Wnt信号通路影响角膜缘上皮干细胞干性机制的研究进展

Progress in the Mechanism of Wnt Signaling Pathway Affecting the Stemness of Limbal Epithelial Stem Cells

摘要: 与其他组织的干细胞一样，周围微环境或角膜缘微环境严格支持和调节着LSCs的功能行为。角膜缘微环境具有独特的特征和成分，包括间充质细胞、免疫细胞、黑色素细胞、血管细胞、细胞外基质和信号分子(例如生长因子和细胞因子)。此外，该微环境包含各种信号通路的微妙平衡，包括Wnt、Notch、BMP、Shh、YAP和TGFβ。这些通路的激活或抑制通常取决于LSCs与微环境细胞和细胞外基质之间的相互作用。Wnt信号通路极大地促进了LSCs的体外自我更新能力。对LSCs或它们的生态微环境的损伤会导致角膜缘干细胞功能不全(LSCD)。了解LSCs在体外和体内的分子调控机制将大大有助于LSCD治疗的改进。本文重点综合了当前关于影响LSCs功能的微环境相关Wnt信号通路的文献。未来LSCD治疗的发展应考虑所有这些微环境因素，以改善LSCD人群的长期疗效。

Abstract: Like the stem cells in other tissues, the surrounding microenvironment or limbal niche strictly supports and regulates the functional behaviors of LSCs. The limbal niche has unique characteristics and components, including mesenchymal cells, immune cells, melanocytes, vascular cells, extracellular matrix and signaling molecules (e.g., growth factors and cytokines). In addition, this niche contains a fine balance of various signaling pathways, including Wnt, Notch, BMP, Shh, YAP, and TGFβ. The activation or inhibition of these pathways usually depends on the interactions between LSCs and niche cells and extracellular matrix. The Wnt pathway greatly promotes the in vitro self-renewal ability of LSCs. Damage to LSCs or their ecological niches leads to corneal limbal stem cell deficiency (LSCD). The improvement of LSCD treatment will greatly benefit from understanding the molecular regulation of LSCs in vitro and in vivo. This review focuses on synthesizing current literature on niche related Wnt signaling pathways that affect LSC function. The future development of LSCD treatment should consider all these niche factors to improve the long-term recovery of the LSCD population.

1. 引言

角膜上皮在眼表面起到保护屏障的作用并不断再生。角膜上皮的这种独特特性依赖于位于角膜缘的自我更新的上皮干细胞，即角膜缘干细胞[1] [2] [3]。LSCs位于“Vogt栅栏”(也称为角膜缘上皮隐窝)中，对角膜上皮再生至关重要。LSCs通过分化产生角膜缘祖细胞(LPCs)和瞬时扩增细胞(TACs)对角膜上皮细胞更新或伤口愈合做出反应，然后迁移到中央角膜以补充角膜上皮[4] [5] [6]。与其他组织中的干细胞一样，周围的微环境或边缘生态位严格支持和调节LSCs的功能行为。角膜缘微环境具有独特的物理和化学特征，包括细胞(如间充质细胞、免疫细胞、黑色素细胞、血管细胞和神经细胞)、细胞外基质(ECM)和信号分子(如生长因子和细胞因子) [7] [8]。控制角膜缘微环境中LSCs命运的信号(自我更新、分化、静止、凋亡等)正在被阐明，包括Notch、骨形态发生蛋白、刺猬、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和Wnt信号[9]。涉及角膜缘微环境任何成分的重大病理过程都可能导致LSCs功能障碍，甚至导致角膜缘干细胞缺乏症[10] [11]，这种疾病的特征是伤口愈合受损或失明。角膜移植并不是治疗LSCD的有效方法，因为患者体内残留的LSCs不存在/不足以进行上皮化并维持移植物的健康[12] [13] [14]。由于需要恢复LSCs以成功治疗LSCD，除了优化手术技术以减少供体组织的数量外，还开发了基于培养中扩增LSCs的细胞疗法。为了进一步优化通过体外扩增产生的LSC移植的结果，识别参与LSC调节的角膜缘微环境因子并破译其功能至关重要[15]。在角膜缘微环境的这些因素中，Wnt信号通路是LSCs分化、增殖和静止的关键驱动因素之一。研究表明，将LSCs暴露于高水平的Wnt配体Wnt16b可导致成熟角膜上皮细胞的增殖增加和终末分化标记物的表达降低。

这篇综述总结了角膜上皮干细胞的位置、生理和病理生理学，并从Wnt信号通路的角度分析了角膜缘微环境在维持角膜上皮干细胞自我更新状态中的价值。

2. LSCs的位置及标志物

2.1. LSCs的位置

角膜是眼睛的窗口，占眼睛屈光力的三分之二。角膜由三层细胞组成：非角化的分层鳞状上皮、含有丰富胶原的基质的角膜细胞和后部单层特化的内皮细胞，分别由鲍曼层和Descemet膜隔开。即使没有疾病，角膜上皮细胞也会因老化、环境引起的干燥以及简单的眨眼动作而不断丢失[16]。角膜上皮细胞的功能是补充和维持完整的角膜表面，这对无障碍视力至关重要。表型和功能研究提供了令人信服的证据，证明角膜上皮干细胞几乎全部位于角膜缘的基底层，因此被称为角膜缘上皮干细胞(LSCs) [17] [18]。

2.2. LSCs的推定标志物

虽然已确定基底角膜缘上皮细胞中的LSCs为整合素alpha9阳性，而连接蛋白43、E-adherin、nestin、involucrin、K12和K3阴性，表皮生长因子受体表达较高。更重要的是[19]，非活性LSCs的基因表达谱与成熟角膜上皮细胞完全不同。单细胞RNA测序可帮助研究人员确定参与LSCs分化和功能的不同基因。例如，Li及其同事发现TSPAN7和SOX17是维持角膜上皮细胞平衡的关键因素[20]。此外，SOX9的表达似乎在LSCs的活化或静止调节中发挥了一定作用[21]。此外，RUNX1、SMAD3、ATF3、ABCB5、H2AX、PBK和Plk3等蛋白和信号通路也与LSCs的功能和增殖调节有关[22] [23] [24] [25]。这些发现可能证明，这些蛋白质未来可作为潜在标记物，用于筛选培养的LSCs移植的成功率和结果。总之，这些分子在不久的将来会显示出广阔的治疗应用前景，包括通过影响LSCs的自我更新能力和干性来提高移植成功率，引入调节上述途径的新药来对部分LSCD病例进行药物治疗，以及重新编程角膜上皮细胞，使其转分化为LSCs样表型，这是治愈双侧LSCD病例的捷径[26] [27]。

3. 角膜缘微环境

3.1. 干细胞微环境

干细胞的保存和正常功能需要特定的解剖部位。这些微环境被称为干细胞龛，包含多种成分，如支持细胞、多种信号因子、神经血管输入和ECM [28]。干细胞龛对角膜缘干细胞的功能至关重要。一项研究比较了完全切除角膜缘上皮而保留角膜缘干细胞龛与同时损伤角膜缘上皮和角膜缘干细胞龛两种情况。前一组角膜上皮得以恢复，而后一组角膜上皮则出现角膜新生血管，但没有愈合。在没有LSCs参与的情况下单纯损伤角膜龛可能会在随后损伤角膜缘时阻止伤口愈合[29] [30] [31]。

3.2. 角膜缘干细胞龛的微观结构与成分

角膜缘干细胞龛位于角膜缘隐窝，由纤维血管脊形成，被称为Vogt的宫殿[32]。这些结构的长度为0.31毫米，宽度为0.04毫米，与鼻部和颞部相比，在角膜上部和下部更容易发现。角膜缘上皮隐窝和基质突起是这一区域的其他分区，它们促进了来自龛内不同因子的信号整合[33]。基质突起是基质的指状突起，内含中央血管，向上延伸至边缘上皮。值得注意的是，这些结构是猪和人特有的，而其他哺乳动物则没有。在角膜缘基质中可检测到多种细胞类型，如神经细胞、血管细胞、免疫细胞、间充质细胞和黑色素细胞。

黑色素细胞产生黑色素，以保护LSCs免受紫外线辐射并清除活性氧(ROS)。黑色素细胞和LSCs直接相互接触，这可能表明黑色素细胞在维持LN和LSCs的功能方面起着支持作用。间充质干细胞(MSC)，尤其是CD90和CD105阳性细胞，似乎与LSCs有密切的相互作用。在共聚焦显微镜下，这些细胞被检测到与LSCs相邻，这可以解释为这一说法的证据。

3.3. 角膜缘龛的细胞外基质

角膜缘龛是一个多细胞微环境，具有独特的细胞外基质(ECM)和各种信号分子，支持LSCs的功能。具体而言，角膜缘上皮基底膜由Ⅳ型胶原α2和β2-氨基蛋白、玻璃体凝集素、纤维连接蛋白、整合素β组成，而CD29和肌腱蛋白C的组成使得角膜缘ECM的结构与角膜基质完全不同[31]。

此外，透明质酸(HA)是糖胺聚糖，是ECM的另一种成分，由透明质酸合成酶(HASs)产生，HASs有三种类型：HAS1、HAS2和HAS3。值得注意的是，所有三种类型的HAS都在角膜缘区域表达，每种酶的表达缺陷都会减少上皮层的数量和伤口修复的速度，并改变基底细胞的形态。一项研究表明，HAS2缺陷会导致睑板腺干细胞分区异常。因此，HA不仅能作为固定细胞的床，还能影响细胞行为，使其成为细胞或组织移植中使用的合适支架。在基底上皮附近还发现了独特的CD90和CD105阳性间充质干/基质细胞(MSCs)集群。根据研究发现，间充质干细胞的突起可穿透基底膜并与基底上皮细胞直接接触，这表明角膜缘间充质干细胞与基底上皮细胞之间存在物理联系。此外，间充质干细胞分泌的因子可通过各种信号通路支持和维持LSCs的克隆增殖和分化。总之，角膜缘的ECM有别于角膜基质，为LSCs提供了一个柔软的环境，而相邻的角膜和巩膜则较为坚硬。一些研究提出，角膜缘龛内的生物力学特性、弹性和硬度可能在引导角膜上皮细胞增殖方面发挥作用[11] [34]。

4. 参与角膜缘龛调控的基因和蛋白质

LSCs的增殖和分化调控是与邻近微环境细胞、可溶性因子和细胞膜外成分进行复杂的分子交叉协商的结果。角膜缘龛是由细胞外基质、黑素细胞、角膜缘基质细胞、角膜间充质细胞、神经、血管和可溶性因子组成的高度特化的组织结构，其特定的微环境通过复杂的信号因子网络调节LSCs。这些支持性生态位细胞和专门的细胞外基质对于将LSCs锚定在生态位中至关重要。作用于生态位内角膜缘干细胞的调节元件非常复杂，包括细胞间通讯、细胞间基质相互作用、可溶性因子(生长因子、激素、神经营养因子、信号蛋白)、代谢和免疫因子以及环境的物理和机械特性。上述角膜缘微环境与LSCs之间的动态相互作用，诱导角膜缘干细胞的增殖和分化，使其保持自我更新潜力，从而调节角膜上皮的稳态[35]。目前已描述了多种类型的相互作用来调节LSCs的活性和表型，包括细胞直接接触、平行信号传导、自动信号传导和刚性因子。要在培养物中维持LSCs就必须模拟体内生物位点，而生物位点必须为LSCs的增殖和存活提供所有必要的因子，并调节微环境中存在的多种信号通路，如骨形态发生蛋白、刺猬、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和Wnt信号。因此，下文将详细阐述Wnt信号在LSCs发育和维持过程中的作用[36] [37] [38]。

5. Wnt信号

WNTs是一个由19种蛋白组成的配体家族，在生理过程中具有经典β-catenin通路和非经典通路的特点。非经典WNT通路通过小GTP激活的WNT-Ca2+通路、WNT-JNK通路和其他通路发挥作用。Wnt信号通路一直被认为是调节各类干细胞增殖和分化的重要生态位因子。在造血干细胞中，Wnt信号促进造血干细胞的增殖并有利于其干细胞表型。在肠上皮干细胞中，Wnt配体由肌成纤维细胞龛细胞分泌，抑制Wnt信号可减少小鼠肠上皮增殖和隐窝丢失。在表皮干细胞中，Wnt信号的中断会导致脱发，并阻碍干细胞分化为毛囊角质细胞。目前，主流观点验证了Wnt信号对角膜LSCs自我更新和分化的价值。据报道，几种Wnt信号成分优先在人类角膜边缘而非角膜中表达。此外，Wnt/β-catenin信号的激活促进了培养的人类角膜LSCs的集落形成效率(CFE)，表明Wnt信号在LSCs的调控中发挥了积极作用[39]。

5.1. Frizzled7

在Wnt信号通路中，分泌的Wnt配体与膜结合的Frizzled(Fz)受体和共受体结合，激活细胞内信号转导，包括独立于b-catenin的经典通路和依赖于b-catenin的非经典通路。Frizzled(Fzd)是一种七跨膜蛋白，具有一个富含半胱氨酸的120氨基酸保守结构域(CRD)，能与细胞外的Wnt分子结合并触发下游信号转导。QRT-PCR比较了角膜和角膜缘中Fz1-Fz10的表达情况，结果显示Fz1、Fz4、Fz7和Fz10在角膜缘中的表达量一直显著较高，而Fz8在角膜中的表达量较高。更重要的是，Fz7优先在角膜缘上皮基底层强表达，而在角膜的表达量最低。以前的证据表明，在卫星干细胞中，Fz7与Sdc4形成复合物，FN与该复合物结合，增强了对称性扩张。同样，免疫组化显示，Fz7与Sdc4和FN共同位于基底角膜缘上皮细胞中。此外，大多数ΔP63α和Fz7细胞可同时位于基底角膜缘上皮细胞中。Fz7高表达的基底细胞中没有K12表达，这表明Fz7可作为潜在的LSC生物标记物，用于进一步鉴定和富集干细胞/祖细胞群。更重要的是，在LSCs中内源性敲除Fz7会导致几种推定的LSC标志物缺失和CFE下降。这些结果表明，Fz7还具有维持LSC干性的功能[40]。

5.2. WNT16b

5.2.1. WNT16b/CXCR4/MEK/ERK

根据以往的研究结果发现，WNT16B蛋白主要表达于角膜缘上皮的上层和基底层，并与LSCs的干细胞标记物Np63α共定位，表明WNT16B可能在LSCs的增殖和干性维持中发挥关键作用[41]。

根据新的研究结果，角膜缘的WNT16B表达量是角膜中央的两倍多，且随年龄而变化。年轻供体(0~30岁)的WNT16B表达量较高。在KI67和ΔP63α的表达方面也观察到类似的结果。

用不同浓度(50、100、200和400 ng/mL)的外源性WNT16B培养角膜缘外植体的原代细胞。这些研究结果表明，外源性WNT16B能增强体外培养的角膜缘LSCs的增殖和干性维持。为了研究WNT16B (200 mg/mL)对LSCSs的影响是否由依赖于β-catenin的信号通路介导。用小分子XAV939处理培养的LECs，XAV939可选择性地抑制WNT/b-catenin信号通路，其作用是抑制tankyrase (TNKS)并刺激细胞质β-catenin的磷酸化。单独或用WNT16B+XAV939治疗可显著降低LSCs中TNKS和β-catenin的表达。然而，免疫荧光染色显示，外源WNT16B未能激活细胞质β-catenin并诱导β-catenin的核转位。此外，KI67、ΔNP63α和ABCG2在与WNT16B+XAV939联合处理的LECs和仅与WNT16B处理的LECs之间没有显示出任何显著差异，这表明WNT16B的这一功能与β-catenin无关。RNA测序和KEGG通路分析表明，细胞因子–细胞因子受体相互作用是主要的富集通路。此外，C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)是细胞因子–细胞因子受体相互作用通路中的重要元素，主要表达于角膜缘，参与LSCs的干性维持。实时定量PCR证实，WNT16B处理的LECs中CXCR4的表达量是对照LECs的2.4倍。CXCR4被认为在许多细胞生物学过程中都很重要，它能激活一系列下游信号，包括MEK-ERK、JAK-STAT和PI3K-AKT信号通路。WNT16B可显著提高LECs中MEK和ERK的磷酸化水平。然而，WNT16B处理的LEC与对照组LECs的STAT和AKT磷酸化水平没有明显差异。为了确定CXCR4激活的MEK/ERK信号是否参与了经WNT16B处理的LSCs的增殖和自我更新，培养系统中使用了特异性CXCR4拮抗剂AMD3100。经WNT16B+AMD3100处理后，LSCs的CXCR4活性受到抑制。经AMD3100+WNT16B处理的LECs中MEK和ERK的磷酸化水平也出现了类似的下降。沉默CXCR4可抑制KI67、ΔNP63α和ABCG2的表达。总之，这些发现证实了WNT16B可通过激活CXCR4/MEK/ERK信号通路来增强LECs的增殖和自我更新。为了研究WNT16B修复角膜上皮损伤的潜力，该研究建立了小鼠角膜上皮伤口愈合模型。体内实验结果表明，WNT16B组P63+和ABCG2+细胞数量明显高于对照组，表明WNT16B可促进体内LECs的增殖[42]。

5.2.2. WNT16b/Ca2+/calcineurin A/NFATC2

先前的研究表明，外源性WNT16b(200 ng/mL)以独立于β-catenin的方式增强了hLSCs的增殖。根据测序结果，非经典的WNT/Ca2+/钙神经蛋白/NFAT途径得到了富集。使用荧光钙探针测定细胞内钙的变化，以确定WNT/Ca2+通路的活性。用WNT16b处理可显著增加细胞内荧光强度。此外，WNT16b激活钙通路的机制与NFATC2、NFATC1和PPP3CA及其亚型有关。此外，NFATC2(活性型)主要在细胞核而非细胞质中表达，而pNFATC2(非活性型)在细胞质和细胞核中的表达均显著减少。免疫荧光染色也证实，经WNT16b处理后，NFATC2被激活并转位至细胞核。进一步使用钙调素的特异性抑制剂FK506和选择性NFAT抑制剂VIVIT来验证钙调素a/NFATC2通路是否参与了WNT16b诱导的hLSCSs增殖。结果显示，无论是否存WNT16b，FK506都能显著抑制钙调素A和NFATC2的蛋白表达。WNT16b可促进细胞增殖标志物Ki67和ΔNp63α的表达，而FK506或VIVIT可抑制Ki67和ΔNp63α的表达。这些研究结果表明，阻断钙神经蛋白A/NFATC2信号通路可抑制受WNT16b刺激的hLSCs的增殖。

免疫沉淀确定了WNT16b和FZD7之间的相互作用。补充FZD7的多肽拮抗剂Fz7-21可抑制 Ca2+/calcineurin A/NFATC2信号通路，抑制hLSCs的增殖。这些结果表明，WNT16b能与FZD7受体结合并激活下游的Ca2+/钙神经蛋白A/NFATC2信号通路。表观遗传修饰在成体干细胞中发挥着重要作用。进一步的研究结果表明，hLSCs中NFATC2的激活介导了FoxM1启动子区域的H3K14ac和H3K27ac，以及c-MYC和FoxM1启动子区域的H3K4三甲基化。WNT16b处理促进了NFATC2的表达以及c-MYC和FoxM1启动子区域的富集，而VIVIT可以恢复这些表达。在8周大的野生型(WT)C57BL/6小鼠和Wnt16b基因敲除(KO)小鼠中建立角膜上皮伤口愈合模型。在Wnt16bKO小鼠的角膜缘上皮细胞中，P63α和ABCG2以及FZD7、钙调磷酸酶A、NFATC2、c-MYC和FOXM1的表达明显减少。与WT组相比，Wnt16b KO小鼠的上皮愈合速度最慢。这些发现表明，缺乏Wnt16b会导致角膜上皮伤口愈合延迟，而外源性Wnt16b可通过促进LSCs增殖来加速伤口愈合[43]。

5.3. Wnt6

与角膜相比，四种Wnt配体Wnt2、6、11和16b在角膜缘的表达量更高。为了研究Wnt6在体外LSC扩增环境中调节人LSC增殖和维持的作用，作者制备了过表达不同水平Wnt6的NIH-3T3饲养细胞。在表达Wnt6的3T3细胞上培养的LSCs的特征表明，高水平的Wnt6会增加LSCs的增殖。中度和高水平的Wnt6也会增加小细胞数量(直径≤12 μ m)。此外，在中度和高水平的Wnt6作用下，表达分化标志物K12的细胞比例明显下降。尽管Wnt6主要被称为经典Wnt配体，但数据表明，在补充了Wnt6的LSC培养物中，经典和非经典Wnt信号通路都被激活。这一发现表明，Wnt6对LSC的调控需要两种途径之间的相互关系[44]。

5.4. β-catenin/Tcf4/survivin

TCF4是Wnt信号系统中的一个关键转录因子，最近发现它对维持干细胞至关重要。然而，其信号通路尚未得到很好的阐明。一项新的研究使用不同的培养基培养角膜LSCs，以探索β-catenin/Tcf4/survivin信号在维持LSCs特性中的功能作用：低钙和无血清的祖细胞培养基CnT-20、CnT-50、KSFM和D-KSFM，以及含高钙血清的补充激素上皮培养基(SHEM)。在SHEM(一种含高钙和血清的培养基)中生长的HCCCs不能进行一次或两次以上的传代。相反，在所有低钙和无血清培养基中培养的HCC都具有较高的增殖能力。选择CnT-20作为进一步研究的对象，因为它代表了一种已知能促进上皮祖细胞的低钙无血清体外培养基。进一步的研究表明，在CnT-20中生长的HCCCs表达的p63、整合素b1和表皮生长因子受体(EGFR)明显较高，同时抑制了连接蛋白43和K3的表达。总之，低钙和无血清培养基可维持体外LSCs的干细胞表型和高增殖能力。Wnt信号通路的标志物是Tcf家族成员，它们能结合β-catenin并触发Wnt靶基因，如survivin，从而调节细胞功能。存活素是一种重要的有丝分裂基因，在细胞分裂的几个步骤中都必不可少。在CnT-20中培养的人类LSCs表达较高的这三种因子。沉默Tcf4可抑制Tcf4基因及其下游靶分子Survivin，从而抑制hLSCs的增殖能力。这些结果有力地表明，catenin/Tcf4/survivin信号传导在维持角膜上皮祖细胞特性的过程中起着至关重要的作用[45]。

6. 结论

角膜缘干细胞缺乏症(LSCD)是一种由于角膜上皮干细胞(LESCs)损伤或丧失而导致的角膜上皮愈合功能障碍。目前已开发出一种利用上皮干细胞移植治疗LSCD的方法。然而，有效的修复和恢复取决于许多因素，如捐赠干细胞的来源和浓度，以及支持这些移植细胞的适当条件。有必要进一步研究如何在体外调节角膜缘干细胞的干性。过去有很多证据表明，Wnt信号参与了成体干细胞的自我更新。因此，本文重点研究Wnt信号在角膜缘干细胞中的价值，为角膜缘上皮干细胞的体外扩增提供新的线索。