纤维断裂及排列杂乱的现象
Figure 5. Pathological changes in muscle of Chinese mitten crab artificially infected with Metschnikowia bicuspidate
图5. 人工感染二尖梅奇酵母的河蟹肌肉病理组织变化特征
3.6. 肠道组织病理观察
A: the intestine tissue structure of the control group, B: the pathological images of the intestine in the early stage of infection, C: the pathological images of the intestine in the middle stage of infection, D: the pathological images of the intestine in the late stage of infection; The blank arrow indicates the irregular arrangement of the small intestinal epithelial cell layer and the phenomenon of a large number of cell disintegration, the yellow arrow indicates the phenomenon of intestinal atrophy.
其中A为对照组肠道组织结构，B为感染初期肠道组织病理图片，C为感染中期肠道组织病理图片，D为感染后期肠道组织病理图片；空白箭头指示小肠上皮细胞层排列不规则及大量细胞崩解的现象，黄色箭头指示肠腔萎缩现象
Figure 6. Pathological changes in intestine of Chinese mitten crab artificially infected with Metschnikowia bicuspidate
图6. 人工感染二尖梅奇酵母的河蟹肠道病理组织变化特征
如图6A所示，对照组的肠道组织，肠粘膜向肠腔突起形成褶皱，小肠上皮细胞排列整齐有序，各组织层次分明，界限清晰。图6B所示，感染初期的肠道组织上皮细胞层级及其下方各组织层次基本清晰，少部分肠膜有脱离的趋势，肠腔略有萎缩。图6C所示，感染中期小肠上皮细胞层排列不规则，大量细胞崩解、聚集，部分肠膜脱离，肠腔进一步萎缩。图6D所示，感染后期已无明显上皮细胞结构，各组织层界限模糊，大量细胞核聚集，肠腔萎缩严重。
4. 讨论
本研究发现，二尖梅奇酵母能够在河蟹体内大量繁殖，给鳃、肝胰腺、心脏、肌肉和肠道组织造成了不同程度的破坏，尤其对肝胰腺、鳃和肌肉组织的破坏程度最为严重，肠道和心脏组织相较之下，病变程度较低。马红丽[4]对病蟹的肌、鳃、肝胰腺等组织进行了病理分析，认为患“牛奶病”的河蟹病变最严重的部位为肌组织。申洪彬[12]对病蟹肝胰腺、鳃、心脏、肌组织进行了组织病理、透射电镜及扫描电镜的观察，认为肝胰腺、鳃、心脏是病原侵染的主要靶器官。刘群[7]通过对病蟹的免疫组织化学分析认为肝胰腺、后肠和鳃组织是二尖梅奇酵母侵染河蟹时的重要繁殖场所。上述结论与本次研究的结论有一些差异，作者认为这与河蟹的感染情况、菌株的毒力、河蟹的体质以及水质等感染条件有很大关系，这可能是造成上述研究结论有些许差异的原因。
感染二尖梅奇酵母的河蟹血淋巴会出现严重乳化现象[4]，至感染后期各种组织的结构大面积坏死，细胞破裂、溶解，猜测牛奶状乳白色液体可能为细胞液流出与酵母菌共同作用导致。肝胰腺作为消化系统的重要部分之一，被视为蟹体健康的重要标志[13]，本研究中肝胰腺组织逐步坏死，肝小管结构也在逐渐消失，细胞核缓慢固缩、溶解，出现了大量空泡，肝胰腺组织的病理变化说明感染该病原的河蟹其消化各类营养物质的效率在逐渐降低。同时，通过感染河蟹肠道病理发展过程我们知道，到感染后期病蟹肠道组织排列混乱，肠膜部分脱落，阻碍了营养的正常吸收。营养物质的消化和吸收功能均遭到了破坏，造成了河蟹肢体无力，停滞摄食，最终死亡。感染后期的鳃组织，鳃丝粘连严重，细胞结构几乎全部瓦解，而鳃作为河蟹的呼吸器官，鳃丝的粘连大大降低了呼吸效率，菌体的堆积堵塞了气体的正常进入，进而造成河蟹的呼吸困难，最终导致死亡。感染后期的肌肉组织，其肌肉纤维排列杂乱，断裂，有的聚集成团，横纹消失。河蟹的肌肉组织主要分布在河蟹步足和胸部，肌肉纤维的断裂使得肌肉无法正常收缩舒张，以至于河蟹无法正常运动。感染后期的心脏组织同样呈现出心肌纤维断裂严重，横纹消失，坏死组织堆积的情况相较于其他组织，心脏组织的病变程度小，但心肌纤维的断裂也影响到了心脏的正常收缩舒张，影响到了正常的血液循环，可能出现供血不足等情况。由此可见，二尖梅奇酵母能够感染河蟹各类组织，并同时影响呼吸、行动、营养消化和吸收等不同生命活动，最终致死。因此，二尖梅奇酵母感染河蟹导致的“牛奶病”的病程较长，一般在感染15~20天后才出现死亡或典型症状的河蟹，在早期很难被及时发现，只有发展到中晚期才能表现出明显的症状，导致该病很难做到提前控制和预防，给河蟹针对该病的防控造成一定的困难。组织病理学研究对病原的诊断及防治具有一定的指导作用[14]，因此本研究通过人工感染河蟹前期、中期和后期三个患病阶段各组织病理的时序变化研究，能够为河蟹“牛奶病”早期诊断提供理论依据。
5. 结论
本研究结果表明，人工感染二尖梅奇酵母的河蟹临床症状表现及组织病理进程均呈现时序变化特征，其中肝胰腺、鳃及肌肉组织病变程度最为严重，肠道和心脏组织病变程度相对较低，初步总结了该病原在不同感染时期对河蟹各组织的破坏特征，为河蟹“牛奶病”的早期诊断提供了理论依据。
NOTES
*通讯作者。