不同粒径微塑料对红树林线虫生活史的影响

Effects of Different Particle Sizes of Microplastics on the Life Cycle of Mangrove Nematodes

摘要: 本文利用玉米培养基成功培养红树林线虫Viscosia heterolaima sp，并观察到线虫的胚胎发育及胚后发本文对线虫Viscosia heterolaima sp进行暴露不同粒径微塑料暴露，以致死率、怀卵数、胚胎发育时间、后代数目等评估不同粒径的微塑料颗粒对线虫生活史的影响，发现致死率与微塑料的浓度无关，与微塑料的粒径有关，粒径(0.1、1.0、3.0、5.0) μm微塑料颗粒对线虫Viscosia heterolaima sp死亡率产生显著影响，其中，3 μm粒径微塑料对线虫成活率影响最大平均致死率为24.17%，与对照组差异显著(P < 0.01)，浓度2 mg∙L⁻¹粒径为0.1、1.0、3.0和5.0 µm的微塑料均能降低线虫的怀卵数，其中，粒径3 μm线虫怀卵数影响最大(抑制率为36.57%)，与对照组差异极显著(P < 0.01)；微塑料处理组对线虫胚胎1细胞、2细胞、多细胞期、囊胚期、原肠胚期、蠕虫的发育时间明显延长，(0.1、1.0、3.0、5.0) μm微米微塑料处理组胚胎发育持续时间分别为65.05 ± 1.19 hr，66.39 ± 0.94hr，69.04 ± 0.89 hr，64.49 ± 1.28 hr，3.0 μm微塑料处理对线虫胚胎发育持续时间影响最大，与对照组差异极显著(P < 0.01)；将线虫暴露于2 mg∙L⁻¹、0.1~5.0 µm的微塑料溶液后，微塑料颗粒主要分布在线虫Viscosia heterolaima sp肠道中，各粒径微塑料在线虫体内差异明显。其中，3.0 μm的微塑料颗粒在线虫Viscosia heterolaima sp体内的荧光强度最强；不同粒径微塑料都能降低线虫Viscosia heterolaima sp后代数目，使线虫的后代数目显著降低，抑制率达15.37%~40.35%。

Abstract: In this study, the effect of microplastic particles on the life cycle of nematodes, Viscosia heterolaima sp, was evaluated by fatality rate, number of eggs, embryonic development time, and number of offspring. It was found that the fatality rate was not related to the concentration of the microplastics, but to the particle size of the microplastics. The particle size (0.1, 1.0, 3.0, 5.0) of the microplastics had a significant effect on the fatality rate of Viscosia heterolaima sp. The average fatality rate was 24.17% (P < 0.01). 1.0, 3.0 and 5.0 m microplastics could reduce the number of eggs of nematodes, and the effect of 3 μm microplastics on the number of eggs of nematodes was the greatest (inhibition rate was 36.57%), which was significantly different from the control group (P < 0.01). The development time of 1-cell, 2-cell, multicellular, blastocyst, gastrula and helminth stage of nematode embryos treated with microplastics was significantly prolonged, and the development duration of embryos treated with (0.1., 1.0, 3.0, 5.0) μm microplastics was 65.05 ± 1.19 hr, respectively. Hr, 66.39 ± 0.94 hr, 69.04 ± 0.89 hr, 64.49 ± 1.28 hr, 3.0 μm Microplastic treatment had the greatest effect on the duration of embryo development of nematode, and the difference was very significant (P < 0.01). After the nematodes were exposed to 2 mg·L⁻¹, 0.1~5.0 μm microplastic solution, the microplastic particles were mainly distributed in the gut of the nematode Viscosia heterolaima sp. Among them, the fluorescence intensity of 3.0 μmmicroplastic particles was the strongest in Viscosia heterolaima sp. The number of progeny of nematode Viscosia heterolaima sp was significantly reduced by microplastics with different particle size, and the inhibition rate was 15.37%~40.35%.

1. 引言

从上个世纪开始许多研究者就认识到了海洋线虫对海洋环境的指示作用重要性 [1] ，特别是关于人类活动产生的污染对小型底栖生物的研究 [2] 。随着大量研究证明微塑料在海洋环境中广泛分布，这些微塑料是否能被海洋生物摄取成为许多研究人员关注的重点，迄今为止，研究人员已经在多种海洋生物中发现了微塑料；海洋生物通过不同方式摄取微塑料，密度较轻的微塑料易被浮游动物摄取，而密度较大的微塑料容易沉降，被底栖生物摄取，通过食物链传递，通过不同的营养级转移和放大 [3] ，海洋线虫是底栖生物的一大类，底栖生物可通过各种途径摄入沉积物微塑料，低营养级的底栖生物更加容易摄取沉积物微塑料，通过食物网的传递作用，可能引起更高营养级生物累积效应 [4] 。海洋线虫作为底栖生物的优势类群，在生态系统中具有重要作用，目前，海洋线虫广泛的应用于各种不同污染物的评测，对于海洋红树林线虫的毒理学研究较少，国内王摆等以海洋线虫Chromadorina sp为生物模型进行毒理学研究 [5] 。本文将不同粒径微塑料对线虫致死率、胚胎发育持续时间、怀卵数及等影响，以评估微塑料对线虫生活史的影响。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

1) 微塑料本实验所用微塑料PS粒径包括(0.1、1.0、3.0、5.0 µm) (上海辉质生物科技有限公司) (图1)。

2) 实验动物：线虫Viscosia heterolaima sp。

3) 仪器设备：无菌生化培养箱(SPX-450型)；电子天平(上海天美FA3204B)、解剖镜(奥林巴斯SZX7)、倒置荧光显微镜(DP-F80)等；

4) 试剂：氯化钠(NaCl)、氢氧化钠(NaOH)次磷酸钠(NaClO)、琼脂粉(天茂)、玉米粉。

2.2. 实验方法

Figure 1. Fluorescence pictures of microplastics with different particle sizes

图1. 不同粒径微塑料荧光图

2.2.1. 线虫的同化

培养中的线虫Viscosia heterolaima sp，每日添加适量玉米培养基，保持线虫的正常生长，将怀卵期的成虫用无菌过滤生境海水进行冲洗，再用吸管移至15 ml离心管，加入1 ml裂解液、3000 rpm离心1分钟，去上清液后用无菌过滤生境海水洗涤后3000 rpm离心30 s。收集留在底部的卵，并置于玉米培养基中，在温度为25℃、盐度为20‰条件下培养孵化，获得同步化的幼虫。

2.2.2. 致死率

将培养同化后线虫Viscosia heterolaima sp暴露于混有浓度梯度为0 (对照组cont.，下同)、2、4、8和16 mg·L⁻¹，粒径为0.1、1.0、3和5.0 µm的微塑料培养基72 h，对线虫死亡数计数，每组试验设4个重复。在暴露实验过程中，用针碰触线虫，如多次的碰触受试线虫仍没有任何反应，那么可以判定其死亡。

2.2.3. 怀卵数

将培养得的怀卵期线虫Viscosia heterolaima sp暴露于浓度为2 mg·L⁻¹、粒径为0.1、1.0、3.0和5.0 µm的微塑料培养基，分别计数线虫的产卵数，直至线虫不再产卵。

2.2.4. 胚胎发育持续时间

将怀卵期线虫Viscosia heterolaima sp暴露于浓度为2 mg·L⁻¹、粒径为0.1、1.0、3.0和5.0 µm的微塑料培养基，待线虫产卵后，对线虫胚胎发育时间进行记录。

2.2.5. 微塑料在线虫中的分布

将怀卵期线虫Viscosia heterolaima sp暴露于浓度为2 mg·L⁻¹、粒径为0.1、1.0、3.0、5.0 µm的微塑料溶液中(对照组不添加微塑料暴露)，72 h后采用倒置荧光显微镜拍照并观察微塑料颗粒在线虫体内的分布。

2.2.6. 子一代数目变化

将培养得的线虫Viscosia heterolaima sp暴露于浓度为2 mg·L⁻¹、粒径为0.1、1.0、3.0和5.0 µm的微塑料培养基，对线虫的后代个数进行统计分析，直至线虫不再孵化。

2.2.7. 数据分析

实验数据采用SPSS 2003进行差异显著性分析(注：^*：P < 0.05；^**P < 0.01)，Origin 7.0图表制作。

3. 结果与分析

3.1. 致死率测定结果

将培养同化后线虫Viscosia heterolaima sp暴露于混有浓度梯度为0、2、4、8和16 mg·L⁻¹，粒径为0.1、1.0、3和5.0 µm的微塑料培养基后，分析微塑料颗粒对线虫的死亡率影响，实验结果表明(图2)，粒径(0.1、1.0、3.0、5.0) μm微塑料颗粒对线虫死亡率产生显著影响，其中，3 μm粒径微塑料对线虫的平均致死率达到24.17 %，与对照组差异极显著(P < 0.01)，但线虫Viscosia heterolaima sp的死亡率与微塑料浓度无关。

Figure 2. The lethal rate of nematodes exposed to microplastics

图2. 微塑料暴露线虫的死亡率

3.2. 怀卵数测定结果

将线虫Viscosia heterolaima sp暴露于浓度2 mg·L⁻¹粒径为0.1、1.0、3.0和5.0 µm的微塑料培养基的微塑料培养基后，统计分析微塑料颗粒对线虫的怀卵数的影响，实验结果表明(图3)，与对照组相比，粒径0.1、1.0、3.0、5.0 μm微塑料均能降低线虫的怀卵数，其中，粒径3 μm线虫怀卵数影响最大(抑制率为36.57%)，与对照组差异极显著(P < 0.01)。

Figure 3. Effects of micro-plastics with different particle sizes on the number of eggs of nematodes

图3. 不同粒径微塑料对线虫怀卵数的影响

3.3. 胚胎发育时间测定结果

Figure 4. Effects of different microplastic particle sizes on the average duration of various stages of nematode embryo development

图4. 不同微塑料粒径对线虫胚胎发育各时期平均持续时间的影响

0.1、1.0、3.0、5.0 μm微塑料处理对线虫Viscosia heterolaima sp胚胎发育各期持续时间影响，如图4，各微塑料处理组对线虫胚胎1细胞、2细胞、多细胞期、囊胚期、原肠胚期、蠕虫的发育时间明显延长；4种不同粒径微塑料对胚胎发育平均时间的影响(图5)，0.1．1.0、3.0、5.0 μm微塑料处理组胚胎发育持续时间分别为65.05 ± 1.19 hr，66.39 ± 0.94 hr，69.04 ± 0.89 hr，64.49 ± 1.28 hr。与对照组相比(62.67 ± 1.08 hr)，0.1、1.0、3.0、5.0 μm微塑料处理明显延长了线虫胚胎发育持续时间。3.0 μm微塑料处理对线虫发育持续时间影响最大，与对照组差异极显著(P < 0.01)。

Figure 5. Effects of different microplastic particle sizes on mean duration of nematode embryo development

图5. 不同微塑料粒径对线虫胚胎发育平均持续时间的影响

3.4. 在线虫体中微塑料的分布

Figure 6. Distribution of nematodes with different microplastic particle sizes

图6. 不同微塑料粒径在线虫体内的分布

将线虫Viscosia heterolaima sp暴露于2 mg·L⁻¹、0.1、1.0、3.0、5.0 μm的微塑料溶液后，如图6，微塑料颗粒主要分布在线虫Viscosia heterolaima sp肠道中，各粒径微塑料在线虫体内差异明显。其中，3.0 μm的微塑料颗粒在线虫Viscosia heterolaima sp体内的荧光强度最强。

3.5. 子一代数目变化

将培养的线虫Viscosia heterolaima sp暴露于2 mg·L⁻¹、粒径为0.1、1.0、3.0和5.0 µm的微塑料培养基，对线虫的子一代个数进行统计分析，图7，结果表明，不同粒径微塑料都能降低线虫后代数目，使线虫的后代数目显著降低，其中，3 μm微塑料对线虫子一代数目抑制率达40.35%，与对照组差异极显著(P < 0.01)。

Figure 7. Number of offspring of nematodes exposed to different particle sizes

图7. 不同粒径暴露后线虫后代数目

4. 讨论

生物体通过各种途径摄取微塑料，如微塑料可以粘附在桡足类体表、内部，包括消化道，毛细血管以及足 [6] 。相对大型微塑料，微米、纳米级微塑料更倾向于被各种海洋生物当做食物被摄食，微米、纳米级微塑料比表面积较大，被生物摄取后更容易导致毒性作用 [7] 。本章以线虫Viscosia heterolaima sp为模式生物，以线虫存活率、怀卵数、子一代数目、胚胎发育持续时间等评估不同粒径的微塑料颗粒对线虫生活史的影响。通过实验发现，微塑料对线虫Viscosia heterolaima sp的毒性更多的表现为粒径的相关性，尽管使用最高的微塑料环境浓度对线虫进行暴露，致死率却与浓度无关，而与微塑料粒径相关，3 μm微塑料粒径暴露下对线虫的平均致死率达到24.17%，暗示不同粒径微塑料暴露后会降低线虫的成活率。固定浓度下，粒径3 μm的微塑料对线虫的致死率最高，同时对线虫的怀卵、胚胎发育时间影响也最大，不同微塑料粒径的毒性也有相关验证，Jeong等 [8] 发现0.05 μm的微塑料比更大粒径的0.5 μm、6.0 μm的微塑料更能累积于浮游生物内，用该粒径微塑料暴露后，发现该浮游生物的发育时间明显延长、繁殖力也降低，且细胞内ROS水平显著上升。同样，雷丽丽 [9] 利用浓度为1 mg·L⁻¹、粒径分别为0.1~5.0 µm的PS颗粒对C. elegans进行暴露发现，相对其他粒径微塑料，1.0 μm的PS颗粒对C. elegans的存活率影响最大。相对于6.0 μm的PS颗粒，更小粒径0.05 μm、0.5 μm的PS微塑料，对鞭毛虫的细胞密度的生长都能起到抑制作用(Thalassiosira pseudonana, T. pseudonana) [10] ，以上研究结果无不表明由于微塑料粒径大小导致不同的毒性作用。而与本实验结果不同，将端足类美洲钩虾分别暴露于10到27 μm聚乙烯微塑料和20到75 μm聚丙烯微塑料，结果显示，美洲钩虾的死亡率与聚乙烯和聚丙烯浓度成正比，为期42 d的聚乙烯慢性毒性试验过程中，美洲钩虾的生长和繁殖力、生存率降低，死亡率上升 [11] ；带电的PS纳米微塑料(0.02 μm)抑制微藻的种群增长速度，抑制其光合作用，而不带电的聚苯乙烯颗粒(0.05 μm)会严重影响杜氏微藻生长，仅在高浓度(250 mg·L⁻¹)时才会受到不利影响，且PS微塑料不会影响微藻的光合作用 [12] 。而将浮游植物暴露于微塑料中不会产生不利影响 [13] 。

微塑料对生物诱发毒性的方式主要是在生物体内富集和累积，摄入的塑料可能会对生物胃肠道造成物理损害，例如，会造成胃肠道的擦伤和损伤或物理破坏，或因为无法消化的微塑料会填满胃部并减少饥饿感，从而导致饥饿死亡 [14] [15] 。与本研究线虫Viscosia heterolaima sp摄入微塑料后，导致死亡；不同粒径微塑料暴露后，导致线虫死亡率升高，线虫胚胎发育时间延长，怀卵数降低，子一代数目减少，特别是粒径为3 μm的毒性最大，本实验观察到粒径为3 μm的微塑料在线虫Viscosia heterolaima sp肠道里分布和累积面积最大，相应的对线虫的各个评估毒性指标都有影响，毒性最大，说明3 μm粒径微塑料能在线虫Viscosia heterolaima sp体内大量累积是造成线虫损伤的重要原因，生物摄入微塑料后，微塑料会在其组织或器官中转移和富集，例如，带丝蚓(Lumbriculus variegatus)摄入聚甲基丙烯酸甲酯29.5 ± 26 μm后累积在其肠道系统 [16] 。而贻贝肌肉组织中可富集粒径小于16 um的微塑料，而后转移到淋巴系统，对去淋巴系统造成损伤 [17] ，所以，线虫在摄入微塑料后可能转入生殖系统，对生殖系统造成损害。关于微塑料对生物体的生殖毒性效应。将绿海胆暴露于PE微塑料颗粒，观察微塑料对绿海胆(Lytechinus variegatus)胚胎发育的毒性作用，发现微塑料对绿海胆有胚胎有轻微影响 [18] 。而使用与环境相关的微塑料暴露海胆(Tripneustes gratilla)，发现微塑料对海胆影响不大 [19] 。

所以，微塑料暴露后，可对生物体造成损伤甚至死亡，且不同类型、不同粒径大小的微塑料、不同受试生物表现出不同的毒性效应。

5. 结论

本研究对线虫Viscosia heterolaima sp进行暴露不同粒径微塑料暴露，以致死率、怀卵数、胚胎发育时间、后代数目等评估不同粒径的微塑料颗粒对线虫生活史的影响，发现致死率与微塑料的浓度无关，与微塑料的粒径有关，粒径(0.1、1.0、3.0、5.0) μm微塑料颗粒对线虫Viscosia heterolaima sp死亡率产生显著影响，其中，3 μm粒径微塑料对线虫成活率影响最大平均致死率为24.17%，与对照组差异显著(P < 0.01)，浓度2 mg·L⁻¹粒径为0.1、1.0、3.0和5.0 µm的微塑料均能降低线虫的怀卵数，其中，粒径3 μm线虫怀卵数影响最大(抑制率为36.57%)，与对照组差异极显著(P < 0.01)；微塑料处理组对线虫胚胎1细胞、2细胞、多细胞期、囊胚期、原肠胚期、蠕虫的发育时间明显延长，(0.1．1.0、3.0、5.0) μm微米微塑料处理组胚胎发育持续时间分别为65.05 ± 1.19 hr，66.39 ± 0.94 hr，69.04 ± 0.89 hr，64.49 ± 1.28 hr，3.0 μm微塑料处理对线虫胚胎发育持续时间影响最大，与对照组差异极显著(P < 0.01)；将线虫暴露于2 mg·L⁻¹、0.1~5.0 µm的微塑料溶液后，微塑料颗粒主要分布在线虫Viscosia heterolaima sp肠道中，各粒径微塑料在线虫体内差异明显。其中，3.0 μm的微塑料颗粒在线虫Viscosia heterolaima sp体内的荧光强度最强；不同粒径微塑料都能降低线虫Viscosia heterolaima sp后代数目，使线虫的后代数目显著降低，抑制率达15.37%~40.35%。

本研究表明，不同粒径微塑料对线虫Viscosia heterolaima sp致死率、胚胎发育时间等产生显著影响，进而影响其生活史。