摘要: 本研究旨在探讨血清C-Jun N-末端激酶通路相关磷酸酶(C-Jun N-terminal kinase pathway-associated phosphatase, JKAP)水平在儿童炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease, IBD)中的表达及其与炎症轻重程度、疾病活动度、Th17细胞水平的相关性。方法：选取140例IBD患儿(包括60例克罗恩病(Crohn’s Disease, CD)儿童和80例溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)儿童)作为实验组，采用ELISA法检测其血清JKAP、TNF-
α、IL-23、IFN-
γ和IL-17A水平。同时，选取10名健康儿童作为对照者，ELISA法检测血清JKAP水平。结果：① 与健康对照组相比，CD儿童和UC儿童的血清JKAP水平降低(均p < 0.05)。② 在CD患儿中，JKAP水平与CRP (p = 0.016)和ESR (p = 0.029)呈负相关；在UC儿童中，JKAP也与CRP (p = 0.006)和ESR (p = 0.022)呈负相关。③ 血清JKAP水平与儿童克罗恩病活动指数(Pediatric Crohn’s Disease Activity Index, PCDAI) (p = 0.001)和儿童溃疡性结肠炎临床活动性指数(Pediatric ulcerative colitis activity index, PUCAI) (p = 0.002)呈负相关。④ 在CD和UC儿童中，血清JKAP水平与TNF-
α呈负相关(均 p < 0.05)，与IL-23无明显相关性(均为p > 0.05)。⑤ 在CD或UC儿童中，JKAP与IFN-
γ (Th1分泌细胞因子)无相关性(均为p > 0.05)。⑥ 在CD和UC儿童中，JKAP与IL-17A (Th17分泌细胞因子)呈负相关(均为p < 0.05)。结论：血清JKAP水平在IBD儿童中呈低表达，与炎症轻重程度、疾病活动度和Th17细胞分泌的细胞因子水平呈负相关。
Abstract:
The objective of this study was to investigate the expression of serum C-Jun N-terminal kinase pathway-associated phosphatase (JKAP) level in pediatric inflammatory bowel disease (IBD) and its correlation with inflammation, disease activity, and Th17. Methods: 140 children with IBD (including 60 children with Crohn’s Disease (CD) and 80 children with Ulcerative Colitis (UC) were selected for the serum levels of JKAP, TNF-α, IL-23, IFN-γ and IL-17A by ELISA. Meanwhile, 10 healthy children were selected as controls and serum JKAP levels were measured by ELISA. Results: ① Serum JKAP levels were reduced in CD children and UC children compared with healthy controls (all p < 0.05). ② In children with CD, JKAP levels were negatively associated with CRP (p = 0.016) and ESR (p = 0.029); In children with UC, JKAP was also negatively associated with CRP (p = 0.006) and ESR (p = 0.022). ③ Serum JKAP levels were negatively associated with Pediatric Crohn’s Disease Activity Index (PCDAI) (p = 0.001) and Pediatric ulcerative colitis activity index (PUCAI) (p = 0.002). ④ In children with CD and UC, serum JKAP levels were negatively associated with TNF-α (both p < 0.05), and no significant correlation with IL-23 (both p > 0.05). ⑤ There was no correlation between JKAP and IFN-γ (Th 1 secreted cytokines) in children with CD or UC (both p > 0.05). ⑥ JKAP was negatively correlated with IL-17A (Th17 secreted cytokine) in CD and UC children (both p < 0.05). Conclusion: JKAP shows low expression in IBD children and was negatively correlated with inflammation, disease activity, and Th17 cells.
1. 引言
IBD是一种自身免疫性疾病，主要包括CD和UC [1] ，严重影响着患病儿童的生长、生活质量和心理健康等 [2] 。近几十年来，世界各国的儿童IBD发病率稳步上升，我国儿童IBD发病率也呈现上升趋势，这使得儿童IBD成为一个在国际上备受关注的疾病 [3] 。目前临床上反映儿童IBD发病风险和特征的生物标志物比较缺乏，这可能延误IBD儿童的治疗，探索敏感度和特异度高的生物标志物仍是一个全世界儿科医生探索的热点 [4] 。
JKAP是一种双特异性磷酸酶，可通过激活JNK通路，去磷酸化酪氨酸-394残基来抑制LcK，从而抑制T细胞活化，抑制T细胞受体(T-Cell Rceptor, TRC)信号通路介导的自身免疫过程 [5] 。在临床上，大量的研究已经报道显示JKAP具有作为自身免疫性疾病的生物标志物的潜力 [6] [7] [8] 。有研究显示JKAP与类风湿性关节炎、强直性脊柱炎及银屑病患者的炎症和疾病活动有关 [9] [10] 。另一项研究显示，血清JKAP水平在IBD患者中下降，与疾病活动性呈负相关 [11] ，但这项研究仅纳入了成人IBD患者，且受到样本量有限的限制(N = 81)，具有一定的偏差。因此，JKAP是否能作为IBD中的生物标志物仍需得到大样本量研究以得到验证，而JKAP是否也可以作为儿童IBD中的生物标志物目前尚不清楚。
本研究通过检测实验组血清JKAP水平，探讨JKAP在IBD儿童中的表达，及其与IBD儿童炎症程度、疾病活动度及Th17细胞相关性。
2. 方法
2.1. 研究对象
选取在2019年7月至2022年1月就诊于青岛大学附属医院的IBD儿童140名(包括60名CD儿童和80名UC儿童)。纳入标准是：1) 根据影像学、内窥镜和组织学检查确认为IBD (CD或UC)；2) 未满14岁；3) 愿意提供外周血样本。排除标准为：1) 合并其他免疫系统疾病；2) 既往有血液系统恶性肿瘤或实体瘤病史。本研究还招募了同一时期在医院接受10名健康检查的健康儿童作为健康对照组，有IBD病史或存在上述排除标准的儿童不纳入对照组研究。本研究经过青岛大学附属医院伦理委员会的批准。所有研究对象的法定监护人签署了知情同意书。
2.2. 实验对象一般情况及实验方法
收集实验组及对照组儿童的一般情况，包括年龄、性别、身高、体重、CRP和ESR。根据PCDAI评估CD儿童疾病活动性，将其分为非活动期和轻度、中度、重度活动期 [12] 。根据PUCAI评估UC儿童疾病活动性，将其分为缓解期和轻度、中度、重度活动期 [13] 。
采集IBD儿童及健康对照组儿童血清标本，使用试剂盒通过ELISA法检测IBD儿童血清JKAP、TNF-α、IL-23、IFN-γ、IL-17A水平及健康儿童的血清JKAP水平，研究中使用的所有试剂盒均购自上海酶联生物技术有限公司，实验步骤严格按照厂家提供的说明书进行。
2.3. 统计学方法
分别使用SPSS V.24.0 (IBM公司)和GraphPad Prism V.6.01 (GraphPad软件公司)进行统计分析和图形构建。三组间临床特征的差异采用单因素方差分析检验、卡方检验和K-W检验。三组间血清JKAP水平的比较采用K-W检验，组间比较采用Bonferroni检验进行校正。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析和曲线下面积(AUC)分析，评估通过JKAP水平来区分受试者的能力。两个变量的关联采用Spearman相关性分析评估。
3. 结果
3.1. 临床特征
各组间一般情况见表1，比较分析显示，UC儿童、CD儿童和对照组在年龄、性别、身高或体重方面无明显差异(均p > 0.05)。如表2所示，三组CRP的IQR分别为31.1 (18.0~45.5) mg/L、25.2 (16.9~43.2) mg/L、2.6 (1.4~3.3) mg/L，ESR的IQR分别为：29.9 (19.2~40.9) mm/h、30.5 (20.6~45.1) mm/h、10.1 (8.8~13.7) mm/h，存在显著差异(均p < 0.001)。此外，TNF-α、IL-23和IL-17A在UC儿童和CD儿童之间无明显差异(均p > 0.05)，而IFN-γ在CD儿童中较UC儿童高(p < 0.001)。UC儿童疾病活动性方面，PUCAI评分IQR为25.0 (15.0~40.0)，其中缓解期患儿12例(15.0%)，轻度39例(48.8%)，中度或重度29例(36.2%)。在CD儿童疾病活动性方面，PCDAI评分IQR为25.0 (17.5~40.0)，其中非活动期、轻度和中度/重度CD儿童分别为9例(15.0%)、28例(46.7%)和23例(38.3%)。
Table 1. General situation of IBD and healthy control children
表1. IBD儿童和健康对照儿童一般情况
缩写：HCs，健康对照组；SD，标准差。
Table 2. Results of the examination between the respective groups
表2. 各组间检查结果
缩写：CRP，C反应蛋白；ESR，红细胞沉降率；IFN-γ，干扰素-γ；IL-17A，白细胞介素17A；IL-23，白细胞介素23；IQR，四分位距；PCDAI，小儿克罗恩病活动指数；PUCAI，小儿溃疡性结肠炎活动指数；TNF-α，肿瘤坏死因子α。
3.2. 血清JKAP水平在IBD儿童中的表达
血清JKAP水平在CD儿童中IQR：51.6 (36.8~69.5) pg/ml，在UC儿童中IQR：57.5 (43.4~78.5) pg/ml，在健康对照组中IQR：101.8 (70.0~143.2) pg/ml (p < 0.001)。与健康对照组相比，血清JKAP水平在CD儿童(p < 0.001)和UC儿童(p = 0.005)中降低。而CD儿童和UC儿童之间的血清JKAP水平相似(p = 0.281)。ROC曲线显示，血清JKAP水平在鉴别CD儿童(AUC：0.868，95%置信区间(CI)：0.759~0.978)、UC儿童(AUC：0.824，95%CI：0.687~0.961)和健康儿童中具有很好的潜力。从结果中还可以看出，区分CD儿童与健康儿童的临界血清JKAP数值为73.25 pg/ml，区分UC儿童与健康儿童的临界血清JKAP数值为83.65 pg/ml。
3.3. JKAP与炎症标志物的相关性
在CD儿童中，血清JKAP水平与CRP (rs = −0.310, p = 0.016)及ESR (rs = −0.281, p = 0.029)呈负相关。在UC儿童中，血清JKAP水平也与CRP (rs = −0.307, p = 0.006)、ESR (rs = −0.257, p = 0.022)呈负相关。
3.4. JKAP与疾病活动度的相关性
在CD儿童中，JKAP与PCDAI评分呈负相关(rs = −0.421, p = 0.001)；根据评分，将CD儿童分为非活动期、轻度和中度/重度，发现JKAP 与CD儿童的疾病严重程度呈负相关(rs = −0.392, p = 0.002)。同时，在UC儿童中，JKAP与PUCAI评分负相关(rs = −0.342, p = 0.002)；根据评分，将UC儿童分为缓解期、轻度或中度/重度，相关性分析表明，JKAP与UC儿童的疾病严重程度呈负相关(rs = −0.241, p = 0.031)。
3.5. JKAP与促炎细胞因子的相关性
在CD儿童(rs = −0.437, p < 0.001)和UC儿童(rs = −0.238, p = 0.033)中，血清JKAP水平均与TNF-α呈负相关。而在CD儿童(rs = −0.240, p = 0.065)及UC儿童(rs = −0.205, p = 0.068)中，血清JKAP水平均与IL-23无相关性。
血清JKAP水平与IFN-γ无相关性(rs = −0.186, p = 0.156)，而它与IL-17A呈负相关(rs = −0.342, p = 0.008)；在CD儿童中，JKAP与IFN-γ/IL-17A比值无相关性(rs = −0.149, p = 0.256)。在UC儿童中，JKAP与IFN-γ无相关性(rs = −0.101, p = 0.373)，但它与IL-17A呈负相关(rs = −0.255, p = 0.022)，其与IFN-γ/IL-17A比值亦无相关性(rs = −0.035, p = 0.756)。
4. 讨论
据报道，JKAP通过灭活淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lymphocyte-specific protein-tyrosine kinase, Lck)来抑制TCR信号传导和自身免疫 [8] 。基于这一发现，很多研究探讨了JKAP在自身免疫性疾病中的临床作用，这些研究表明JKAP在类风湿性关节炎或IBD患者血清中含量较低 [11] 。然而，JKAP是否在IBD儿童中也表现出异常表达仍不清楚。在我们的研究中，与健康儿童相比，CD儿童和UC儿童的血清JKAP水平降低。考虑其原因是：JKAP通过去磷酸化酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸使MAP激酶(包括c-Jun N末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)和p38激酶)失活。低水平的JKAP通过激活T细胞受体信号通路促进IBD患者的T细胞活化、免疫激活和炎症因子水平升高，进一步促进了IBD的进展。而JKAP的下调可能促进T细胞、T辅助性1型细胞(Th1)细胞和Th17细胞的活化，从而导致炎症细胞因子的释放，包括TNF-α、IL-6和IL-17等 [8] [14] 。因此，与健康儿童相比，IBD儿童血清JKAP水平较低。目前，IBD的诊断需结合临床症状、实验室检查、内镜检查、组织病理学检查和影像学检查，缺乏诊断IBD的金标准，这可能导致IBD治疗延迟 [15] 。我们的数据显示，JKAP在区分IBD儿童和健康儿童方面显示出良好的潜力，这意味着JKAP可能有助于儿童IBD的诊断，这在未来的研究中需进一步探索。
本研究结果显示，JKAP能够反映自身免疫性疾病患者的疾病活动性。例如，JKAP与银屑病患者的银屑病面积与严重程度指数(Psoriasis area and severity index, PASI)评分呈负相关 [9] ；同时，JKAP与成人CD患者的PCDAI评分呈负相关 [16] ；此外，在类风湿性关节炎患者中，JKAP与基于红细胞沉降率的28个关节疾病活动度评分呈负相关 [17] 。这些研究表明，JKAP可以作为一种潜在的生物标志物，及时监测自身免疫性疾病的疾病活动性。然而，这种相关性是否也存在于IBD儿童中还有待研究。在本研究中，观察到JKAP与IBD儿童的炎症标志物、促炎细胞因子和疾病活动度评分呈负相关。考虑其原因可能是：1) JKAP作为一种磷酸酶，可能通过多种途径下调炎症，例如JNK途径和TCR途径 [8] 。因此，JKAP与IBD儿童的炎症呈负相关；2) 通过下调炎症，JKAP可降低IBD患者的疾病活动度。
CD4+ T细胞在IBD的病理生理学中起着重要作用。有研究显示，IBD患者的Th1和Th17失调 [18] 。同时，Th1和Th17也调节IBD的进展 [19] 。既往也有研究表明，JKAP不仅与慢性阻塞性肺病、阿尔茨海默病、帕金森病等几种综合性疾病中的Th1和Th17相关，而且还调节IBD中Th1和Th17的分化 [11] [20] 。因此可以推断，JKAP也与IBD儿童的Th1和Th17相关。在我们的研究中，JKAP与IBD儿童的Th17呈负相关，这可能是因为JKAP可能抑制IBD儿童Th17的分化 [11] 。同时，由于Th17对IBD的发病机制和进展具有重要调节作用，上述数据也可以解释JKAPIBD发病风险和疾病活动性的相关性。
本研究得出结论，血清JKAP水平在IBD儿童中呈低表达，与炎症轻重程度、疾病活动度和Th17细胞分泌的细胞因子水平呈负相关。但研究的样本量相对较小，研究具有一些局限性。在未来，我们要进一步探讨JKAP在儿童IBD中的作用机制及临床意义，探讨JKAP调控IBD中CD4+ T细胞分化为Th17细胞的分子机制，以期通过监测JKAP水平变化，来监测儿童IBD活动性、炎症程度，为儿童IBD生物制剂的研制提供方向及理论依据。
NOTES
*通讯作者。