线纹海马的性别特异分子标记的开发及鉴定

Development and Identification of Sex-Specific Molecular Markers in Hippocampus erectus

摘要: 性别特异分子标记的筛选是分子辅助单性育种的重要技术手段。本研究基于雌雄各20尾线纹海马的2b-RAD测序数据，比较分析并筛选出一个雄性特异的tag scaffold63和一个性别二态的SNP位点QSNP63，并在大规模群体中进行了验证。PCR扩增显示在108尾海马中scaffold63 tag仅在雄海马中检测到，而在雌海马中未检测出目的片段；108只海马中QSNP63位点测序显示所有雌性个体中该位点为G/G纯合，所有雄性个体中该位点呈现G/T杂合状态。基因注释发现tag scaffold63位于cilia- and flagella-associated protein 69-like25号外显子后的内含子上，QSNP63位于leucine-rich repeats and IQ motif containing 1基因8号外显子上。综上，本研究筛选到的线纹海马性别特异分子标记及候选基因为进一步解析线纹海马的性别决定机制奠定了基础。

Abstract: Screening of sex-specific molecular markers is an important technique for breeding of mono-sex population. Based on the 2b-RAD sequencing data of 20 males and 20 females of Hippocampus erectus, we screened and verified a male-specific tag scaffold63 and a sex-dimorphic SNP site QSNP63 in a large-scale population. In 108 Hippocampus erectus, scaffold63 tag was only detected in males but not in females via PCR amplification. Sequencing of QSNP63 site showed nsSNPs with homozygous (G/G) in females and heterozygous (G/T) in males. Gene annotation revealed that scaffold63 tag located on the intron behind Exon 25 of cilia- and flagella-associated protein 69-like, QSNP63 located on Exon 8 of the leucine-rich repeats and IQ motif containing 1. In conclusion, the sex-specific molecular markers and candidate genes screened in this study offer novel insights into the sex- determination mechanisms of the Hippocampus erectus.

1. 引言

线纹海马(Hippocampus erectus)，属硬骨鱼纲刺鱼目海龙科的小型海洋底栖鱼，以小型甲壳类动物为食，具有雄性海马孕育后代的特征[1]。近年来由于海马较高的观赏价值和药用价值使其需求量大幅上升，优良品种的选育和人工高产养殖已成为海马养殖中急需解决的难题[2]。

线纹海马表现出显著的性别二态性，性成熟的雄海马在体长、体重、免疫力及所含活性物质方面均优于雌性海马[3] [4]，因此培育全雄群体对提高海马养殖效益具有十分重要的意义。

鱼类性别发育通常由遗传因子和环境因素相互作用调控，具有较高的可塑性[5]，其中，外源性激素影响鱼类性别决定的报道尤为普遍，自上世纪50年代Yamamoto [6] [7]等通过性激素处理在青鳉中获得了性反转的雌鱼或雄鱼，外源性激素处理技术便被广泛用于鱼类性别转换的研究。性别特异分子标记联合激素处理是培育单性群体的重要技术手段[8]，近年来我国学者应用此技术在有性别异形显著的鱼类中培育了一批优良单性品系，例如在通过黄颡鱼特异性别分子标记联合EE2性控技术得到XY伪雌鱼的基础上，培育的黄颡鱼“全雄1号”、“全雄2号”[9]；在17α-甲基睾酮处理联合翘嘴鳜的性别分子标记得到XX伪雄鱼的基础上，培育的全雌翘嘴鳜“鼎鳜1号”[10]，在17α-甲基睾酮处理联合散鳞镜鲤的性别分子标记得到XX伪雄鱼的基础上，培育的“全雌鲤”；在雌性化激素(E2、EE2和已烯雌酚)处理联合斑鳢、乌鳢性别分子标记得到伪雌斑鳢的基础上，培育得到的全雄乌斑杂交鳢“雄鳢1号”等[11]，然而，海马中尚未有此类性控技术的应用研究。线纹海马在性腺刚开始分化的敏感期，无法从外观判断其性别，雄性线纹海马出生45天后才开始逐步出现育儿袋，此时已完成了性腺的定向分化[12]，故筛选线纹海马的性别分子标记是培育全雄海马的基础。

2B-RAD技术是通过II B型限制性核酸内切酶片段化基因组DNA后进行的高通量测序技术，使用该技术具有较高的分型精确度，涵盖面广，可获得更多的标记数目[13]，目前利用该技术辅助性别鉴定已在若干水产动物中得到成功应用，如光棘球海胆(Mesocentrotus nudus) [14]、虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius) [15]、大刺鳅(Mastacembelus armatus) [16]、穴青蟹(Scylla paramamosain) [17]、乌苏拟鲿(Pseudobagrus ussuriensis) [18]、丝尾鳠(Mystus wyckioides) [19]等，但鲜有关于海马性别特异分子标记的报道。

本实验基于我们前期对雌雄各20尾海马进行2b-RAD测序的基础，筛选出了一个雄性特异的tag scaffold63和一个呈性别二态性的SNP QSNP63，并在108尾海马中对其特异性进行了大规模验证和注释分析，该研究为线纹海马的性控育种奠定了基础。

2. 材料与方法

2.1. 试验动物与取材

实验所用的108只海马选自三个不同地理区域的养殖场，分别为中国福建27雄和27雌(A组)、山东9雄9雌(B组)和海南18雄18雌(C组)，暂养水温为26℃，海水盐度为35‰，光照为3000，光照周期12个小时，以冰冻糠虾一天投喂两次，喂食后大约一个小时进行清理缸内残渣。

取样前用MS-222麻醉剂(100 mg/L)对所有待取样的海马进行了麻醉。取线纹海马背部肌肉组织，于液氮中进行速冻后放入−80℃冰箱中备用。

2.2. 基因组DNA制备

使用Wizard^®基因组DNA纯化试剂盒(Promega, Madison, USA)提取线纹海马基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000紫外分光光度计(Thermo Fisher Scientific)对抽提的DNA质量和浓度进行检测。DNA产物置于−20℃保存备用。

2.3. 性别特异分子标记的验证

我们将2b-RAD测序数据所筛选得到的unique标签与参考基因组相比较，从中筛选出了一个差异片段scaffold63 (表1)和一个具有性别二态性的SNP位点QSNP63 (表2)，为了验证所筛选出的性别特异标签的准确性，提取了该分子标记上下游2000 bp的序列，用primer3 4.0 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)进行了特异性引物设计，引物序列见表1和表2。

Table 1. Primers for candidate specific label validation

表1. 候选特异标签验证的引物

性别特异标签ID	序列	特异性	引物名称	引物序列	温度(℃)	是否有参
scaffold63 (653551-653577)	TGGGGGCGGAGTTTGCGTTGTTAGTGG	♂	S63 F	GCGGAGTTTGCGTTGTTAGT	62˚C	No
			S63 R	AAGTAACCCCCACACAATGC

Table 2. Sex-specific SNP information

表2. 性别特异SNP信息

参考基因组中的位置	SNP位置	雌性	雄性	引物(5'−3')
Scaffold63	152017	G/G	G/T	F:GAAAAGTGAGGAGCAAAGGA R:AACAGGACTTCAGTGGCATAC

PCR反应使用TaKaRa Taq™ (TaKaRa，日本东京)进行，总体积为20 μl，其中包含2 μl 10 × PCR缓冲液(不含Mg2+)、1.2 μl 25 mM MgCl2、1.6 μl dNTP混合液、0.1 μl TaKaRa Taq (5 U/μl)、1 μl正向和反向引物(10 mM)、1 μl (约50 ng/μl)模板DNA和13.6 μl无菌水。PCR扩增程序如下：94℃变性3分钟；34个循环：94℃ 30秒，62℃ 30秒，72℃ 30秒；72℃延伸5分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测并对相应条带进行测序。

2.4. 性别特异序列的注释

使用Tbtools软件提取特异性标记上下游2 kb的序列，通BLASTn和GenBank进行序列注释，用IBS Illustrator进行模式图绘制，用Expasy和DNAMAN8对氨基酸序列进行比对分析。

3. 结果与分析

3.1. 雄性特异scaffold63序列的验证

对来自三个不同地理区域的108只雌雄线纹海马的基因组DNA用scaffold63 tag的特异性引物进行片段扩增。结果显示三个地区的所有雄海马中均扩增到一条大小为211 bp的目的条带，而在雌海马中没有扩增到相应的目的条带。证实scaffold63 tag特异性存在于雄海马的基因组中，可作为鉴定线纹海马遗传性别的特异分子标记(如图1)。

Figure 1. Electropherogram for scaffold63 tag in 108 Hippocampus erectus

图1. scaffold63 tag在108只线纹海马中的扩增电泳图

3.2. QSNP63位点的性别二态性验证

通过表2中的特异性引物对QSNP63位点所在片段进行pcr扩增并送测序，结果显示，QSNP63位点在所有雄海马中的测序均呈现双峰，对应的碱基类型为G/T杂合型，而在所有雌性中QSNP63位点的测序均呈现单峰，对应的碱基类型为G/G纯合型(图2)，该结果证实QSNP63位点在线纹海马中呈现雌性纯合雄性杂合的二态性。

Figure 2. The sequencing peaks of QSNP63 in the male and female Hippocampus erectus

图2. QSNP63在雌雄线纹海马序列中的测序峰图

3.3. scaffold63 tag及QSNP63所在序列的注释

通过BLAST和GENEBANK对scaffold63 tag和QSNP63所在位置的上下游各2 kb的序列进行搜索比对，结果显示scaffold63 tag位于cilia- and flagella-associated protein 69-like的第25个外显子后的内含子上(图3)，不编码氨基酸；QSNP63位于leucine-rich repeats and IQ motif containing 1基因第8个外显子上(图4)，对其氨基酸进行比对发现其在雌海马中对应编码精氨酸(R)，而在雄海马中呈精氨酸(R)和亮氨酸(L)两种多态性。

注：scaffold63tag用红色框标出。外显子用绿色框表示。内含子用横线表示。外显子和内含子起始终止位置用bp表示。

Figure 3. Gene annotation map of scaffold63

图3. scaffold63的基因注释图

注：QSNP63位点用红线标出。外显子用蓝紫色框表示。内含子用横线表示。外显子和内含子起始终止位置用bp表示。

Figure 4. Gene annotation map of QSNP63

图4. QSNP63的基因注释图

4. 讨论

性别特异分子标记是培育单性群体的重要基础，尤其在经济性状上呈现性别二态性的品种中得到了广泛应用，如基于雌、雄生长异性及个体大小差异开发的单性养殖品种黄颡鱼“全雄1号”，全雌“北鲆2号”和全雄罗非鱼“鹭雄1号”等[20] [21]。2b-RAD测序技术在筛选性别特异分子标记方面展现出巨大潜力，具有分型准确率高、建库快捷简便和成本易控制等优点[13]。因此，本实验基于2b-RAD对雌雄线纹海马进行测序等基础上，对所筛选到的scaffold63 tag和QSNP63进行了验证和注释，开发出2个可鉴别线纹海马性别的分子标记，为后续培育经济效益优于雌海马的全雄海马群体奠定了基础。

Scaffold63 tag的注释显示其位于cilia- and flagella-associated protein 69-like的第25个外显子后的内含子上，其在精子鞭毛结构中扮演着重要角色[22]，尽管scaffold63 tag其对cilia- and flagella-associated protein 69-like的影响低于CDS区域和基因调控区域上的SNP位点，但亦可能通过影响其剪接改变序列，该猜测需进一步验证。

QSNP63位于leucine-rich repeats and IQ motif containing 1基因的第8个外显子上，该SNP为CDS区域的非同义编码SNP，在雌海马中其对应的氨基酸为精氨酸(R)，而在雄海马中该呈精氨酸(R)和亮氨酸(L)杂合态。研究表明在人类、小鼠和鸡中leucine-rich repeats and IQ motif containing 1对精子的发生及精子活力的维持具有重要的作用[23] [24] [25]，有趣的是我们在QSNP63下游约153 bp的位置还发现了另外一个雌海马纯合雄海马杂合的SNP位点[26]，SNP的多态是否从剂量上导致了leucine-rich repeats and IQ motif containing 1蛋白结构和功能上的变化以及leucine-rich repeats and IQ motif containing 1是否是线纹海马性别调控候选基因的问题仍需进一步研究。

5. 结论

基于对雌雄线纹海马的2b-RAD测序，我们对候选的两个性别特异分子标记Scaffold63 tag和QSNP63进行了大规模验证和注释，该研究为线纹海马的性别鉴定提供了一种简便的方法，为后续培育全雄海马群体奠定了基础。

基金项目

本研究受大学生创新创业训练计划“线纹海马性别特异分子标记的筛选及相关基因的表达分析”项目(202110061081)资助。

NOTES

^*通讯作者。