基于网络药理学探索土茯苓治疗下肢动脉硬化闭塞症的作用机制

Mechanism of Smilax glabra Rhizoma in Treatment of Arteriosclerosis Obliterans of Lower Extremities Based on Network Pharmacology

摘要: 目的：基于网络药理学分析土茯苓治疗下肢动脉硬化闭塞症的作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库分析平台(The Traditional Chinese Medicine Database Analysis Platform, TCMSP)获取土茯苓的主要活性成分。以TCMSP预测的活性成分为基础，通过UniProt数据库转换获取作用靶点；从GeneCards、OMIM、TTD、DisGeNET以及DrugBank数据库检索获得ASO相关疾病靶点；取交集获得土茯苓与ASO的共同靶点；STRING数据库对共同靶点进行蛋白–蛋白相互作用(Protein-Protein Interaction Network, PPI)分析、Cytoscape 3.9.1软件构建PPI网络；采用Metascape平台对核心靶点进行GO富集分析与KEGG信号通路富集分析，并利用微生信在线绘图平台进行可视化处理。结果：从土茯苓中筛选得到15种活性成分及194个作用靶点，与相关靶点取交集，得到124个共同靶点；土茯苓治疗的有效活性成分有β-谷甾醇、柚皮素、豆甾醇、花旗松素、槲皮素、薯蓣皂素、新落新妇苷等。糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化、TNF信号通路等通路可能为下肢动脉硬化闭塞症的潜在核心信号通路。结论：土茯苓治疗ASO具有多成分、多靶点、多通路的特点，这为其后续实验和临床研究提供了理论基础。

Abstract: Objective: To analyze the mechanism of action of Smilax glabra rhizoma in the treatment of lower limb atherosclerosis-occlusive disease based on network pharmacology. Methods: The main active ingredients of Smilax glabra rhizoma were obtained from the Traditional Chinese Medicine Database Analysis Platform (TCMSP). The active ingredients predicted by TCMSP were used as the basis to obtain the active targets through UniProt database conversion. ASO-related disease targets were retrieved from GeneCards, OMIM, TTD, DisGeNET and DrugBank databases. The common targets of Smilax glabra and ASO were obtained by intersection. STRING database was used to analyze the protein-protein interaction net-work (PPI) of common targets. The PPI network was constructed using Cytoscape 3.9.1 software; the core targets were enriched with GO and KEGG signaling pathways using the Metascape platform and visualized using the Microbiology online mapping platform. The results Results: 15 active ingredients and 194 targets were screened from Smilax glabra rhizoma and intersected with related targets to obtain 124 common targets; the active ingredients of Smilax glabra rhizoma were β-sitosterol, naringenin, dousterol, daidzein, quercetin, diosgenin and neolaxoside. The AGE-RAGE signaling pathway, lipid and atherosclerosis, and TNF signaling pathway in diabetic complications may be potential core signaling pathways in lower limb atherosclerotic occlusive disease. Conclusion: The multi-component, multi-target, and multi-pathway characteristics of fucoidan in the treatment of ASO provide a theoretical basis for its subsequent experimental and clinical studies.

1. 引言

下肢动脉硬化闭塞症(ASO)是以动脉粥样病变导致斑块甚至继发性血栓形成，引起大、中动脉血管发生狭窄或闭塞。发病机制目前有多种学说与猜想但尚未阐明。根据流行病学调查发现，本病发病随年龄增加而提高，世界有超过2亿患者，患病率呈逐年上升趋势，60岁以上患病可达10%以上，65岁以上患病可达20% [1] 。下肢动脉硬化闭塞症属于中医范畴“脉痹”、“脱疽”一类疾病。《素问·痹论》曰：“风寒湿三气杂至，合而为痹也”。下肢动脉硬化闭塞症发病机制虽未得到完全阐明，但血液高凝状态是公认的发病危险因素；有研究表明痰湿积聚会导致血液高凝状态出现 [2] ，及时针对“湿”进行治疗有助于血液高凝状态改善，临床常选用土茯苓作为治疗药物。土茯苓为百合科菝葜属植物光叶菝葜的干燥根茎，收载于2020年版《中国药典》，其味甘、淡，性平，归肝、肾经。具有解毒、除湿、通利关节的功效。清代汪昂《本草备要》 [3] 记载其：“健脾胃，祛风湿；利小便，止泻泄；治胫骨拘挛，杨梅疮毒，瘰疬疮肿”。应用土茯苓治疗下肢动脉硬化闭塞症符合中医治病求本，辩证论治的思想；其通过分清浊 [4] 的功效，健脾祛湿，改善人体痰湿状态，无湿邪阻遏，气血自然畅通，瘀堵无从发生。从而达到对下肢动脉硬化的治疗效果。土茯苓治疗ASO在中医理论中有较为丰富的理论，但在现代药理学中机制尚未阐述清楚。

本文旨在通过对土茯苓有效成分及下肢动脉硬化闭塞症相关靶点的筛选分析，预测其作用靶点及信号通路，为下肢动脉硬化闭塞症的治疗研究及实验探索拓展思路。

2. 资料与方法

2.1. “土茯苓”化学成分查询与筛选

TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)挖掘，检索标准设定为口服利用度(OB) ≥ 30%、类药性(DL) ≥ 0.18，筛选土茯苓的潜在有效成分，并检索文献补充。通过输入中药的名称，筛选得到有效药物成分所对应的靶点。通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)进行靶点蛋白–人类基因名称转换，从而得到中药土茯苓的作用靶点。

2.2. 下肢动脉硬化闭塞症靶点获取

以“arterial occlusive”为关键词，在GeneCards数据库、OMIM数据库、TTD数据库、DisGeNET数据库以及DrugBank数据库中检索，获得疾病相关靶点。将各个数据库所得到的的靶点信息导入Cytoscape3.9.1软件，并用VENNY2.1平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)构建疾病相关基因合并的venn图。再将土茯苓成分作用靶点和下肢动脉硬化闭塞症相关的疾病靶点利用VENNY2.1平台进行映射构建venn图，筛选出中药–疾病的共同靶点。

2.3. 活性化合物–靶点–疾病网络构建

为明确土茯苓药物相关靶点与下肢动脉硬化闭塞症疾病靶点间的相互作用，利用R语言将两者靶点取交集绘制韦恩图。将交集靶点上传至STRING11.5数据库构建蛋白互作网络模型，并通过Cytoscape3.9.1软件进行可视化分析。通过Cytohubba插件进行分析，筛选出关键靶点并进行可视化处理。

2.4. GO功能富集分析与KEGG通路分析

利用Metascape在线分析平台(https://metascape.org/)对基因本体(Gene Ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes, KEGG)进行富集分析，并将得到的结果通过微生信(https://www.bioinformatics.com.cn/)在线工具进行可视化处理。

3. 结果与分析

3.1. 土茯苓活性成分筛选

Table 1. Effective active ingredients of Smilax glabra rhizoma

表1. 土茯苓有效活性成分

在TCMSP数据库中检索土茯苓，以OB (口服利用度) ≥ 30%、DL (类药性) ≥ 0.18为筛选条件，共得到15种化合物，包括beta-sitosterol (β-谷甾醇)、Naringenin (柚皮素)、Stigmasterol (豆甾醇)、Taxifolin (花旗松素)、Quercetin (槲皮素)、Diosgenin (薯蓣皂素)、Neoastilbin (新落新妇苷)等，详见表1。

3.2. 土茯苓活性成分靶点与下肢动脉硬化闭塞症靶点的筛选

Figure 1. Intersection target diagram

图1. 交集靶点图

在TCMSP数据库中检索2.1部分得到的土茯苓有效化合物对应的靶蛋白，并通过Uniport数据库中选择物种为人类、已验证基因，对筛选的靶蛋白进行名称校正。共得到土茯苓有效成分潜在靶点194个。以“Arterial Occlusive”为关键词，在GeneCards数据库、OMIM数据库、TTD数据库、DisGeNET数据库以及DrugBank数据库中检索，将所得基因靶点导入VENNY2.1平台绘制韦恩图，去重后获得下肢动脉硬化闭塞症靶点1802个。取两者交集，并利用VENNY2.1平台将结果可视化，得到土茯苓与下肢动脉硬化闭塞症存在的交集靶点124个，见图1。

3.3. “土茯苓”活性成分–靶点–下肢动脉硬化闭塞症网络构建

将124个药物–疾病共同靶点导入STRING11.5在线数据库，设置使用默认参数，得到靶点蛋白124个。将获得结果导入Cytoscape3.9.1软件绘制出药物–成分–靶点–疾病网络图。利用CytuHubba插件根据Degree值筛选出土茯苓治疗下肢动脉硬化闭塞症排名前20的核心靶蛋白，190条相互作用关系，并进行可视化处理，见图2。在PPI网络中，排名靠前的核心靶点包括TNF、IL6、VEGFA、AKT1、CASP3等，提示这些靶点在治疗过程中发挥着关键作用，是调控网络中连接其他节点的核心，见图3。

Figure 2. Intersection target network diagram

图2. 交集靶点PPI网络图

Figure 3. “Smilax glabra rhizome”-target-disease network diagram

图3. “土茯苓”–靶点–疾病–网络图

3.4. GO功能富集分析与KEGG通路分析

根据PPI核心靶点的分析结果，将20个核心靶点蛋白导入Metascape在线分析平台，结果显示土茯苓治疗下肢动脉硬化闭塞症共涉及1744个生物学过程(Biological Processes, BP)，21种细胞组分(Cellular Components, CC)以及62种分子功能(Molecular Functions, MF)。BP中主要涉及对脂多糖的反应、细菌源性分子的反应、细胞对生物刺激的反应、细胞对脂多糖的反应、白细胞迁移的调节、细胞对化学应激的反应、调控平滑肌细胞的增殖、对平滑肌细胞增殖的正向调节、细胞粘附的调节、氧化应激的反应、调节一氧化氮的生物合成等生物过程进行调控。CC中主要涉及膜筏、膜微域、膜区、血小板α颗粒、浆膜筏、含胶原蛋白的细胞外基质、分泌颗粒管腔、囊泡腔、质膜外等细胞组分进行调控。MF主要涉及细胞因子受体的结合、细胞因子活性、受体配体活性、生长因子受体结合、蛋白酶结合、生长因子活性、蛋白磷酸酶2A的结合等分子功能的调节(图4)。

Figure 4. GO enrichment analysis of core targets

图4. 核心靶点GO富集分析

将上述20个核心靶蛋白导入Metascape平台进行KEGG通路富集分析，得到的结果显示土茯苓治疗乳腺癌共涉及139条通路。富集潜在靶基因较多的通路包括：糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、TNF信号通路、IL-17信号通路、脂质和动脉粥样硬化、人类巨细胞病毒感染、甲型流感、类风湿性关节炎、HIF-1信号通路。提示土茯苓可能通过以上通路发挥对下肢动脉硬化闭塞症的治疗效果(图5)。

使用微生信平台将GO分析与KEGG分析结果进行可视化处理，按富集基因数量和P值排序，选前10个绘制成柱状图和气泡图。气泡图中气泡大小代表富集基因数的多少，P值变化由气泡颜色演示。

Figure 5. KEGG enrichment analysis of core targets

图5. 核心靶点KEGG富集分析

4. 讨论

下肢动脉硬化闭塞症是一种累及下肢动脉的动脉粥样硬化导致动脉狭窄或闭塞的慢性疾病。其发病率随着年龄的增长而持续增加，全球约有2.02亿人受到不同程度的影响 [5] [6] [7] 。尽管提出了脂质浸润、动脉内膜损伤和慢性炎症的理论，但下肢动脉硬化闭塞症发病的分子机制仍不清楚。网络药理学是一门综合运用生物信息学知识的学科，其核心在于通过系统性分析疾病、蛋白质靶点以及药物相互作用网络，以揭示其复杂的关联和作用机制。该学科广泛应用于预测中医药治疗相关疾病的机制，为中药复方及单体的研究提供了有效的推动力 [8] [9] 。本研究旨在通过采用网络药理学分析方法，深入探讨土茯苓在治疗下肢动脉硬化闭塞症过程中的核心机制。

本项研究最终获得土茯苓治疗下肢动脉硬化闭塞症的潜在有效活性成分15种，核心成分前五个分别是槲皮素、花旗松素、谷甾醇、落新妇苷与异黄杞苷。现代药理学发现，土茯苓中存在着大量黄酮类化合物 [10] ，如：槲皮素、落新妇苷与异黄杞苷、花旗松素、新落新妇苷等。槲皮素作为一种天然黄酮类化合物，具有显著的抗炎作用 [11] 。其已被证实能够减轻非酒精性脂肪肝大鼠肝组织中的脂肪变性和炎症，进而保护肝功能 [12] 。此外，槲皮素还表现出通过抑制炎症而降低血脂水平的效果，从而发挥抗动脉粥样硬化的作用 [13] 。SDF-1/CXCR4信号通路在生理过程中扮演着重要的调控角色，涉及炎症、血管内皮细胞增殖、迁移、黏附以及分化等多方面的生理活动，其在动脉粥样硬化的形成和进展中具有关键的功能 [14] 。刘玄林等 [15] 人研究发现，槲皮素可激活SDF-1/CXCR4信号，抑制炎症，改善血脂代谢，减轻下肢动脉硬化闭塞症模型大鼠动脉血管组织损伤，保护血管内皮功能。落新妇苷是从落新妇的根茎中提取出的一种天然类黄酮化合物。由于其表现出抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理活性，因此在医学领域得到广泛应用 [16] 。有研究表明落新妇苷具有保护心血管 [17] ，Motoyashiki T等发现落新妇苷可提高大鼠脂蛋白酶活性，促进脂肪垫溶解 [18] 。结合前述研究成果，可以说明本研究中筛选出的活性成分具备多方面的药理作用，包括抗炎、改善血脂代谢、保护血管内皮功能以及促进脂肪垫溶解等。这些作用协同发挥，有望在治疗下肢动脉硬化闭塞症方面发挥综合效果。因此，本研究的结果提示，在后续土茯苓等治疗下肢动脉硬化闭塞症的现代化制剂研发中，应当最大限度地保留这些有效的活性成分，以实现更好的治疗效果。

进一步研究发现土茯苓治疗下肢动脉硬化闭塞症存在的潜在靶点共124个，富集程度较高的信号通路共139条。核心靶点分析显示，AKT1、TNF、IL6、CASP3、VEGFA、CASP3为核心靶蛋白，且与其他多个蛋白发生相互作用。AKT1是一种蛋白激酶，与平滑肌增殖、迁移调控有关，有研究表明强化小鼠AKT1的表达可减低B细胞、单核细胞表达，降低其体内巨噬细胞活性，减少动脉粥样硬化发生 [19] 。IL6由血管内皮分泌，动脉粥样硬化动物血管内膜中IL6水平升高 [20] ，IL6可诱导血管内皮慢性炎症发生，并与TNF共同促进炎症反应、血管内皮细胞损伤，加快动脉粥样硬化程度进展 [21] [22] 。VEGFA是影响血管功能的重要因子，在动脉粥样硬化的病程中，它具有双重调控作用，既可以提高抗凋亡蛋白表达水平和促进NO的合成来保护内皮细胞，又可以通过再内皮化修复受损内皮细胞，并预防动脉粥样硬化诱导的内皮损伤 [23] 。CASP3是一种介导细胞凋亡的蛋白酶，在心衰或心梗实验动物体内可见CASP3水平升高 [24] [25] ，推测其通过调控细胞凋亡水平参与血管内皮损伤过程，进而导致动脉粥样硬化发生几率上升。

KEGG富集分析表明，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化、TNF信号通路等通路可能为下肢动脉硬化闭塞症的潜在核心信号通路。脂质和动脉粥样硬化通路的发生与发展可能受到多个信号通路的调控，其中包括Toll样受体信号通路、P53信号通路、TNF信号通路以及NOD样受体信号通路。Toll样受体是模式识别受体(PRRs)家族中最为显著的成员之一，在炎症介质的转导和促炎细胞因子的释放中扮演核心角色。对于动脉粥样硬化的发生和进展而言，Toll样受体的激活与炎症调节密切相关 [26] [27] 。NOD样受体中的NLRP3炎症小体是一种天然免疫信号复合物，是动脉粥样硬化中IL-1家族细胞因子产生的关键介体。IL-1β以及其他IL-1家族的细胞因子在血管和全身炎症介质中具有重要作用，被认为是动脉粥样硬化发生的一个原因 [28] [29] 。这些信号通路的相互作用可能在脂质代谢和动脉粥样硬化的病理生理过程中发挥关键的调控作用。糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路涉及晚期糖基化终产物(AGEs)，这是晚期糖基化的最终生成物。AGEs被确认为血管疾病发病机制和进展的关键病因。正常情况下，晚期糖基化终产物受体(RAGE)在人体内的表达量较低，但在炎症、糖尿病等病变发生时，其表达量显著增加 [30] 。AGEs通过在细胞外基质基底膜中的分子之间建立交联，以及与RAGE受体的相互作用，引发了一系列微血管和大血管问题 [31] 。AGEs激活RAGE时，增加氧化应激，引发炎症和纤维化反应。研究表明，当抑制AGE-RAGE通路中AGE受体的表达时，小鼠显示出动脉斑块减少的迹象 [32] 。这突显了AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的关键作用，尤其是在动脉斑块形成方面。肿瘤坏死因子(TNF)信号通路在宿主防御中扮演着至关重要的角色，对于各种损伤和刺激都能迅速释放。TNF-α在激活内皮细胞和上调粘附分子方面具有重要的生物学功能 [33] 。其在病变中对不同细胞类型的多方面作用，如粘附分子表达和泡沫细胞形成等，也是不可忽视的。通过阻断TNF-α，使用TNF结合蛋白或使用IL-1受体拮抗剂以阻断IL-1，可以在一定程度上保护apoE敲除小鼠免受动脉粥样硬化的不良影响。此外，TNF-α能有效上调低密度脂蛋白在内皮细胞上的细胞转运，并促进低密度脂蛋白在血管壁的滞留，由此加速动脉粥样硬化的发生和发展 [34] 。上述结果表明，土茯苓有效成分作用于糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化和TNF信号通路，主要通过抑制炎症反应、氧化应激反应、抗凝、调控细胞凋亡和细胞增殖等干预下肢动脉硬化闭塞症的疾病进程。

综上所述，本次研究运用网络药理学方法探索土茯苓治疗下肢动脉硬化闭塞症的潜在机制，较为全面的阐述了靶点、成分、通路间的相互作用关系，为更进一步开展土茯苓治疗下肢动脉硬化闭塞症的实验研究及临床应用提供了理论依据。

NOTES

^*通讯作者。