摘要: 目的：胰腺癌(Pancreatic cancer, PC)是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，对患者的生存率造成严重威胁。越来越多的研究表明，糖基化修饰在胰腺癌的发生和发展中扮演着关键角色。O-连接
β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(O-linked N-acetylglucosamine transferase, OGT)是糖基化的关键调节者，其异常表达与多种癌症相关。本研究旨在探究OGT在胰腺癌中的异常表达，并分析其与胰腺癌预后的相关性。方法：回顾性收集2017年1月至2021年1月就诊于青岛大学附属医院确诊胰腺癌且行手术治疗患者的临床及组织病理资料。临床资料包括患者年龄、性别、身体质量指数(Body mass index, BMI)、烟酒史、糖尿病病史、家族史、肿瘤大小、位置、TNM分期、组织浸润及器官转移情况、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA)、糖类抗原19-9 (Carbohydrate antigen19-9, CA19-9)水平等信息。应用免疫组织化学染色的方法检测癌组织及癌旁胰腺导管组织中OGT的表达水平，并根据表达量的高低分为高表达组和低表达组，分析其与患者临床病理特征及预后的关系。结果：1) 胰腺癌组织中OGT的表达水平与癌旁组织的表达水平之间存在显著统计学差异(
P < 0.001)。2) OGT高表达与淋巴结转移、TNM分期有关(
P < 0.05)，与年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒情况、糖尿病病史、家族史、肿瘤大小、位置、CEA、CA19-9等因素无相关性(
P > 0.05)。3) 生存分析表明，OGT的表达水平与患者不良预后存在明显相关性(
P = 0.029)。结论：胰腺癌组织中OGT表达水平明显增加，OGT的高表达与淋巴结转移、TNM分期正相关。胰腺癌中OGT的高表达与胰腺癌患者不良预后相关。
Abstract:
Objective: Pancreatic cancer is a highly aggressive tumor that poses a serious threat to the survival rate of patients. A growing body of research suggests that glycosylation regulation plays a key role in the occurrence and progression of pancreatic cancer. O-linked N-acetylglucosamine transferase (OGT) is a key regulator of glycosylation, and its abnormal expression is associated with various types of cancer. Methods: This study collected the clinical and histopathological data of patients who were diagnosed with pancreatic cancer and underwent surgery in the Affiliated Hospital of Qingdao University from January 2017 to January 2021. Information such as age, gender, Body mass index (BMI), smoking, alcohol consumption, diabetes history, family history, tumor size, location, TNM stage, tissue infiltration and organ metastasis, Carcinoembryonic antigen (CEA) and Carbohydrate antigen19-9 (CA19-9) levels were collected. On this basis, we used immunohistochemical staining to detect the expression levels of OGT in cancer tissues and adjacent normal pancreatic duct tissues, and divided them into high expression group and low expression group according to the expression level, and analyzed their correlation with the clinicopathological characteristics and prognosis of patients. Results: 1) There were statistically significant differences between the expression levels of OGT in pancreatic cancer tissues and those in normal tissues adjacent to the cancer (P < 0.001). 2) High expression of OGT was associated with lymph node metastasis and TNM stage (P < 0.05) and there was no correlation with factors such as age, gender, BMI, smoking, alcohol consumption, history of diabetes mellitus, family history, tumour size, location, CEA, CA19-9, etc. correlation (P > 0.05). 3) Survival analysis showed that there was a significant correlation between the expression levels of OGT and the poor prognosis of patients (P = 0.029). Conclusions: The expression levels of OGT were significantly increased in pancreatic cancer tissues. The high expression of OGT was positively correlated with lymph node metastasis and TNM stage. Meanwhile, high expression of OGT was associated with poor prognosis of pancreatic cancer patients.
1. 引言
胰腺癌(Pancreatic cancer, PC)是一种具有高度侵袭性和恶性程度的肿瘤，其发病率逐年上升，成为威胁人类健康的重要疾病之一。有研究表明，胰腺癌相关的死亡率将成为主要死因中的第三位 [1] 。PC患者的中位生存期仅为6~10个月，大多数诊断发生晚期转移阶段，且预后极差 [2] 。尽管近些年在治疗方法上取得了一定进展，但其预后仍然不容乐观。目前，手术切除仍然是唯一可能的治愈方法，但大多数患者在确诊时已有局部或远处转移，因而错失手术机会。因此，探索针对胰腺癌的新的药物治疗靶点是提高胰腺癌晚期转化几率、增强化疗效果、实现精准治疗、改善预后及延长总体生存期的关键。
在肿瘤发生发展过程中，细胞代谢异常是一个重要的特征，其中糖基化修饰作为一种重要的调控机制，被认为在促进疾病进展、调节转移和驱动治疗耐药性的关键驱动突变、信号通路和肿瘤与微环境间的相互作用中发挥重要作用 [3] 。糖基化是最常见的翻译后修饰类型之一。复杂的糖基化过程产生了广泛的聚糖基团、糖蛋白和糖脂，从而增加了细胞内和细胞间信号调控的动态和可调节水平 [4] 。聚糖与蛋白质连接的两种最常见的机制是O-连接的糖基化和N-连接的糖基化 [5] 。糖基化异常是癌症进展的一个特征，并影响广泛的信号通路以促进疾病的发生和进展。然而，由于聚糖及其相关结构的聚集复杂性、复杂的糖基化和聚糖组装的调控机制以及人类疾病糖基化的模型的缺乏，目前PC领域中关于糖基化改变的功能后果及其是否能作为潜在治疗靶点的相关研究甚少。因此，探索糖基化在PC中的功能作用对于确定新的诊断工具和治疗靶点至关重要。
在O-连接的糖基化方面，研究最多的是O-连接β-N-乙酰氨基葡萄糖(O-linked-N-acetylglucosamine, O-GlcNAc)单糖修饰。HBP通路能够通过影响O-GlcNAc的糖基化进而调控信号传导、能量代谢、基因转录及表观遗传等多个层面 [6] 。O-连接β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(O-linked β-N-acetylglucosamine transferase, OGT)是一种独特的酶，它通过在蛋白质上转移乙酰葡萄糖基团来修饰多种细胞因子和调节因子，从而调控它们的活性和稳定性。许多类型的癌症表现出蛋白质O-GlcNAc糖基化增加。O-GlcNAc糖基化水平升高与转移性乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌和其他癌症有关 [7] [8] [9] [10] [11] ，这通常伴随着O-GlcNAc循环酶(即OGT和OGA)的表达改变。多项研究表明，OGT在多种癌症类型中的表达水平异常升高，并与肿瘤的分级、预后和治疗反应密切相关 [12] 。例如，在乳腺癌、结直肠癌和肝癌等多种癌症中，OGT的过度表达与肿瘤的恶性程度和转移能力呈正相关 [13] [14] [15] 。基于OGT在癌症发展中的重要作用，研究人员开始探索将OGT作为治疗靶点的可行性。抑制OGT活性或表达可以有效抑制肿瘤细胞的增殖和转移，并增强肿瘤对化疗和免疫治疗的敏感性 [16] 。因此，OGT可能成为未来癌症治疗的重要靶点之一。
综上所述，OGT作为糖基化修饰的关键酶，已经在多种肿瘤中显示出异常表达，并且与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。然而，目前对于OGT在胰腺癌中的表达及其对患者预后的影响尚缺乏系统深入的研究。因此，本研究旨在探讨OGT在胰腺癌中的表达情况，并分析其与胰腺癌的病理特征及预后的相关性，为胰腺癌的治疗和预后评估提供新的参考依据。
2. 研究对象与方法
2.1. 研究对象
本研究回顾性收集2017年1月至2021年1月在青岛大学附属医院行胰腺癌手术治疗患者的组织病理标本及临床资料。本研究已获得了青岛大学附属医院的伦理审查委员会审批，所有患者均已签署知情同意书。本文遵循《赫尔辛基宣言》规定。
2.2. 纳入和排除标准
2.2.1. 纳入标准
1) 术后病理确诊为胰腺导管腺癌；
2) 患者术前未行任何相关肿瘤治疗；
3) 患者临床资料完整。
2.2.2. 排除标准
1) 手术前行放疗或化疗的患者；
2) 合并其他恶性肿瘤的患者；
3) 出现严重并发症及影响生存时间的疾病；
4) 临床资料不完整及失访的患者。
2.3. 资料及材料收集
基本资料及既往史：年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史、糖尿病史等。
临床实验室检查：天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、载脂蛋白B (ApoB)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、白蛋白(Alb)、白细胞计数(WBC)、中性粒细胞计数(N)、淋巴细胞计数(L)、血小板计数(PLT)、血红蛋白(Hb)、血糖(GLU)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原19-9 (CA19-9)。
组织病理标本：收集65例胰腺癌患者的胰腺癌组织及其癌旁组织病理标本。根据病理结果判断患者肿瘤大小、分化类型、浸润及转移情况等。
随访：每3个月对患者进行电话随访。随访截止日期为2024年2月29日，生存期定义为从确诊日期到随访截止日期，或由于复发、转移而死亡的日期为止。
2.4. 主要试剂及仪器
2.4.1. 主要试剂
2.4.2. 主要仪器
2.5. 实验方法
1) 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液I 10 min–环保型脱蜡液II 10 min–环保型脱蜡液III 10 min–无水乙醇I 5 min–无水乙醇II 5 min–无水乙醇III 5 min–蒸馏水洗。
2) 阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS (pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。
3) 血清封闭：在组化圈内滴加3% BSA均匀覆盖组织，室温封闭30 min (一抗是山羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用BSA封闭)。
4) 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗(比例：OGT 1:500)，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。
5) 加二抗：玻片置于PBS (pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50 min。
6) DAB显色：玻片置于PBS (pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
7) 复染细胞核：苏木素复染3 min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。
8) 脱水封片：将切片依次放入75%酒精5 min–85%酒精5 min–无水乙醇I 5 min–无水乙醇II 5 min–正丁醇5 min–二甲苯I 5 min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，封片胶封片。
9) 镜检：置于白光显微镜下进行结果判读。所有切片均由两名不了解患者病情的高级病理学家独立评估。于表达部位可见黄色或棕黄色(深可至褐色)染色为着色阳性。根据视野中阳性细胞数量所占百分比进行评分：阳性细胞数量5%比例以下记为0分，阳性比例6%~25%记1分，阳性比例26%~50%记2分，阳性比例51%~75%记3分，阳性比例76%~100%记4分。根据染色强度评分：未见染色记0分，淡黄染色记1分，棕黄色染色记2分，深褐色染色记3分。总评分 = 阳性细胞数量所占百分比评分 × 染色强度评分。据总分将患者分为低表达组(≤4分)和高表达组(>4分)。
2.6. 统计学分析
本研究所采用的数据处理软件包括SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0.1。频率和百分比被用于描述分类变量，而通过χ²检验或Fisher精确检验法来确定其显著性。对于正态分布的定量资料，采用平均数加减标准差的方式进行表示，并通过t检验来分析其统计学意义。而非正态分布的定量资料则以中位数及四分位数间距进行描述，并通过Mann-Whitney U检验来分析其显著性。采用Spearman相关性检验分析两变量之间的相关性。生存分析方面，我们采用了Log-rank检验来评估是否存在显著差异，并利用Kaplan-Meier法绘制了生存曲线。
3. 结果
根据图1免疫组织化学结果显示，癌组织中细胞核着色为主，棕黄或深褐色多见，细胞质少量着色。在65例胰腺癌患者中，有54例OGT表达量升高，而11例表达量较低。与之对应的癌旁组织中，9例存在OGT高表达，细胞核染色阳性，而56例则呈低表达状态。经过表1中的统计学分析，发现两者之间存在着显著的统计学差异(P < 0.001)。这一研究结果表明，在胰腺癌患者中，OGT的表达水平普遍较高，而在癌旁组织中则呈现相反的趋势。
Figure 1. Expression of OGT in pancreatic cancer tissues and adjacent tissues (IHC × 200)
图1. OGT在胰腺癌组织和癌旁组织表达情况(IHC × 200)
Table 1. Expression of OGT in pancreatic cancer tissues and adjacent tissues
表1. OGT在胰腺癌组织及癌旁组织表达情况
接下来，我们将患者分为OGT高表达组(n = 54)和OGT低表达组(n = 11)。经过表2的分析，我们发现OGT表达与淋巴结转移、TNM分期存在相关性(P < 0.05)，OGT高表达的患者更容易发生淋巴结转移，并且其肿瘤分期更晚。
此外，我们还对两组患者在性别、年龄、CEA、CA-199、肿瘤大小、肿瘤位置、分化程度、胆总管浸润、十二指肠浸润、神经浸润以及血管侵犯等方面进行了比较。结果显示，这些因素在两组患者中并没有呈现出统计学上的显著差异(P > 0.05)。
因此，我们的研究结果表明，OGT的高表达与胰腺癌患者的淋巴结转移和肿瘤分期密切相关。
Table 2. Relationship between OGT and clinicopathological features of pancreatic cancer patients
表2. OGT与胰腺癌患者临床病理特征的关系
注：CA19-9：糖类抗原19-9；CEA：癌胚抗原；*：P < 0.05。
经过对高低两组OGT进行Log-rank分析并绘制K-M曲线后发现，OGT高表达组的5年生存率为18.52%，中位生存时间为16个月(95%CI: 13.307~18.693)，而OGT低表达组的5年生存率为45.45%，中位生存时间为32个月(95%CI: 25.377~34.623)。如图2所示，高OGT患者与更短的生存时间相关(HR = 2.442, P = 0.029)，具有统计学意义。这一发现提示了OGT在胰腺癌生存中的潜在作用，对于胰腺癌的预后评估和治疗策略具有重要的临床意义。
Figure 2. K-M curves of overall survival in pancreatic cancer patients with high and low OGT
图2. 胰腺癌患者高OGT组与低OGT组总生存期K-M曲线
4. 讨论
胰腺癌是一种高度致死性的恶性肿瘤，其治疗面临着重大挑战。近年来，研究发现胰腺癌细胞通过代谢重编程来适应恶劣的微环境，从而促进其生长、侵袭和耐药性。在胰腺癌中，代谢异常是其发生和发展的重要特征之一。葡萄糖代谢的改变是其中最为突出的表现之一。糖基化作为一种调节细胞功能的重要机制，被认为在代谢重编程过程中扮演着关键角色。
糖基化介导的细胞内信号转导主要由O-GlcNAc糖基化修饰介导。在多种癌症中，包括乳腺癌 [7] 、结肠癌 [8] [11] 和肺癌 [9] 等，O-GlcNAc糖基化水平均显著增加。O-GlcNAc糖基化修饰改变了代谢酶、组蛋白和转录调节因子的定位和活性，并且已被证实可以调节特定转录因子(如Sp1、β-catenin、SOX2、FOXO3和YAP等)的核易位和活性，从而促进具有增殖和抗凋亡的癌细胞表型。O-GlcNAc糖基化的水平由OGT和O-连接的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(O-linked N-acetylglucosaminidase, OGA)之间的平衡决定，它们分别在受体底物中添加和去除HBP的终产物尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡糖(Uridine diphosphate N-acetylglucosamine, UDP-GlcNAc)。OGT通过多种途径参与调节癌症的发展过程。首先，OGT可以调控癌细胞的增殖、转移和侵袭能力，影响肿瘤的生长和转移。其次，OGT还可以调控肿瘤干细胞的特性，影响肿瘤的发展和耐药性。此外，OGT还与肿瘤免疫逃逸、血管生成和微环境重塑等过程密切相关 [16] 。
PC的致密肿瘤基质导致血管灌注不足，从而造成组织缺氧状态，通过糖酵解和谷氨酰胺代谢增加通量 [17] ，这些途径汇聚于HBP途径。HBP是糖酵解的一个分支，负责产生糖基化的关键底物UDP-GlcNAc。HBP活性在PC中增加，并与不良存活率有关。在PC中，缺氧状态会提高OGT、OGA和O-GlcNAc的水平，并增加GFAT1的表达，其催化HBP的第一个和限速步骤，这使得缺氧状态下HBP通路更加活跃 [18] 。使用GFAT拮抗剂对HBP进行药物靶向治疗，可破坏O-GlcNAc糖基化修饰，减少细胞增殖、存活和侵袭，并增加饥饿诱导的细胞凋亡 [17] 。总之，HBP在促进癌症异常蛋白质糖基化过程中扮演着重要角色，因此针对HBP可能成为治愈PC患者的有效策略之一。本研究收集临床中65例胰腺癌术后患者的组织病理切片，通过免疫组织化学染色方法检测OGT蛋白表达量，结果提示胰腺癌组织中OGT表达量明显高于癌旁正常组织，这与之前的研究结果一致。
本研究存在一些局限性，本研究为回顾性研究，样本量相对较小，因此还需要更多的大样本、多中心的前瞻性研究来验证我们的结论。同时，未来还可以进一步研究OGT在胰腺癌中的具体作用机制，以及寻找针对性的新型治疗方法，从而更好地改善胰腺癌患者的预后。
NOTES
*通讯作者。