1. 引言
液液相分离(liquid-liquid phase separation, LLPS)是蛋白质通过一些弱相互作用分离成蛋白质耗尽的分散相和富含蛋白质的浓缩相来最小化它们自由能的热力学过程，包括疏水、静电、氢键、阳离子-π以及π-π相互作用等[1] [2] [3]。蛋白质或其他生物大分子通过LLPS凝聚成的类液滴状结构被认为是无膜细胞器的基础，这些分子凝聚物还参与多种生物学过程，包括染色质重组，信号传导，细胞自噬等[4] [5] [6]。它们表现出比周围介质更高的蛋白质密度和更弱的分子运动，从而帮助细胞更快地进行生化反应[5]。随着研究的深入，越来越多可以在生理条件下发生LLPS的蛋白也在病理聚集物中被发现，也就是说病理性的蛋白聚集可能源于异常的液液相分离。病理性蛋白质聚集是多种神经退行性疾病的主要标志，包括肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、额颞叶变性(Frontotemporal lobe degeneration, FTLD)、阿尔茨海默症(Alzheimer disease, AD)和帕金森病(Parkinson’s disease, PD)等[7] [8] [9]。TARDNA结合蛋白43 (TAR DNA-binding protein 43, TDP-43)、肉瘤融合蛋白(Fused in sarcoma, FUS)、微管结合蛋白(Microtubule Associated Protein，MAP) Tau和α-突触核蛋白(α-synuclein)都表现出可以从可逆的动态性LLPS转变为不可逆的聚集状态，并且分别在ALS、FTLD、AD和PD患者的病理神经元细胞中均有发现这些蛋白的病理性聚集体[10] [11]。
FUS蛋白最开始是在人类粘液样脂肪肉瘤相关的染色体易位的一部分中发现的，主要分布于细胞核[12]。如图1所示，FUS由7个不同的结构功能序列组成，分别是N末端低序列复杂性结构域(Low-sequence Complexity, LC)；三个富含精氨酸–甘氨酸的内在无序区域(Rggs)；一个能够与大量RNA和DNA结合的结构域(RRM)；一个锌指结构域(ZnF)以及C末端的核定位序列(NLS) [10] [13]。其中C端NLS结构域与核转运蛋白1 (TNPO1)具有很高的亲和性，于是TNPO1可以特异性结合FUS将其从细胞质导入细胞核中[14]。FUS在细胞内参与了多种生物过程，例如DNA损伤修复[15] [16]，与RNA聚合酶Ⅱ相互作用调节转录[17]、通过多聚体结合长内含子参与RNA的剪接以及mRNA转运和翻译的亚细胞定位[18]等。研究表明FUS会经过LLPS形成高度动态的液滴参与到这些生物过程中[19]，例如，在DNA损伤修复的早期，FUS会在DNA损伤位点富集，然后通过LLPS形成一个无膜区室来招募损伤修复相关的反应因子[15]。而这些亚稳态的液滴在一定条件下会转变为病理性的淀粉样纤维聚集体，它们通常流动性较差且蛋白质局部浓度更高，这个过程也被叫做分子老化[20] [21] [22]。这种淀粉样纤维与多种神经退行性疾病的病理过程相关，如ALS [23]和FTD [21]等。因此，揭示这类蛋白的相变基本机制对于治疗相关疾病的药物开发也是至关重要的。
Figure 1. Structural-functional sequence of the fusion protein FUS in sarcoma
图1. 融合肉瘤蛋白FUS的结构功能序列
本文主要采用光学倒置显微镜技术研究了影响FUS蛋白发生LLPS和形成病理性聚集体的因素。由于FUS蛋白在生理条件下即可发生LLPS，并且在一定条件下转化为病理性的聚集体，所以我们通过改变FUS自身的浓度来观察其相变的情况，以此了解FUS的相变对其自身浓度的依赖性。另外，我们使用了细胞中最常见的两种无机盐KCl和NaCl来调节这个过程，研究了盐浓度对FUS相变的影响。希望能为蛋白质聚集相关疾病的治疗研究提供进一步的理论指导。
2. 实验材料和方法
2.1. 实验材料
pCS-6xHis/MBP/TEV/hFUS质粒是购买自云舟生物科技有限公司(载体ID：VB220411-1068rbs)。大肠杆菌(E.ColiDH5α BL21)大肠杆菌、氯化钾、氯化钠购买自上海生物工程股份有限公司。超滤管购买自Sigma-Aldrich公司(UFC9050)。
2.2. 实验方法
2.2.1. 蛋白表达
1) 将FUS质粒转染进大肠杆菌BL21后涂板到带氨苄西林(Amp)抗性的琼脂糖平板上37℃倒置培养12 h。
2) 挑取转化有质粒的单菌落接种到5 mL选择性2YT培养基中37℃、220 rpm培养，菌液浑浊后转移到400 mL选择性2YT中继续培养至OD600 = 0.6~0.8。加入0.5 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌大量表达目的蛋白，继续培养3.5 h后使用离心机收集菌体。
3) 取出收集好的菌体悬浮在细胞裂解液中超声裂解7分钟，取出菌液置于冷冻离心机中4℃、12,000 rpm离心40分钟。
4) 将分离后的上清液转移至新的试管中，加入Ni-NTA树脂放置于4℃冰箱旋转孵育1 h，使目的蛋白充分结合在Ni柱上。
5) 通过不同咪唑浓度的洗脱液将结合在Ni柱上的目的蛋白洗脱下来，如图2为所表达蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳结果。
6) 接着将50 mM和100 mM咪唑洗脱下来的蛋白转移至大小为50 kDa的超滤离心管中，放入冷冻离心机4℃，3000 rpm离心。在超滤到剩下约1 mL的原液时，加入10 mL的50 mM的Tris-HCl (pH = 7.4)缓冲液继续进行超滤。在超滤管中剩下约1 mL左右蛋白溶液时继续加入10 mL的缓冲液离心至1 mL，重复该步骤5次以达到更换缓冲液和浓缩蛋白的目的。
7) 离心好的蛋白转移至灭好菌的干净离心管中，接着使用微量紫外分光光度计测量我们可以得到蛋白质的吸光度A，然后利用比尔–朗伯定律我们可以得到蛋白质浓度的大小：
(1)
其中，c是蛋白质浓度，单位是mol/L；L是光程长度；而ε表示蛋白的消光系数。
需要说明的是因为FUS蛋白是非常容易自缔合的蛋白质，为了防止其在表达过程中形成包涵体所以在其序列前添加了麦芽糖结合蛋白(MBP)。MBP有强大的促溶能力，因此常常被用作可溶性标签与一些溶解度较低的蛋白共表达(注意，单独的MBP蛋白在本文所使用的蛋白浓度下并不会发生LLPS情况)。并且为了后续实验的需要我们利用PCR技术在FUS蛋白的N端和C端分别添加了DogTag和SpyTag作为连接标签，经过检验DogTag和SpyTag并不会影响FUS的相分离情况。所以本文所使用的FUS蛋白一律指添加标签后的蛋白MBP-DogTag-FUS-SpyTag，分子量约为100 kDa。
Figure 2. SDS-PAGE gel electrophoresis results of FUS protein
图2. FUS蛋白SDS-PAGE凝胶电泳结果
2.2.2. 样品槽的制作
为了提高玻璃表面的疏水性避免LLPS形成的液滴塌缩在玻璃表面，我们在玻片表面修饰了一层聚乙二醇 (PEG)分子对表面进行了“钝化”处理。PEG表面有较强的抗蛋白吸附功能，因此可以有效地防止蛋白LLPS后形成的液滴黏附在玻璃表面。同时为了降低在实验过程中溶液的蒸发带来的实验误差，我们专门制作了可封闭的样品槽(如图3所示)，制作流程如下：
1) 将玻片按“Z字形”放置聚丙乙烯瓶中，纯水冲洗3~5次后加水放置于超声波仪器中超声清洗5 min。
2) 倒掉纯水用甲醇冲洗2~3次，继续加入甲醇超声5 min。然后取出用流体水将甲醇溶液冲洗掉。
3) 加入1 M KOH超声20 min，继续用水冲洗3~5次。然后使用无水甲醇多次冲洗，尽可能地去除系统中的水。
4) 将3 mL硅烷加入30 mL丙酮中混合均匀，将混合溶液加入瓶中并没过玻片，静置培养15 min，接着超声1 min，再静置培养15 min后倒掉溶液。
5) 清水冲洗数遍后取出玻片，用氮气将玻片全部吹干。
6) 将PEG (4000 K)溶解于0.1 mol/L NaHCO3，使用移液枪将PEG溶液转移至玻片表面，盖上另一块盖玻片形成一个“三明治”结构。常温下避光培养12小时。
7) 过夜培养后取出“三明治”标记好修饰面，接着用纯水冲洗3~5遍后氮气吹干即可。
8) 取10 μL枪头用剪刀截取头部约3毫米的长度，尽可能使截断面更光滑。
9) 将修饰好的玻片取出放置于洁净的操作台上，将截取好的枪头用环氧树脂固定在玻璃表面，形成一个空心圆台状的样品槽。
Figure 3. Schematic diagram of the preparation and experimental steps of the co-isolation sample slot
图3. 相分离样品槽的制作和实验步骤示意图
2.2.3. 光学显微镜成像观察
在蛋白样品和样品槽制作完成后，可以使用缓冲液将蛋白和盐浓度配至所需终浓度进行上机实验观察相分离情况。本文所使用缓冲液均为50 mM Tris-HCl pH = 7.4，具体步骤如下(图3)：
1) 准备好已灭菌的离心管进行编号标记，不同编号表示不同的盐浓度，取不同的体积的蛋白质溶液与缓冲液/盐溶液按所需终浓度加入离心管，使用移液枪吹打使其充分混合。
2) 立即用移液枪吸取所需混合液从实验装置的上方将溶液注入自制的样品槽，并开启计时器开始计时。
3) 利用配置了100X油镜的倒置光学显微镜进行观察，同时用配套的CCD相机及时记录各个样品图像。
4) 首次记录完一个样品的成像情况后，使用环氧树脂将样品槽上方的开口进行密封以便观察样品随时间的变化情况。
5) 重复2) 3) 4)步骤，对不同盐浓度的实验现象进行记录。
在使用油浸物镜的时需要注意的是，使用前后我们都需使用无水乙醇将物镜擦拭干净，以保证物镜的清洁。观察样品前我们需要提前将香柏油滴在物镜上并适当调焦使物镜与载玻片完美贴合在一起。
3. 实验结果
3.1. 不同浓度FUS的相分离现象
使用光学显微镜观察是检测蛋白质是否发生LLPS的最直观方法。我们发现单独的FUS蛋白在低浓度下溶液呈澄清状态，通过光学倒置显微镜观察可看到此时FUS并没有发生液液相分离而是处于均匀的分散相。增加蛋白浓度约到15 µM~30 µM浓度时溶液变得浑浊，并且通过显微镜可以看到FUS发生了LLPS，在视野中形成规则且会互相融合的液滴。但是当蛋白浓度继续升高至约在80 µM时，FUS却形成了形如蛋白样纤维的不规则聚集体，如图4。
Figure 4. Imaging of FUS protein at different concentrations under an optical inverted microscope, scale bar is 10 μm
图4. 不同浓度的FUS蛋白在光学倒置显微镜下的成像，比例尺为10 μm
3.2. 盐浓度对FUS相分离的影响
无机盐作为细胞中常见的生物分子对于维持细胞渗透压和电解质平衡以及细胞内的信号传导至关重要，并且部分盐还会影响蛋白质的构象和稳定性。于是我们研究了常见的KCl和NaCl盐溶液对FUS蛋白的相分离现象的影响。我们选择了四个梯度盐浓度对FUS的相分离进行调控：无盐(0 mM)、低盐(25 mM)、中盐(250 mM)和高盐(1000 mM)，结果发现FUS的相分离都受到KCl和NaCl浓度的显著影响。
Figure 5. Optical inverted microscope imaging of FUS protein at different KCl concentrations over time; Protein concentration is 30 μM, and the scale bar is 10 μm
图5. 不同KCl浓度下FUS蛋白随时间变化的光学倒置显微镜成像；蛋白浓度为30 μM，比例尺为10 μm
图5展示了FUS蛋白在不同KCl浓度下随时间变化的显微镜成像。结果表明，在无盐和低盐的条件下FUS蛋白都可以发生LLPS形成规则的液滴，并且低浓度的KCl对于FUS蛋白的LLPS影响较小。但是在中浓度和高浓度的KCl作用下，FUS蛋白直接形成了不规则的聚集体，这个过程的发生是非常迅速的。这些不规则聚集体在溶液中不断的热运动会碰撞到一起，部分在碰撞后会分开，部分则在碰撞后黏附在一起形成更大了的聚集体。如图6所示为利用倒置显微镜拍摄的FUS蛋白在不同NaCl浓度下随时间变化的相变过程。与KCl溶液中的测量结果类似，在没有NaCl和低浓度的NaCl的条件下FUS蛋白经历LLPS分离成蛋白质稀缺的分散相和富含蛋白质的浓缩相(液滴)，但是在中浓度和高浓度的NaCl溶液中，FUS蛋白同样迅速形成不规则的聚集体。
Figure 6. Optical inverted microscope imaging of FUS protein at different KCl concentrations over time; The protein concentration is 30 μM, and the scale bar is 10 μm
图6. 不同KCl浓度下FUS蛋白随时间变化的光学倒置显微镜成像；蛋白浓度为30 μM，比例尺为10 μm
3.3. FUS蛋白LLPS随时间的变化
Figure 7. The diameter size change over time of liquid droplets formed by FUS protein under salt-free and low salt concentrations
图7. FUS蛋白在无盐和低盐浓度下LLPS形成液滴的直径大小随时间的变化
利用光学倒置显微镜我们观察到，不同浓度的KCl和NaCl浓度对FUS的LLPS和形成病理性的聚集体的影响相似，结果均为在低盐浓度下FUS蛋白依然可以发生LLPS，但是中、高盐浓度会直接导致FUS形成病理性的聚合物。在FUS蛋白发生LLPS的过程中可以观察到随着时间的推移这些液滴开始不断融合，液滴尺寸慢慢变大。我们统计了三次测量中不同盐浓度下FUS液滴直径大小的变化，每个点来自不少于300个液滴直径大小的平均值(图7)。可以看出虽然在无盐和低盐条件下液滴都会随时间变大，但是KCl和NaCl对于液滴变化的影响效果略有不同，液滴在不同溶液中随时间变大的生长效率大致为：无盐 > KCl > NaCl。
3.4. 讨论
蛋白质–蛋白质间相互作用是蛋白质是否发生LLPS的关键因素，包括静电相互作用、疏水相互作用、π-π相互作用以及阳离子-π相互作用等[24]。同理在FUS蛋白发生相分离的过程中随着蛋白浓度的增加，FUS蛋白间的相互作用增强从而分离成富含蛋白分子的浓缩相液滴以及含低浓度蛋白的分散相。而蛋白浓度继续增加导致蛋白间相互作用更强更复杂，从而形成病理性的不可溶聚集体。
对FUS相变中对分子相互作用性质的分析表明，在没有电荷屏蔽的低盐情况下，LLPS是由静电和疏水相互作用共同驱动的；而在高盐浓度下，LLPS过程主要是由疏水和非离子相互作用驱动的，并且此时疏水相互作用显著增强[25]。因此，低盐的加入会增加蛋白质间的相互作用，所以在FUS的相分离中液滴在低浓度的KCl和NaCl中的融合性比在没有盐的条件下差，导致液滴生长较慢。此外，FUS的病理性淀粉样纤维聚集体的结构主要为β-片层，而β-片层结构主要是由氢键和疏水相互作用稳定的。我们认为，盐浓度的升高直接改变了蛋白分子间复杂相互作用的主导地位。所以在中、高盐浓度下蛋白间的疏水效应增强，导致在无盐和低盐条件下可以通过LLPS形成规则液滴的FUS蛋白在中、高盐条件下形成了病理性的不规则聚合物。
4. 结论
近年来，细胞内无膜细胞器的产生是由于生物大分子LLPS形成的观点引起了很多人的关注。关于LLPS模型蛋白FUS的研究也层出不穷，并且由于在ALS、FTD等疾病的患者细胞中检测出FUS蛋白的病理性沉淀，这种病理的沉淀也被认为是导致这类神经退行性疾病的关键因素之一。因而了解导致FUS蛋白发生LLPS的条件与形成病理性聚集的因素也成为了大家迫切想要了解的问题。在这里，我们利用光学倒置显微镜探究了影响FUS蛋白发生LLPS和病理性聚集的因素，我们发现这个过程是蛋白浓度依赖的，并且受到盐浓度的显著影响。在FUS蛋白发生生理性的LLPS的条件下，无盐和低盐对其影响较小，但是中浓度和高浓度的盐可以直接将其转化为病理性的聚集体。在无盐和低盐溶液中FUS蛋白LLPS形成的液滴随时间的变化不断碰撞融合形成尺寸更大的液滴，其中液滴融合的效率为：无盐 > KCl > NaCl。
基金项目
浙江省自然科学基金面上项目(Y23A040004)；浙江省高等教育“十四五”教学改革项目(jg20220509)；浙江省研究生教育学会科研项目(2023-016)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。