摘要: 目的:研究miR-30e-5p与H
2O
2损伤后心肌细胞凋亡的关系,探讨miR-30e-5p靶向BIM基因调控H
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2损伤后心肌细胞凋亡的作用,为心肌梗死的诊断以及治疗提供新的靶点。方法:将40天CA16分为正常组(N)、缺氧组(H)、过表达对照组(NC+H)、miR-30e-5p过表达组(miR+H)。N组置于正常培养箱下培养;H组置于缺氧培养箱培养24 h;NC+H组与miR+H组分别为稳定感染装载有miR-NC和miR-30e-5p的重组慢病毒后缺氧处理24 h。应用RT-qPCR检测CA16中miR-30e-5p和BIM的mRNA表达水平,应用Caspase-3活性实验和流式细胞技术检测hiPSC-CMs的凋亡水平。利用生物信息学miRNA数据库预测miR-30e-5p的靶基因,并应用双荧光素酶报告基因实验进行验证。结果:1) 与N组比较,H组miR-30e-5p表达水平明显下调;与NC+H组比较,miR+H组miR-30e-5p表达水平则明显上调。2) 与N组比较,H组Caspase-3活性水平明显升高;与NC+H组比较,miR+H组Caspase-3活性水平下降。3) 与N组比较,H组CA16细胞凋亡比例明显上升;与NC+H组比较,miR+H组CA16凋亡比例则明显下降。4) 与N组比较,H组蛋白BIM表达水平上调;与NC+H组比较,miR+H组蛋白BIM表达水平下调。5) 通过miRNA数据库分析发现BIM是miR-30e-5p的潜在靶基因之一。结论:1) miR-30e-5p调控缺氧诱导CA16的凋亡。2) BIM是miR-30e-5p的靶基因之一。3) miR-30e-5p靶向BIM调控缺氧诱导CA16的凋亡。4) miR-30e-5p在急性心肌梗死的发生、发展过程中可能发挥抑癌基因的作用。
Abstract:
Objective: To investigate the relationship between miR-30e-5p and myocardial cell apoptosis after H2O2 injury, and to explore the role of miR-30e-5p targeting BIM genes in regulating myocardial cell apoptosis after H2O2 injury, providing new targets for the diagnosis and treatment of myocardial infarction. Method: The 40 day CA16 was divided into normal group (N), hypoxia group (H), overexpression control group (NC+H), and miR-30e-5p overexpression group (miR+H). Group N was cultured in a normal incubator; Group H was incubated in a hypoxia incubator for 24 hours; The NC+H group and miR+H group were treated with hypoxia for 24 hours after stable infection with recombinant lentivirus loaded with miR-NC and miR-30e-5p, respectively. RT qPCR was used to detect the mRNA expression levels of miR-30e-5p and BIM in CA16, and Caspase-3 activity assay and flow cytometry were used to detect the apoptosis level of hiPSC-CMs. Using bioinformatics miRNA database to predict target genes of miR-30e-5p, and validating with dual luciferase reporter gene experiments. Result: 1) Compared with group N, the expression level of miR-30e-5p in group H was significantly down-regulated; Compared with the NC+H group, the expression level of miR-30E-5p in the miR+H group was significantly up-regulated. 2) Compared with group N, the activity level of Caspase-3 in group H was significantly increased; Compared with NC+H group, the activity level of Caspase-3 in miR+H group was decreased. 3) Compared with group N, the apoptosis ratio of CA16 cells in group H was significantly increased; Compared with NC+H group, the apoptosis ratio of CA16 in miR+H group was significantly decreased. 4) Compared with group N, BIM expression level of histone H was up-regulated; Compared with NC+H group, BIM expression level of histone in miR+H was down-regulated. 5) The analysis of miRNA database showed that BIM was one of the potential target genes of miR-30e-5p. Conclusion: 1) miR-30e-5p regulates apoptosis of CA16 induced by hypoxia. 2) BIM is one of the target genes of miR-30e-5p. 3) miR-30e-5p targets BIM to regulate hypoxia-induced apoptosis of CA16. 4) miR-30e-5p may play a role as a tumor suppressor gene in the occurrence and development of acute myocardial infarction.
1. 引言
心肌梗死是一种高发生率的疾病,急性心肌梗死不仅发生率高,而且致死率高,其发生的年龄不仅局限于中老年人[1]。同时,也具有极高的复发率,部分患者由于就诊时已经逐渐发展到晚期以及末期,因此患者的预后较差。因此,需要充分了解心肌梗死发生和发展的分子机制,以找到新的靶点以及靶向基因来改善心肌梗死的临床治疗效果[2]。部分研究表明,miRNA在心肌梗死的发生和发展中具有重要作用,这也进一步为心肌梗死的治疗提供了新的思路[3]。本研究探讨miR-30e-50p对心肌细胞凋亡的影响以及其可能的分子机制,以期为心肌梗死的诊断和治疗提供新的靶点[4]。
2. 材料
2.1. 细胞及试剂
2.1.1. 实验细胞
CA16细胞。
2.1.2. 主要试验试剂
人多潜能干细胞培养基、人心肌细胞分化试剂盒、人心肌细胞纯化培养基、人心肌细胞维持培养基、人心肌细胞消化液、人心肌细胞接种培养基、EDTA传代工作液购买于北京市赛贝生物科技有限公司;Matrigel基质胶、α-actinin抗体、心肌钙蛋白T (cTnT)抗体、Alexa Fluor 594山羊抗鼠IgG、Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG、DAPI抗荧光衰减封片试剂、DEPC处理水、cDNA逆转录试剂盒、SYBR Green I RT-qPCR试剂盒、Caspase-3活性检测试剂盒、载体psiCHECK-2 Promega、大肠杆菌菌株DH5α、限制性内切酶、质粒DNA小、大量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒、琼脂糖、琼脂粉、DNA ladder、一次性平皿、Flask、移液管、耗材(EP管、PCR管、枪头等)、载体pHBAAV-U6-ZsGreen、T4连接酶、Fluo-4,AM钙荧光探针Fluo-4,AM、不含钙HBSS溶液、RIPA裂解液、DEPC、BCA蛋白浓度测定试剂盒、脱脂牛奶、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、TEMED、Loading Buffer缓冲液、ECL化学发光试剂盒、考马斯亮蓝染色液、兔抗人GAPDH抗体、兔抗人Bax抗体、兔抗人Bcl2抗体、兔抗人Caspase-3抗体、FITC Annexin V细胞凋亡试剂盒。
2.1.3. 主要试验仪器
−80℃冰箱、超净工作台、37℃恒温细胞培养箱、移液枪、离心管、细胞培养皿、共聚焦显微镜、倒置显微镜、电热恒温水浴箱、台式高速离心机、流式细胞仪、NanoDrop2000微量分光光度计、光吸收酶标仪、实时荧光定量PCR仪、PCR热循环仪、凝胶成像仪稳压DNA电泳仪、低温循环水浴、生物安全柜、凝胶成像系统、生化培养箱、电泳仪、转膜仪、细胞培养箱、流式管、大型冷冻高速离心机、微量移液器。
3. 方法
3.1. 细胞培养
将细胞置于5% CO2、37℃环境下培养。
3.2. 细胞分组
将处于对数生长期的心肌细胞的CA16分为正常组(N)、缺氧组(H)、过表达对照组(NC+H)以及miR-30e-5p+H组(miR+H)。正常组置于正常条件下培养24 h,缺氧组用H2O2处理后置于正常条件下培养;过表达对照组(NC+H)以及miR-30e-5p+H组(miR+H)组分别被慢病毒感染,将(NC+H)组置于正常条件下培养,而将(miR+H)用H2O2缺氧处理后置于正常条件下培养(正常条件:5% CO2的37℃培养箱中)。
3.3. 诱导缺氧处理
H2O2诱导处理。
3.4. 慢病毒感染心肌细胞
提前准备好用于感染的接种于96孔板的293T细胞和目的质粒。37℃,5% CO2培养。感染6 h后更换新的培养基,感染24 h后收集细胞检测[5]。
3.5. qRT-PCR实验
将不同处理和转染24 h后的细胞,通过胰酶消化的作用,收集细胞沉淀后加入Trizol提取其全部RNA,经定量后逆转录为cDNA,在PCR分析仪上进行实时荧光定量PCR扩增。
3.6. 细胞凋亡实验
转染24 h后各组细胞用不含EDTA的胰酶消化(胰酶消化不宜过长,否则容易引起假阳性),2000 r/min离心5 min后收集细胞;用PBS洗涤细胞两次(2000 r/min离心5 min)收集1~5 × 105细胞;加入500 uL的Binding Buffer悬浮细胞;先加入5 uL Annexin V-FITC混匀室温、避光、反应5 min后,加入5 uL Propidium Iodide混匀再室温、避光、反应10 min;1 h内,进行流式细胞仪的观察和检测[6]。
3.7. 慢病毒感染心肌细胞
感染前一天接种,将心肌细胞接种到6孔板中,培养2~3天待心肌细胞活性功能恢复。细胞数密度约40%~60%间为宜。设置不同MOI值的感染组,分别设立MOI值为3,10,20,50,100的感染组别,每组各做两个复孔,一孔中加入终浓度为5 μg/ml的Polybrene,另一组不加。Polybrene可以促进病毒对细胞的侵染,但对部分类型细胞有损失作用。待感染24小时后,将原培养上清液丢掉,更换为新鲜的培养基。待感染3~4天后,在荧光显微镜下观察细胞感染情况,成功被感染的细胞会表达绿荧光。通过显微镜拍照目测估计或是根据图片数数计算,估计感染效率,以确定最佳感染复数MOI的值。待感染72小时后,将培养皿置于荧光显微镜下检测心肌细胞GFP荧光表达效率[7]。
3.8. Caspase-3活性检测
将96孔板置于37℃阴暗处孵育1~2小时。待发现颜色变化比较明显时,设置酶标仪进行检测96孔板中在405 nm下的OD值。如果信号强度变化不明显,则可以适当延长孵育时间直至96孔板的颜色加深、信号增强。应用公式算出样品中Caspase-3催化产生的pNA产生的吸光度。通过标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生pNA的量。最后计算出一个待测样品单位重量蛋白中所含的Caspase-3的酶活性单位[8]。
3.9. 数据库预测靶基因
3.9.1. miR-30e-5p靶基因的预测
进入star Base 2.0 (http://starbase.sysu.edu.cn/index.php),选择“miRNA-mRNA”表单下的“miRNA-target interactions”功能,在“Intersections from different prediction programs‖栏目下选择,miRNA:选择hsa-miR-30e-5p;–Number of supporting Experiments>=‖:选择“high stringency(>=3)‖;–Number of Cancer Types (Pan-Cancer)>=‖选择“1 cancer type‖;–Program Number>=‖选择“3 prediction software‖,将所得数据生成excel文件进行存储。
3.9.2. GEO数据库筛选急性心肌梗死中上调基因
进入GEO (Gene Expression Omnibu)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),输入AMI,得到一系列GEO Data Sets后,筛选样本量比较大的表达谱数据,通过RStudio对芯片数据进行分析,首先定义和选择–TUMOR GROUP‖,然后定义和选择“NORMAL GROUP”,进行GEO2R分析后将得到数据生成excel文件进行保存。认为某基因logFC > 1时,即差异倍数大于2时,在急性心肌梗死中表达上调。
3.9.3. miR-30e-5p在心肌梗死中靶基因的预测
前期实验提示miR-30e-5p在急性心肌梗死中呈低表达趋势,细胞生物学功能实验证明miR-30e-5p在急性心肌梗死中起抑制凋亡功能。因此,推测miR-30e-5p的靶基因能促进急性心肌梗死发生、发展,在急性心肌梗死中呈高表达趋势将star Base 2.0预测出的miR-30e-5p靶基因与GEO得到的在急性心肌梗死中表达上调的基因取交集得到的可能是miR-30e-5p在急性心肌梗死中的靶基因。
3.10. 统计学数据处理
实验数据结果应用SPSS 28.0统计分析软件进行分析;定量资料以均数 ± 标准差()表示;对计量资料进行正态性及方差齐性检验,两组间比较采用独立相关t检验,多组间比较采用单因素方差分析,多组间两两比较采用LSD检验,检验水准(α)以P < 0.05为差异具有统计学意义。
4. 实验结果
4.1. miR-30e-5p的表达水平
选取缺氧24 h为时间节点进行进一步研究,经过缺氧处理后,将N组与H组进行比较,H组中miR-30e-5p表达水平明显下调(P < 0.05);经过感染过表达miR-30e-5p慢病毒后,将NC+H组与miR+H两组进行比较,miR+H组miR-30e-5p表达水平则显著上调(P < 0.05)。表明成功构建miR-30e-5p过表达模型,具体数据见图1。
Figure 1. Expression levels of miR-30e-5p in CA16
图1. miR-30e-5p在CA16中的表达水平
4.2. Caspase-3的活性水平
采用Caspase-3活性检测实验初步探讨缺氧诱导后CA16的凋亡水平,结果如图所示,与N组比较,缺氧处理后H组Caspase-3活性水平明显升高(P < 0.05);而经过感染过表达miR-30e-5p慢病毒后,与NC+H组比较,miR+H组Caspase-3活性水平下降(P < 0.05),表明凋亡水平有所缓解,具体见图2。
4.3. CA16的凋亡水平
我们采用细胞凋亡试剂盒应用流式技术,进一步检测CA16的凋亡水平,结果和Caspase-3活性水平结果一致。如图所示,与N组比较,H组CA16凋亡比例明显上升(P < 0.05);而经过感染过表达miR-30e-5p慢病毒后,与NC+H组比较,miR+H组CA16凋亡比例则明显下降(P < 0.05),具体见图3。
Figure 2. Activity level of Caspase-3 in CA16
图2. Caspase-3在CA16中的活性水平
Figure 3. Proportional level of CA16 apoptosis after hypoxia induction
图3. 缺氧诱导后CA16凋亡比例水平
4.4. miR-30e-5p的靶基因预测分析
为进一步探讨miR-30e-5p调控缺氧诱导CA16凋亡的相关机制,对miR-30e-5p的靶基因进行研究。生物信息学miRNA数据库预测分析结果显示,BIM可能为miR-30e-5p潜在靶基因之一。通过进一步比对miR-30e-5p和BIM的序列,我们发现两者存在潜在结合位点,并查阅相关文献和数据库,证实BIM在心肌细胞中大量表达并且与凋亡及自噬机制相关。因此,有理由猜测BIM可能是miR-30e-5p调控心肌细胞凋亡的一个重要靶点,具体见表1。
4.5. 生物信息学证实BIM是miR-30e-5p的靶基因
通过GEO数据库分析相关数据集后,结果提示miR-30e-50p在心肌梗死中是一条重要的通路,而BIM可以被miR-30e-50p靶向调控进而影响心肌梗死的发生发展。
Table 1. Predictive analysis of target genes of miR-30e-5p
表1. miR-30e-5p的靶基因预测分析
Symbo1 |
logFC |
P.Value |
adj.P.Va1 |
Change |
BCL6 |
1.736375075 |
1.05E−09 |
3.79E−07 |
UP |
S0CS3 |
0.725141695 |
6.75E−08 |
1.12E−05 |
UP |
BCL2L11 |
0.681170299 |
0.000779916 |
0.017118994 |
UP |
VIM |
0.859319848 |
0.004612564 |
0.05799139 |
UP |
AG02 |
0.643522517 |
0.004907579 |
0.060665128 |
UP |
KRAS |
0.703339294 |
0.015094434 |
0.125921298 |
UP |
5. 讨论
本实验通过CA16细胞用H2O2诱导缺氧损伤后所建立的模型检测miR-30e-5p及调亡表达水平变化情况,通过实验分析发现,在CA16心肌细胞被缺氧处理后12 h、24 h、36 h以及48 h的四个不同时间段内,miR-30e-50p的表达水平是不同的[9]。随着缺氧程度的加重,miR-30e-50p的表达量逐渐下降,也即miR-30e-50p的表达量与心肌梗死的程度成反比,心肌梗死的程度越重,miR-30e-50p的表达量越少[10]。同时,在缺氧处理48 h后,CA16细胞的凋亡水平更高,miR-30e-5p表达水平明显下调。本项目组通过选取缺氧诱导后的24 h作为观察时间点进行下一步研究,在用慢病毒进行感染细胞构建重组细胞之后,发现CA16细胞的凋亡水平明显下调,这也就从另一方面反应出miR-30e-50p可以改善缺氧对CA16所造成的影响,即改善CA16的凋亡水平[11]。
随着生物信息学技术的发展,越来越多的实验以及报告发现“凋亡”这一机制在多种心血管疾病的发生以及进展的过程中发挥着关键的作用,抑制“凋亡”以及“自噬”有望成为心血管疾病的治疗最新靶点[12]。本项目组在综合实验以及生物信息学数据库的基础之上发现miR-30e-50p在诱导CA16调亡损伤中发挥关键作用,同时根据GEO数据库分析“GSE48060”这一数字矩阵分析预测靶向基因,结果表明以及证实BIM为miR-30e-5p的靶基因之一[13]。而BIM不仅能联合其他基因对生物分子通路产生影响,而且又能独立地产生作用,对多系统的多种疾病中均有相关的作用,而在本实验中同样发现,BIM在缺氧诱导CA16凋亡过程中具有重要作用。缺氧诱导后的CA16细胞中BIM水平明显升高,而当miR-30e-50p过表达后,BIM水平又明显下降,CA16的凋亡水平又同样明显下降,CA16细胞凋亡水平恢复正常[14]。
本课题组在结合生物信息学的基础之上虽然证实miR-30e-50p可以抑制BIM进而抑制H2O2作用后的CA16细胞的凋亡[15],但是本课题组仍然存在一定程度的局限性:首先,部分研究已经表明仍然存在其他靶向基因相互影响,不排除这些靶基因也参与了H2O2所诱导的缺氧[16];同时,根据宿主的不同,这些基因所产生的效应也是不同的;最后,需要明确的是本项目组的实验属于体外,而且所使用的样本比较单一,因此在未来需要更进一步的探索以及研究[17]。
综上所述,针对本课题组经过实验研究以及分析后所得出的结论:miR-30e-50p以及靶基因BIM与缺氧后CA16的凋亡密切相关,miR-30e-5p能靶向BIM进而调控缺氧诱导的CA16的凋亡。而BIM如何调控H2O2缺氧诱导的心肌细胞的凋亡的具体分子机制有待进一步研究[18]。
致 谢
感谢我的导师对我的指导,感谢评阅论文的老师们在百忙之中给予我的宝贵意见。
基金项目
延安大学2023年研究生教育创新计划项目(YCX2023117)。