Galt基因编辑小鼠的肠道菌群分析

Analysis of Gut Microbiota in Galt Editing Mice

摘要: 目的：本研究旨在分析半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶(Galactose-1-Phosphateuridylyltransferase, Galt)基因编辑后对小鼠肠道菌群的影响。方法：基于前期构建的Galt基因编辑小鼠模型，通过16S rRNA基因测序技术，对比野生型(Wild type, WT)和Galt基因编辑小鼠肠道内容物中的菌群组成。结果：结果显示，Galt基因编辑小鼠肠道菌群多样性下降，菌群丰富度减少；物种组成也发生显著性变化。Galt基因编辑组中厚壁菌门占比由69.836%降低45.096%，拟杆菌门占比由15.824%增加到37.672%，变形菌门的相对丰度由1.82%增加到13.175%，脱硫弧菌门的相对丰度由5.42%降低到0.36%。在属水平上，未分类的木楠科属和嗜冷杆菌属相对丰度在Galt基因编辑组中上调，萄球菌属和脱硫弧菌属在WT组中上调。进一步对两组小鼠KEGG功能差异分析，结果显示小鼠碳水化合物运输和代谢，能量产生和转化，氨基酸运输和代谢以及与复制，重组和修复相关的基因方面等功能上存在差异。结论：Galt基因编辑对小鼠肠道菌群的丰富度、组成和功能有影响。

Abstract: Objective: The purpose of this study was to analyze the effect of Galactose-1-phosphateuridylyltransferase gene knockout on intestinal flora in mice. Methods: The Galt mouse model was constructed by CRISPR/Cas9 technology. The composition of gut microbiota in WT group and Galt group was compared by 16S rRNA gene sequencing. Results: The diversity of intestinal flora decreased, and the richness of flora decreased. At the phylum level, the proportion of Firmicutes and Desulfovibrio in the Galt group decreased, and the proportion of Bacteroidetes and Proteobacteria increased. At the genus level, the relative abundance of unclassified Photinia and Psychrobacter was up-regulated in the Galt group, and the relative abundance of Staphylococcus and Desulfovibrio was up-regulated in the WT group. Further analysis of KEGG functional differences between the two groups of mice showed that there were differences in carbohydrate transport and metabolism, energy production and transformation, amino acid transport and metabolism, and replication in mice. Conclusion: GALT gene knockout affects the richness, composition and function of intestinal flora in mice.

1. 引言

人体中有数万亿个微生物细胞，它们的协同作用被认为对人类的生命至关重要。这些微生物细胞群在肠道隔间中达到最高密度，在那里它们共同形成一个复杂的微生物群落，称为肠道微生物群 ‎[1] 。肠道微生物是指居住在人类肠道中的微生物群落，包括细菌、真菌、病毒和原生动物等 ‎[2] 。这些微生物对人体健康具有重要影响，它们帮助消化食物、合成维生素 ‎[3] 、保护肠道免受病原体侵害 ‎[4] ，参与调节免疫系统 ‎[5] 。半乳糖可以作为肠道微生物的营养来源之一，尤其是对那些能够发酵半乳糖的菌群 ‎[6] 。在Quinn EM和THOMSON P的研究中指出肠道微生物中的双歧杆菌等有益菌可以利用半乳糖进行发酵，产生短链脂肪酸，这些物质对维持肠道健康和调节免疫功能具有正面作用 ‎[7] ‎[8] 。因此，适量摄入半乳糖有助于促进这些有益菌的生长，从而维护肠道微生态平衡。然而，过量摄入半乳糖，特别是在半乳糖酶活性不足的情况下，可能导致肠道不适，如腹泻、腹胀和腹痛等症状 ‎[9] 。除此之外，半乳糖血症患者必须遵循严格的饮食限制，避免摄入任何含半乳糖的食物。由于患者体内缺乏或完全没有半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶(GALT)或该酶活性不足，导致无法正常代谢半乳糖 ‎[10] 。

为了研究GALT基因突变的致病机理，RIEHMAN K等人以酵母为对象，发现Galt基因的突变降低了GALT酶活力 ‎[11] 。随着研究的深入，LESLIE N D等构建了Galt敲除小鼠模型，通过提高小鼠半乳糖摄取量发现小鼠生长发育迟缓等症状，除此之外小鼠的大脑和卵巢也出现不同程度的损伤 ‎[12] 。我们通过CRISPR/Cas9技术成功构建出Galt基因编辑小鼠模型，利用16S rRNA测序技术分析小鼠在Galt基因编辑使得其半乳糖代谢能力下降的情况下对肠道微生物的影响，为探究Galt基因的致病机制提供新的研究思路和方向。

2. 材料与方法

2.1. 材料

10只SPF (Specific Pathogen Free)级C57BL/6J，5只野生型小鼠，5只Galt基因编辑杂合子小鼠，并将其饲养于桂林医学院智能医学与生物技术学院动物实验室，动物实验室室温为23℃~24℃，湿度为40%~60%，动物实验室每天光照和黑暗时长各为12 h，光照时间为早上8点至晚上20点，黑暗时间为晚上20点至早上8点。本实验已通过动物伦理，审批号为GLMC201803033。

2.2. 实验方法

2.2.1. 16S rRNA测序分析

准备WT和Galt基因编辑杂合小鼠各5只，采集小鼠粪便，采集时轻轻挤尾巴根部直肠未端，待排粪便即可收集于无菌EP管中，−80℃冷冻；或者采用抓取小鼠后颈，固定住小鼠尾巴，收集粪便，−80℃保存。不同小鼠粪便取样前要更换器械并用酒精擦拭，避免交叉污染。交由上海美吉生物公司进行16S测序分析。

2.2.2. 统计学分析

通过美吉生物提供的在线网站进行α-多样性分析，包括Shannon指数曲线和OTUs稀释曲线，测量了物种丰富度。采用主坐标分析(PCoA)和非度量多维尺度(NMDS)进行群落分布相似性的β-多样性分析，通过分析不同样本群落组成的差异，揭示样本间的差异和距离。采用线性判别分析效应量(LEfSe)分析两组间门和属水平的差异性。利用PICRUSt软件预测了微生物的功能差异。

3. 结果

3.1. GALT突变小鼠肠道微生物α-多样性和β-多样性分析

(A) 稀疏度曲线

(B) Shannon曲线(C) 主坐标分析 (D) 非度量多维尺度分析

Figure 1. Analysis of intestinal microbial diversity

图1. 肠道微生物多样性分析

从稀疏度曲线上看，所有样品的测序覆盖率均在99%以上，每组曲线均接近饱和，说明样品中大部分微生物已被检测到，数据真实可信(图1(A))。选择Shannon指数分析微生物的α-多样性，结果显示物种丰富度无显著性差异(图1(B))。通过主坐标分析(Principal Coordinates Analysis, PCoA)和非度量多维尺度(Non-Metric Multidimensional Scaling, NMDS)分析小鼠肠道微生物的β-多样性。PCoA结果显示WT组和Galt基因编辑组在第一主坐标(PC1)中位线有明显的分离，并且Galt基因编辑组的置信椭圆与WT组有部分重叠，表明小鼠的肠道菌群微生物构成有了显著的变化(图1(C))。在NMDS分析结果中stress = 0.083 < 0.1，本次检验结果表现良好，Galt基因编辑组和WT组的同组样本距离较近，均集中在NMDS图的同一区域，Galt基因编辑组和WT组点间距离较远，说明样本微生物群落组间差异大于组内差异，两组群落组成存在显著差异(图1(D))。

3.2. 肠道菌群组成结构比较

采用16S rRNA基因测序技术从小鼠肠道菌群共鉴定出1778个OTUs，包括11门15纲41目81科167属303种。如图所示，WT和Galt基因编辑组分别含有的OUT数量为1190和1291，WT和Galt基因编辑组分别特有的物种数量为266和254，由两组相比可知，Galt基因编辑增加了小鼠肠道微生物群的丰度，同时降低了小鼠肠道微生物群的多样性，OTU数量增加了8.49%，物种下降了4.51% (图2(A))。

在门水平上，WT、Galt基因编辑组两组别中相对丰度最高的10个细菌门，其中有4个细菌门的相对丰度存在差异，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)是两组共有的优势菌门。厚壁菌门作为第一优势菌门，在WT组中的相对丰度为69.84%，在Galt基因编辑组中降低到45.1%。拟杆菌门作为第二优势菌门，与WT组相比，在Galt基因编辑组中其相对丰度为由15.824%上升至37.672%。变形菌门(Proteobacteria)在Galt基因编辑组中的相对丰度为13.175%，WT组中降低到1.82%。脱硫弧菌门(Desulfobacteria) WT组中的相对丰度为5.42%，在Galt基因编辑组中降低到0.36%。在属水平上，WT、Galt基因编辑两组别中相对丰度最高的10个细菌属，其中有4个细菌属的相对丰度存在差异，未分类的木楠科属(unclassified genus of the family Muribaculaceae)在galt-Het组中的相对丰度为31.78%，而在WT组中降低到10.78%。葡萄球菌属(Staphylococcus)在WT组中的相对丰度为25.50%，Galt基因编辑组中仅有3.55%。嗜冷杆菌属(Psychrobacter)在Galt基因编辑组中的相对丰度为13.03%，WT组中降低到0.05%。脱硫弧菌属(Desulfovibrio)在WT组中的相对丰度为5.18%，Galt基因编辑组中降低到0.31%。这些结果说明Galt基因编辑会导致小鼠肠道微生物组成结构发生变化。

(A)菌群组成Venn图 (B)门水平 (C)属水平

Figure 2. The bacterial composition of WT group and Galt group

图2. WT组和Galt基因编辑组菌群组成

3.3. 物种差异分析

Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe)分析可以对样品在不同分类水平下进行比较，用线性判别分析(LDA)获得每个物种丰度影响差异的LDA值，从而找到区分或影响不同样本的重要菌群。采用秩和检验的结果：P < 0.05，LDA > 3.0筛选不同基因型小鼠肠道中的差异菌株，在不同的分类水平(门、纲、目、科、属、种)上发现了40株菌株具有显著性差异。WT组中主要差异菌株为：厚壁菌门的葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、Anaeroplasma、链球菌科(Streptococcaceae)和放线菌门(Actinomycetota)的科里奥杆菌(Coriobacteriia)；其中链球菌科可以参与生物体的碳水化合物、氨基酸和脂质及维生素合成等生化代谢活动，能够代谢碳水化合物，如葡萄糖、果糖等，并产生乳酸作为代谢产物。肠球菌科参与生物体的碳水化合物、氨基酸和脂质及维生素合成等生化代谢活动，参与糖代谢途径，能够分解和转化氨基酸，参与氨基酸合成、降解和转运等过程以及合成维生素。葡萄球菌科的微生物对生物体的生化代谢产生多方面的影响，包括酸碱平衡、能量代谢、蛋白质和脂肪代谢等方面。产生乳酸、分泌各种酶，包括蛋白酶和脂肪酶。

Galt基因编辑组主要差异菌为：厚壁菌门的乳酸杆菌科(Lactobacillales)、支原体属(Mycoplasma)，拟杆菌门的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和假单胞菌门(变形菌门)的嗜冷杆菌属(Psychrobacter)。嗜冷杆菌属是已确定的低致病性病原体，感染可能导致一系列症状，包括发热、感染部位肿胀、红肿、疼痛等。乳酸菌属是一类革兰氏阳性菌，其属多为有益菌，可以帮助机体消化和代谢蛋白质和碳水化合物，增强先天性和获得性免疫力，具有抗菌活性，能够调节肠道微生物群落的平衡，促进食物消化和营养吸收，缓解肠道炎症和感染等。而Prevotellaceae_UCG-001——益生菌，参与短链脂肪酸的产生、糖类的代谢、脂肪酸的代谢，有助于促进营养物质的吸收、调节免疫系统功能和维持肠道菌群的稳定性。

(A) LEfSe层级差异分析 (B) LDA线性判别

Figure 3. Analysis of species difference of intestinal flora

图3. 肠道菌群物种差异分析

3.4. 功能预测分析

通过PICRUSt2 (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy)软件对OTU丰度表进行归一化处理，绘制KEGG通路热图。

在一级通路上，物种功能注释结果显示，两组肠道菌群均注释出新陈代谢、遗传信息处理、细胞过程、环境信息处理、人类疾病、生物体系统6种功能代谢通路。Galt组相对于WT组，各项代谢都有一定程度的下降，其中，在遗传信息处理和环境信息处理代谢方面的功能下降比较明显，表明Galt基因编辑小鼠对于外界环境适应性下降，以及可能会有DNA的受损和突变，增加患癌等疾病的风险。

二级通路结果显示Galt组相对WT组在耐药性：抗肿瘤药、运输和分解代谢、神经退行性疾病、传染病：病毒性、癌症：特定类型、消化系统、排泄系统、循环系统、药物依赖性、发展与再生方面的表达升高，表明Galt基因编辑小鼠对于癌症、传染病等疾病的患病风险增大，同时小鼠自身存在对于galt的负反馈调节，其对于提高代谢效率、增强抵抗力方面的表达相对于正常小鼠有所增加。

深入三级通路进行两组间菌群差异功能比较分析发现，Galt组相对WT组在不同环境中的微生物新陈代谢、氨基酸的生物合成、碳代谢、转运蛋白磷转移酶系统(PTS)通路上功能下调，表明Galt基因编辑小鼠无法有效地利用环境中的资源，在合成蛋白质以及对特定营养物质的吸收能力降低，使得代谢产生的能量供应不足，导致生长受限或生理失调，影响能量代谢和信号传导途径。

(A) (B) (C)

Figure 4. 1~3 KEGG pathway heat map

图4. 1~3级KEGG通路热图

4. 讨论

经典半乳糖血症是一种潜在致命的常染色体隐性遗传病，由半乳糖-1-p尿苷基转移酶(GALT)严重缺乏引起，GALT是半乳糖代谢Leloir途径中的中间酶 ‎[13] 。在正常的代谢活动中，摄入乳糖后会分解成半乳糖，半乳糖在半乳糖激酶(Galactokinase 1, GALK1)作用下被转化为半乳糖-1-磷酸，而GALT酶将会利用半乳糖-1-磷酸产生葡萄糖-1-磷酸参与糖代谢，当GALT酶异常时会导致半乳糖-1-磷酸堆积从而产生半乳糖血症 ‎[14] ‎[15] 。在人体中肠道微生物群主要由两个门类组成，分别是厚壁菌门、拟杆菌门 ‎[16] ，厚壁菌门细菌能够通过发酵作用分解糖类等物质，产生能量、酸、醇和气体等代谢产物。例如，乳酸菌通过发酵糖类产生乳酸，这在食品发酵(如酸奶、泡菜)和人体肠道健康中非常重要 ‎[17] 。拟杆菌门也参与人体中许多重要的代谢活动 ‎[18] 。乳糖代谢异常可能会影响厚壁菌门和拟杆菌门中的微生物的组成，从而影响机体的健康。

在本研究中，利用CRISPR/Cas9靶向小鼠Galt基因，成功构建Galt基因编辑小鼠。α-多样性和β-多样性分析结果显示Galt基因编辑改变了小鼠肠道菌群组成，使小鼠的肠道菌群多样性降低，丰富度上升。在Daniel Bello-Gil等人的研究中，通过对GALT敲除小鼠16S测序分析发现该GALT敲除小鼠的物种丰富度也发生显著变化 ‎[19] 。本研究结果与其相似，与WT小鼠相比，物种的丰富度发生变化。通过物种组成和物种差异分析，Galt基因编辑组相对于WT组肠道菌群的厚壁菌门和脱硫弧菌门丰度下降，而拟杆菌门和变形菌门丰度上升。厚壁菌门主要是革兰氏阳性细菌，可以分解复杂的碳水化合物、多糖和脂肪酸等为宿主生命活动提供能量来源 ‎[20] ‎[21] 。脱硫弧菌门降解了肠粘蛋白，一种粘弹性粘液，这将削弱或破坏肠道屏障，这可能会使肠道上皮细胞直接暴露于肠道菌群 ‎[22] 。拟杆菌门对炎症有一定的减轻作用 ‎[23] ‎[24] 。变形菌门的发生和生理学功能高度复杂，能够帮助宿主利用碳源，为宿主的能量积累发挥重要作用 ‎[25] ，同时，变形杆菌被认为是具有致病性的肠道共生体，其成员的紊乱与很多疾病有关，如炎症、肥胖等代谢综合征紊乱疾病 ‎[26] ‎[27] 。由功能预测分析，可以得出Galt基因编辑使得小鼠的代谢系统功能上发生变化，其对小鼠碳水化合物运输和代谢，能量产生和转化，氨基酸运输和代谢以及与复制、重组和修复相关的基因的代谢下降，并且对于生殖发育及疾病的抵御方面影响较大。研究结果显示GALT敲除会影响小鼠肠道微生物的组成和多样性，进而导致小鼠的肠道微生物功能差异。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。