1. 引言
红树林线虫在红树林底栖生态系统中具有重要作用 [1] ，国内对海洋线虫的研究集中在其多样性的调查，调查地点涉及国内多个海域 [2] [3] 。目前，对海洋线虫的研究不再局限于野外调查，对于海洋线虫本身特性也展开了深入研究，并取得了非常大的进步，加强了海洋线虫在各项研究中的指标规范 [4] 。随着研究的日益深入，在研究海洋线虫群落对环境的影响的基础上，从线虫个体出发，以点概面，从微观到宏观对整个环境进行研究。
海洋线虫的生活周期短、繁殖力强、种群密度高，且广泛分布于海洋底栖环境不同的营养级中，对环境污染具有较高的耐受力，对环境变化非常敏感，能够带生态环境的变化做出快速反应 [5] ，在实验室成功培养是进行各种研究的基础，海洋线虫室内培养已有先例，但东寨港红树林线虫的室内培养还没有报道。
2. 材料和方法
2.1. 实验材料
① 试剂：分析纯氯化钠、玉米粉、琼脂粉(国药集团)。
② 仪器：电子天平(上海天美FA3204B)、解剖镜(奥林巴斯SZX7)、倒置显微镜(DP-F80)。
2.2. 试验方法
2.2.1. 采样、分离及培养
于2018年3月在东寨港红树林泥底进行取样(图1)。利用淘洗法对线虫Viscosia heterolaima sp进行分离，玉米培养基培养30 d，转移到新的培养基中进行连续培养，培养半年后进行线虫生活史的观察及后期实验。
2.2.2. 胚胎发育观察
将怀卵成虫置于大小厚度适宜的微培养基中，置于倒置显微镜观察，拍照。在显微镜下用无菌水麻醉剖腹取卵，并记录胚胎发育的各个时期。
2.2.3. 胚后发育实验
将刚孵化的线虫Viscosia heterolaima sp转移至新的微培养基，每隔1 d观察并拍照，记录线虫的体长，直至发育为成虫，并开始产卵。
2.2.4. 培养温度的测定
在20 ml培养基加入选取成熟期线虫20条，设置15、20、25、32、35℃培养，每个处理设置三个重复，每天观察和统计线虫数量，培养期间补充适量培养基和无菌生境过滤海水，保持培养液在20 ml。
2.2.5. 培养盐度的研究
配置5，10，20，30，40‰的NaCl玉米培养基，测定线虫的最适培养盐度(方法同2.2.4)。
2.2.6. 数据分析
数据分析采用软件Excel 2007和SPSS 23.0进行，Origin 7.0图绘制。
3. 结果与分析
3.1. 红树林线虫胚胎发育过程
实验中观察的线虫Viscosia heterolaima sp卵均正常孵化。1细胞期，线虫Viscosia heterolaima sp卵黄居于卵中间，卵的平均直径为43 ± 2.1 μm (图2(a))，1细胞140 min后，第一次卵裂形成两个均等的卵裂球(图2(b))，240 min第二次分裂，形成大小均等的4细胞期(图2(c))，350 min卵裂球进行不规则分裂，进入多细胞期(图2(d))，700 min胚胎继续分裂进入囊胚期(图2(e))，1180 min囊胚表面细胞内陷，形成凹痕，细胞继续分裂，进入原肠胚(图2(f))，而后进入原肠后期(图2(g))，胚胎继续伸长，1750 min后胚胎进入蠕虫形胚(图2(h))，肌细胞形成，具备了运动能力，在显微镜下可清晰看到蠕虫在卵膜内来回扭动，直至孵化，发育中卵的颜色从单细胞阶段的棕褐色变为蠕虫阶段的浅褐色。胚胎在各个分裂期居于不同位置(胚胎发育平均持续时间见图3)，整个胚胎发育平均时间为60.33 hr~64.22 hr，平均为62.67 ± 1.28 hr。胚胎发育各期持续时间见图3，胚胎各期发育持续时间如下：1细胞期146.71 ± 7.48 min；2细胞期100.00 ± 6.80 min；4细胞期112.71 ± 8.17 min；多细胞期353.43 ± 9.47 min；囊胚期481.14 ± 9.92 min；原肠胚期574.71 ± 9.76 min；蠕虫期1991.71 ± 22.78 min。
Figure 2. Embryo development at different stages of Viscosia heterolaima sp
图2. 线虫Viscosia heterolaima sp各时期胚胎发育图
Figure 3. Mean embryo development time of Viscosia heterolaima sp (min)
图3. 线虫Viscosia heterolaima sp胚胎发育平均持续时间(min)
3.2. 胚后发育过程
刚孵化的线虫通体透明幼虫，体长528.33 ± 85.86 μm，体长持续增长到23 d，此后停止，生长体长变化见图4，生长曲线见图5，成虫体长为2958.22 ± 143.00 μm，实验室观察到线虫的成熟期为12~18 d，寿命为46 d左右。
Figure 4. Body length at different developmental stages of Viscosia heterolaima sp
图4. 线虫Viscosia heterolaima sp不同发育期体长
Figure 5. Post-embryonic developmental body length of Viscosia heterolaima sp
图5. 线虫胚后发育体长
3.3. 成虫发育过程
如图6可观察到线虫Viscosia heterolaima sp同时具虫卵和交接器，初步判断为雌雄同体。Viscosia heterolaima sp身体细长，呈卷曲状，角质层平滑，最大体宽52~59 μm，其神经环占咽长度的46%，内唇、外唇均为六个，外有刚毛4条，大约4 μm，化学感受器大约7 μm宽。交接器明显，大约20 μm。
Figure 6. Adult morphological characteristics of Viscosia heterolaima sp
图6. 线虫Viscosia heterolaima sp成虫形态特征
3.4. 养温度的测定结果
(Note: a, b, c, and d indicate that the difference between the same letters is not significant, and the difference is significant)
Figure 7. Growth density of nematode populations under different temperature
图7. 不同温度条件下线虫种群生长密度
如图7，不同温度对线虫Viscosia heterolaima sp种群密度产生影响，温度为25℃时，线虫种群密度生长较快，最高达到14.20 N·mL−1，温度为15℃时，种群密度生长平缓，温度为30℃时，种群密度几乎没有变化，而35℃时，线虫全部死亡。对5个温度进行差异显著性分析，结果显示，线虫在各温度适应性为25℃ > 20℃ > 15℃ > 30℃ > 35℃，适宜线虫生长的温度在20℃~25℃，最佳温度为25℃。线虫在温度为15℃时的生长趋势平缓，在温度为30℃时开始生长受到抑制，35℃时对线虫的生长抑制更为明显，甚至导致死亡。
3.5. 培养盐度的测定结果
如图8，线虫Viscosia heterolaima sp的种群密度随着盐度变化，线虫在盐度5‰~40‰均能生长，盐度为20‰时，线虫种群密度生长最快，最高达到11.86 N·mL−1，对5个盐度进行差异显著性分析，结果显示，线虫在各盐度适应性为20‰ > 10‰ > 30‰ > 5‰ > 40‰，适宜线虫生长的盐度在10‰~20‰，最佳盐度为20‰。线虫在盐为5‰和40‰时的生长趋势平缓。
(Note: a, b, c, and d indicate that the difference between the same letters is not significant, and the difference is significant)
Figure 8. Growth density of nematode populations under different salinity
图8. 不同盐度条件下线虫种群生长密度
4. 讨论
4.1. 线虫的实验室培养方法
实验室内成功培养是进行标准化培养和利用线虫进行各种研究的基础，在我国，王诗红 [6] 等利用玉米琼脂培养基开启了我国线虫的培养，到2007年王摆 [7] 等也利用玉米琼脂培养基成功地培养线虫Chromadorina sp，并以该种为模型动物进行环境激素活体筛选研究。线虫的种类多，数量大，在陆地、海洋生态环境系统中广泛存在，关于海洋线虫的培养方法，Moens and Vincx [8] 最早在实验室内利用海水琼脂培养基进行培养，由于培养技术不成熟，海洋线虫利用海水琼脂培养基培养过程中，出现大量的细菌、真菌、动物等污染，大大降低了海洋线虫的培养成活率，随着培养技术的日益成熟，一些学者利用改良的Erdschreiber培养基进行海洋线虫的培养减少了培养基污染 [9] 。
与文章培养海洋线使用的玉米培养基不同，陆地生态系统土壤线虫的培养方法刘志典 [10] 等利用生菜蛋黄培养基、葡萄糖酵母菌培养基及土壤浸出液培养基对土壤线虫进行13 d的培养研究发现，生菜蛋黄培养基更适合在实验室的条件下对土壤线虫进行培养。由于线虫生存的沉积物环境不同，适应的琼脂浓度也不同，本实验所用琼脂浓度为0.7%~0.8%，大多数线虫都容易渗透到该琼脂浓度中，而浓度升高则阻止越来越多的物种渗透和移动，较低的琼脂浓度(0.2%~0.5%)进一步促进了对线虫的移动，但通常存活不能保持超过两周或三周的时间，由于琼脂中的微生物生长，加速了培养基流质化，培养基最后完全变成液体。Singh和Ingole [11] 发现海洋线虫D. normandicum适合在半固态培养基中生存，行动缓慢，但在液态培养基中不停游动，导致成虫死亡率高。线虫的培养方法越来越成熟，为线虫在实验室进行标准化培养提供了基础。
4.2. 线虫生活史
实验室的标准化培养使线虫的生活史得以被观察，实验室研究发现，除了一些体型大行动缓慢的物种，大多数海洋和河口线虫(Enoplidae，Oncholaimidae和Desmodoridae等)都能在几天、几周或几个月内发育并达到性成熟，其繁殖通常是连续的。本研究对线虫Viscosia heterolaima的胚胎及胚后发育时间进行了研究，胚胎发育特征为，l细胞期持续时间相对于2细胞和多细胞长一些，原肠胚相对于囊胚期和蝌蚪形胚期也长一些，整个胚胎发育过程中，卵裂持续进行，细胞数量增加，而体积却变小；到原肠胚后期，胚胎肌肉细胞开始形成并收缩形成蠕虫胚期，在显微镜下可明显观察到虫体在卵壳内蠕动，整个胚胎发育特征与王摆描述的Chromadorina胚胎发育特征相似 [7] ；本研究观察到线虫的卵为椭圆形，卵的平均直径为43 ± 2.1 μm，大于线虫Chromadorina sp卵(28.6 ± 1.0 μm.)，胚胎发育时间也长于线虫Chromadorina sp的胚胎发育。本研究发现线虫Viscosia heterolaimap胚后发育线虫从孵化到23 d停止生长，体长2958.22 ± 143.00 μm，而Diploaimella sp线虫的最短世代时间为16 d，线虫Chromadorina sp最短世代时间为14 d [6] ，这可能是因为线虫Viscosia heterolaima个体相对于Chromadorina sp、Diploaimella sp较大，需要更长的发育时间才能达到成熟。与本实验描述的线虫生长发育时间不同，线虫D. normandicu雌性在培养的第21 d达到性成熟并开始产卵，一次怀卵8~10个，整个胚胎发育在大约72 hr内完成，整个生活史在22~24 d内，刚孵化的幼虫的平均长度为0.189毫米，个体在约21~23 d内达到最大长度(雄性) 1.23 mm和1.04 mm (雌性)，海洋线虫Chromadora macrolaimoides的平均生长时间(22 d)和平均寿命(45 d)；而本实验观察到线虫一次怀卵达到10~14个，胚胎发育时间大约在62 hr完成，刚孵化的线虫长度达到528.33 ± 85.86 μm [11] 。所以不同种的线虫发育时间不尽相同，产卵量也不相同。
4.3. 线虫培养温度的优化
温度是影响河口和海洋线虫生长和繁殖的因素，由于潮汐跟季节更替，海水温度随之变化，海南东寨港红树林湿地属于热带季风气候，全年温度较高，年均气温为17.1℃，其海水表层年平均温度为24.5℃，但也有极端温度的出现，最低为3℃，最高为37.5℃ [12] ，温度变化对栖息生物有影响。本研究结果，在25℃时，线虫的种群密度最高，而35℃时，线虫几乎全部死亡，刘志典 [10] 对土壤线虫进行温度适应性研究发现土壤线虫在20℃和25℃时种群密度的增长明显，15℃时种群密度变化不明显，而在30℃时，土壤线虫的种群密度在不断下降；在合适的温度范围内，随着温度的升高，海洋线虫的生长发育时间缩短，且繁殖力升高；有报道称，线虫丰度在季节上有波动，这可能与环境的季节性变化随之带来的温度变化有关 [13] ，线虫L.arina的发育时间也受到温度的强烈影响 [14] ，所以温度影响线虫的生长、生存，在极端温度可能会导致线虫的死亡。
4.4. 线虫培养盐度的优化
东寨港红树林地质特殊，属于典型的半封闭式泻湖，因为潮汐作用，东寨港北部与琼州海峡相连，水体进行交换，同时，周边的河流汇入也降低了本身的水体盐度；潮汐波动影响，在河口中段和下潮段，盐度变化最大，差值高达8至21，对栖息地生物带来一定影响，本研究发现，线虫Viscosia heterolaima sp对盐度具有较宽的耐受范围，在盐度为5‰~40‰范围内均能存活，能适应较宽的盐度变化，所以，该种能对适应非生物条件(盐度)剧烈波动环境。有研究发现线虫L. marina在较低的盐度下也可以生存 [15] ，但不同盐度对线虫L. marina的生活史也具有影响，这与本研究结果一致，线虫虽然在本实验盐度下都能生存，但不同的盐度对其种群密度也有影响，该种在较低的盐度(5‰)或较高的盐度(40‰)下生长缓慢，在盐度为20‰生长最快，所以，盐度也是影响线虫生长发育重要因素之一。
5. 结论
本文利用玉米培养基成功培养红树林线虫Viscosia heterolaima sp，并观察到线虫的胚胎发育及胚后发育，线虫的胚胎发育从一细胞到蠕虫期的发育持续时间分别为：1细胞期146.71 ± 7.48 min；2细胞期100.00 ± 6.80 min；4细胞期112.71 ± 8.17 min；多细胞期353.43 ± 9.47 min：囊胚期481.14 ± 9.92 min；原肠胚期574.71 ± 9.76 min；蠕虫期1991.71 ± 22.78 min；刚孵化的线虫通体透明，体长528.33 ± 85.86 μm，幼虫体长在23 d左右停止生长，成虫体长为2958.22 ± 143.00 μm，线虫的成熟期为12~18 d，寿命为46 d，在实验室对线虫最适温度和盐度进行研究发现，线虫在温度为25℃，盐度为20‰时种群生长密度最高。