肿瘤微转移的相关研究及AE1/AE3在其中的价值

Related Research on Tumor Micrometastasis and the Value of AE1/AE3 in It

摘要: 在人口老龄化的全球大背景下，恶性肿瘤的发病率和致死率也逐年上升，在恶性肿瘤病灶局限、未发生转移时行医疗干预往往可以取得较好的疗效，因此早期发现恶性肿瘤或发现后进行精准有效的评估及干预显得尤为重要。免疫组化法(Immunohistochemistry, IHC)利用特异性的抗原抗体染色在鉴别肿瘤微转移中发挥着重要作用，有助于识别出常规病理切片HE染色未能识别的转移病灶；AE1/AE3主要表达于上皮细胞，常被用作诊断上皮性肿瘤转移的分子标记物，HE染色可见肿瘤转移的淋巴结经AE1/AE3标记均为阳性，HE染色阴性的淋巴结中也可见AE1/AE3的部分表达，且在常规病理检测为阴性的淋巴结中，AE1/AE3阳性患者往往比阴性患者具有更高的复发率和更低的5年生存率。因此常规病理联合检测AE1/AE3表达有助于评估患者肿瘤分期和判断预后，进而能对高危患者进行早期干预，提高患者生存期。本综述主要从恶性肿瘤淋巴结转移、常用的肿瘤转移检测方法以及分子标记物AE1/AE3在诊断淋巴结微转移中的作用等方面入手，为诊断恶性肿瘤淋巴结微转移可采用的方法和精准识别提供理论依据。

Abstract: Under the global background of aging population, the incidence and mortality of malignant tumors are increasing year by year. Medical intervention can often achieve good results when the focus of malignant tumors is limited and has not metastasized, so it is particularly important to find malignant tumors early or make accurate and effective evaluation after discovery. Immunohistochemistry (IHC) plays an important role in differentiating tumor micrometastasis by using specific antigen-antibody staining, which is helpful to identify metastatic lesions that can not be identified by HE staining in conventional pathological sections. AE1/AE3 is mainly expressed in epithelial cells, and is often used as a molecular marker to diagnose epithelial tumor metastasis. HE staining shows that all lymph nodes with tumor metastasis are positive by AE1/AE3 labeling, and some AE1/AE3 expression can also be seen in lymph nodes with negative HE staining. In lymph nodes with negative routine pathological examination, patients with AE1/AE3 positive often have higher recurrence rate and lower 5-year survival rate than patients with negative tumor. Therefore, the combined detection of AE1/AE3 expression by routine pathology is helpful to guide the diagnosis and prognosis of patients, and is beneficial to the early intervention of high-risk patients, thus improving the survival time of patients. This review mainly focuses on lymph node metastasis of malignant tumor, commonly used methods for detecting tumor metastasis and the role of molecular markers AE1/AE3 in the diagnosis of lymph node micrometastasis, so as to provide theoretical basis for the methods and accurate identification of lymph node micrometastasis of malignant tumor.

1. 引言

随着社会经济的不断发展，人均寿命明显增加，叠加人口老龄化、环境污染等多种因素，全球恶性肿瘤的发病率逐年上升。据报道2022年我国恶性肿瘤发病例数约为482.47万例，死亡病例数约为257.42万例，与2016年发布的数据(406.40万例新发病例和241.35万例死亡病例)相比，肿瘤新发病及死亡人数均呈持续上升趋势，由此造成更大的疾病经济负担[1]。恶性肿瘤根据分期主要的治疗方法为手术、化学药物治疗、放射治疗及免疫、靶向治疗[2]，与其他临床常见疾病的显著区别在于恶性肿瘤具有远处转移的特性[3]，这也是导致恶性肿瘤手术治疗效果差或术后复发的主要原因。

2. 淋巴结转移在恶性肿瘤中的意义

肿瘤转移的途径主要包括直接蔓延、血行转移和淋巴转移，在大多数恶性肿瘤转移中，淋巴转移是主要方式之一。杨静等人对食管癌患者进行跟踪调查后发现当存在淋巴结转移时，患者五年生存率明显降低，淋巴结转移是食管癌强有力的预后因素，当存在≥7个淋巴结转移或未发生淋巴结转移时，五年生存率分别为2%~17%或83% [4]；现已有研究证实，实体肿瘤产生淋巴管生长因子，这些因子除了促进新的淋巴管生成外，还促进肿瘤细胞粘附到淋巴管上，并向淋巴管内迁移[5]。淋巴结的转移与否在恶性肿瘤的治疗中占据重要地位，多项研究均证明常规病理切片检查中发现淋巴管内存在肿瘤细胞，与患者预后不良密切相关[6]。例如在一项针对胰腺癌的研究中发现，淋巴结转移是影响胰腺癌预后的独立危险因素，可能与肝转移时出现肝损伤或患者肿瘤负荷较重有关[7]。而临床中的常见现象为术前影像学或术后病理提示淋巴结转移阴性的患者，仍会出现肿瘤的转移与复发，张荷月等人的研究表明，即使术前影像学提示淋巴结转移为阴性，进行淋巴结清扫仍能使患者获益[8]；高彪的研究指出淋巴结清扫可以显著改善淋巴结转移阴性患者的预后，提高生存期[9]。这提示我们常规病理检测对临床的指导意义存在不足，可能存在未能检测到的微转移。精准判断淋巴结转移情况对选择合理有效的治疗方案以及评估预后有指导意义，因此，更需要寻找其他有助于鉴别肿瘤是否转移的方式来明确肿瘤淋巴结转移情况。

3. 检测肿瘤转移的常用方法及其优缺点

诊断恶性肿瘤转移的金标准为病理学检测，目前检测肿瘤淋巴结转移与否的主要方式有聚合酶链式反应(PCR)、免疫组织化学(IHC)、DNA倍体分析、连续切片法及新兴的液体活检等[10]。其中连续切片需要耗费大量的人工及精力，且由于肿瘤的转移包括宏转移和微转移，两者主要的区别在于转移病灶的大小，其中宏转移是指淋巴结内存在一个以上大于2 mm的肿瘤病灶，宏转移的淋巴结多为阳性淋巴结；除外转移灶的大小，癌细胞在淋巴结内的分布和数量也是区分宏转移和微转移的重要因素，微转移是指肿瘤细胞以单个细胞或微小细胞团的形式，通过淋巴系统转移至淋巴结，从而形成的常规病理学方法及影像学不易检测到的转移，常无特异的临床表现，很难在术前或术后被发现，但微转移的病灶常会引起远期复发。微转移时在淋巴结中发现的癌细胞很少，通常是通过显微镜才能看到，直径小于2毫米，微转移灶并无血管供给。在传统的连续切片法中，前哨淋巴结(SLN)的冰冻和石蜡切片苏木精伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色存在一定的漏诊率，约13%~18%乳腺癌存在常规病理学检查方法无法检测到的微转移病灶[11]。病理学中连续切片法的最佳检测间距仍然存在争议，叠加微转移病灶的临床特性，连续切片法已不能满足临床所需。聚合酶链式反应(PCR)是一种扩大特定DNA片段的分子生物学技术，最大的特点是能将微量的DNA大幅扩增，在检测肿瘤转移的过程中，PCR技术具有敏感性高的特点，但由于其扩增肿瘤细胞的标记性基因，坏死的肿瘤细胞片段仍被识别而造成假阳性，进而影响肿瘤手术范围的大小及术后补充治疗的方案，因此在临床应用上存在一定的局限性[12]。DNA倍体分析是对具体的细胞成分进行分析，准确率高，但费用高昂，患者经济负担重，制约了在临床中的使用。免疫组织化学法(IHC)是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)的存在。即带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞与对应组织结合化学反应显色，对其进行定位、定性及定量的研究[13]。液体活检中对循环细胞的检测原理大致为循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell, CTC)从原发病灶/转移病灶中脱落入血，在循环血液中部分CTC逃避免疫监视向其他部位移动，造成转移性病灶。在转移的过程中，一些CTC以单细胞/细胞簇的形式存在，CTC细胞簇被称为循环肿瘤微栓子(Circulating Tumor Microemboli, CTM)，具备了比CTC更强的转移能力。CTC通过富集和体外检测鉴定等多个步骤在体内被实时监测，在发现肿瘤早期微转移、评估肿瘤治疗效果和检测肿瘤进展方面具有丰富的临床应用价值，但是在外周血中CTC的含量极低，外周血中同时存在大量血细胞会干扰CTC的检测，由于CTC的稀缺性，实际工作中仍缺乏对其高度敏感的检测手段，因此临床应用较为局限[14]。鉴于各检测方法的作用原理及实际应用情况，免疫组化法可以从组织形态上区分细胞，发现常规病理学检测无法察觉到的异常细胞，因此凭借简便的操作和高于常规病理染色的准确性，在临床上广泛应用。此外，由于肿瘤转移是一个涉及多步骤的复杂过程，除常规检测方式外，也有一些其他指标可以帮助预测肿瘤的转移情况及预后，如王云霄等人的研究证明乳腺癌患者血清甲状腺激素FT3、FT4在评估患者术后转移情况及预后有一定的临床价值，可以指导术后干预方案[15]。郝娥娥等人的研究发现凝血指标APTT、D-D等的水平变化与非小细胞肺癌患者肿瘤的转移具有相关性，观察凝血指标有助于初步判断非小细胞肺癌患者的转移与复发情况[16]。

4. 淋巴结微转移和细胞角蛋白AE1/AE3在其中的价值

一些肿瘤在转移的过程中仅表现为淋巴结微转移(Lymph Node Micrometastasis, LNM)，LNM被定义为在淋巴结中肿瘤病灶的大小在0.2~2 mm之间和/或有超过200个肿瘤细胞在淋巴结内聚集、病灶仅局限在淋巴结内以及淋巴结结构完整，未受到明显的破坏。临床实践中LNM在HE染色中不易被观察到，微转移是一种肿瘤细胞增殖与凋亡平衡的休眠状态，维持这种状态较长时间后会引起肿瘤的复发，目前临床工作中对肿瘤微转移及LNM的认识及重视程度不够，造成了对肿瘤分期的偏倚，因此寻找有助于鉴定微转移情况的方式成为了提高恶性肿瘤治疗效果的一个新方向，有助于评估肿瘤风险、治疗效果、预后并指导临床干预方案。细胞角蛋白(cytokeratin, CK)主要分布于上皮细胞，但在部分肉瘤中也会有表达，是细胞中的主要骨架蛋白，主要功能是维持上皮组织的完整性及连续性。根据CK的特性有助于对上皮性肿瘤进行分类，指导病理诊断，CK作为肿瘤标记物已广泛应用于临床，不仅有助于鳞状细胞癌、腺癌以及移行细胞癌的鉴别，在检测肿瘤局部浸润或微转移方面也有临床意义。罗婧等人的研究显示CK19可用于检测肿瘤细胞在间叶组织中的转移，其中在淋巴结中的微转移最为成熟，CK19被认为是检测肿瘤微转移最理想的指标，但淋巴结中表达CK的细胞不一定是肿瘤细胞，也可能是肿瘤细胞在未形成转移灶前被巨噬细胞吞噬而形成的瘤细胞碎片，PCR基于扩增标记基因的原理会出现过高的检出率导假阳性率升高，影响其对临床的指导意义[17]。在关于食管癌的研究中发现，常规病理检测为阴性的患者中，IHC法检测到的LNM阳性者与阴性者相比有较高的复发率和较低的5年生存率[18]，但也有研究发现LNM阳性组和阴性组5年生存率无明显差异，有数据证明LNM阳性组与阴性组之间的复发率无明显差异，因此LNM对预测食管癌的价值仍存在争议。可能是由食管癌的肿瘤生物学行为、转移途径、肿瘤生长部位及肿瘤类型决定[19]。AE1/AE3是一种针对上皮细胞标志物广谱细胞角蛋白多种亚型的单克隆抗体，AE1/AE3阳性表示发生了上皮转移[20]。研究发现子宫内膜癌患者中，经常规HE染色发现无转移淋巴结中CK (AE1/AE3)的阳性率约为12%，在有转移的淋巴结中AE1/AE3的阳性率为100%，也就是说经HE染色发现的阳性淋巴结，AE1/AE3一定有表达，HE染色无转移的淋巴结，也部分表达AE1/AE3；在Ⅰ、Ⅱ期子宫内膜癌患者中，AE1/AE3的表达与组织浸润深度、病理分级及淋巴管浸润有关。在14例AE1/AE3阳性的患者中，出现术后复发的有9例，22例AE1/AE3阴性的患者中，有1例出现术后复发，差异有统计学意义；多因素回归分析提示AE1/AE3阳性表达是Ⅰ、Ⅱ期患者术后复发的独立危险因素[21]。杨会钗在对1585枚乳腺癌前哨淋巴结微转移进行研究时发现，HE染色和AE1/AE3标记均发现肿瘤转移的有93例；HE染色未发现肿瘤转移、AE1/AE3标记发现肿瘤微转移或孤立性细胞簇的共90例；HE染色可疑转移的5例中，经AE1/AE3标记发现其中3例未发生转移；HE染色和AE1/AE3标记均未发现转移的有1397例。本研究证实AE1/AE3标记发现淋巴结转移显著高于HE染色，HE染色性质不明时AE1/AE3标记也有助于鉴别淋巴结转移情况，因此常规病理检查结合AE1/AE3标记不仅可以减少漏诊率，还可以降低HE染色的假阳性率。淋巴结转移情况直接决定肿瘤分期和术后是否需行补充治疗，方丽萍等人的研究表明晚期卵巢癌患者术后联合化疗组患者疾病控制率明显高于未行术后化疗组[22]，但刘福善的研究表明食管癌、贲门癌术后化疗组的生活质量明显低于非化疗组，且两者生存期无明显差异[23]。因此，病理HE染色结合AE1/AE3标记有助于明确淋巴结转移情况，有助于识别术后复发的高危患者，并最大限度避免过度医疗。需要明确的一点是并非所有指标中提示存在淋巴结微转移的患者最后都会发生转移，LNM或AE1/AE3标记阳性只是提示了复发/转移风险的存在或风险提高的可能，为了了解患者病情及肿瘤后续发展的情况，有必要寻找更敏感的指标应用于临床工作。

5. 展望

随着抗肿瘤药物和分子生物学检测技术的不断更新与发展，恶性肿瘤的早期诊断和治疗效果已经取得极大进步，如果在在恶性肿瘤发生转移前进行医疗干预，往往不会明显影响患者的预期寿命，但现有的条件下离完全治愈恶性肿瘤患者还有很长的路需要探索。淋巴结微转移发生在肿瘤进行局部浸润和/或远处转移这一过程中，此时受累淋巴结大多数未形成结节，难以被精准判定，这些微转移往往参与、促进甚至直接导致的肿瘤治疗后的复发。综合考虑检测的精准性及患者的经济负担，目前免疫组化法是检测肿瘤微转移最常用的方法，AE1/AE3作为特异性的上皮性肿瘤分子标记物，不仅可以对常规病理未发现转移的淋巴结进行微转移的检测，减少HE染色发生的假阴性，还可以对HE染色不明性质的淋巴结做出定性诊断，从而实现对患者个体病情的精准把握，指导临床干预时间窗口和治疗方案。但是免疫组化原理为抗原抗体特异性结合显色，受抗原抗体试剂盒和肿瘤细胞与正常细胞之间存在的交叉抗原等的影响，免疫组化检测只是相较于传统病理检测具备了明显优势，但对恶性肿瘤的鉴别仍不能达到完全精确。因此继续寻找其他检测方法及观测指标是后续研究肿瘤转移的一大方向，我们期待新的检测和治疗方法问世。

NOTES

^*通讯作者。