同步荧光光谱研究头孢匹林钠与牛血清白蛋白相互作用机制

Study on the Interaction Mechanism between Cephalosporin Sodium and Bovine Serum Albumin by Synchronous Fluorescence Spectroscopy

摘要: 本文采用同步荧光光谱研究不同温度下头孢匹林钠(CP)–牛血清白蛋白(BSA)相互作用机制及药物协同性和酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)残基的药物结合率及药物的蛋白结合率。结果表明：随着CP浓度逐渐增大，波长发生红移，Tyr和Trp残基周围微环境发生改变；CP与BSA结合发生静态猝灭，Tyr和Trp残基均参与体系结合反应。N_SFQ(Tyr) < N_SFQ(Trp)，结合位置更靠近Trp残基，结合位点数n ≈ 1，ΔG < 0，ΔH > 0，ΔS > 0，体系环境以疏水作用为主；模拟生理条件下，Hill系数n_H略小于1，表现为弱的负协同作用；c_CP在48~72 μg/mL时，CP在Tyr残基的蛋白结合率W(B)为47.92%~58.00%，在Trp残基的W(B)为48.13%~65.05%时，游离药物率在40%~50%之间，表明40%~50%的药物具有药物活性，50%~65%的药物与血浆蛋白结合成结合型药物，影响药物的药理活性。

Abstract: In this paper, synchronous fluorescence spectroscopy was used to study the mechanism of cefapirin sodium (CP)-bovine serum albumin (BSA) interaction and drug synergism and the drug binding rate of tyrosine (Tyr) and tryptophan (Trp) residues as well as protein binding of the drug at different temperatures. The results showed that: with the gradual increase of CP concentration, the wavelength was red-shifted, the microenvironment around Tyr and Trp residues was changed. The binding of CP to BSA took place in a static burst, and both Tyr and Trp residues were involved in the binding reaction of the system. N_SFQ(Tyr) < N_SFQ(Trp), the binding position was closer to Trp residues, the number of binding site n ≈ 1, ΔG < 0, ΔH > 0, ΔS > 0, the system environment was dominated by hydrophobic interaction. Under simulated physiological conditions, the Hill coefficient n_H was slightly less than 1, which showed weak negative synergism. c_CP = 48~72 μg/mL, the protein binding rate of CP at Tyr residues W(B) ranged from 47.92% to 58.00%, and that at Trp residues W(B) ranged from 48.13% to 65.05%, the free drug rate ranged from 40% to 50%, indicating that 40% to 50% of the drug was pharmacologically active, and 50%~65% of the drug bound to plasma proteins to form a conjugated drug, affecting the pharmacological activity of the drug.

1. 引言

因药物小分子与血清白蛋白结合生成的复合物经过转运到达靶位发挥药理作用 [1] ，所以探究药物小分子和蛋白质之间的相互作用机制已经成为近些年的研究热点，牛血清白蛋白(BSA)和人血清白(HSA)蛋白的三级结构相似，序列同源性高达76% [2] ，且价格便宜等优点，因此本实验用BSA替代HAS研究与药物小分子的结合作用。同步荧光光谱分析法具有较好的选择性、较高的灵敏度，可减少光谱测量过程中的干扰 [3] 等优点，同时可以分析药物与蛋白质中Tyr与Trp残基结合常数、结合位数、结合作用力及Tyr与Trp残基周围微环境的变化情况，从而得到药物与蛋白质相互作用的机理。

头孢匹林钠(CP)属于一代头孢菌素，主要用于肺炎链球菌、葡萄球菌等抗菌作用。CP的检测方法包括光谱法、荧光法、高效液相色谱法和紫外法等 [4] [5] ，采用同步荧光光谱法研究CP与BSA相互作用机制和药物协同作用的研究报道甚少，本论文拟采用同步荧光研究CP和BSA结合的作用机制和药物协同性及酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)残基的药物结合率及药物的蛋白结合率，为药物在临床应用提供重要参考。

2. 实验部分

2.1. 仪器与试剂

仪器：荧光分光光度仪(Agilent Cary eclipse, Germany)，pH计(PHS-25，上海)

试剂：牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)，头孢匹林钠(CP，Sigma公司，纯度 ≥ 98%)，0.5 mol/L NaCl溶液(分析纯)，pH = 7.36的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲溶液(分析纯)，实验用水为二次蒸馏水。

2.2. 实验步骤

配制CP储备液：准确称量0.302 g，定容为100 mL，浓度为3.02 g/L。

配制BSA储备液：准确称量72.5 mg，用pH = 7.36的Tris-HCl缓冲溶液定容至100 mL，使其浓度为0.725 mg/mL，置于冰箱冷藏保存。

同步荧光光谱扫描：在25 mL比色管中依次加入2.00 mL BSA、5.00 mL 0.5 mol/L NaCl溶液，依次加入0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mL的CP储备液，用pH = 7.36的Tris-HCl缓冲溶液定容至25.00 mL，静置30 min。荧光比色皿为1 cm，入射和出射狭缝均为5 nm，分别在310 K，298 K，288 K，Δλ = 15 nm和Δλ = 60 nm时，扫描体系的同步荧光光谱。

3. 结果与讨论

3.1. CP-BSA的同步荧光光谱

对于BSA来说，当Δλ = 15 nm时扫描的荧光光谱，呈现的是BSA中酪氨酸(Tyr)残基的光谱信息，当Δλ = 60 nm时为色氨酸(Trp)残基的光谱信息，通过扫描CP-BSA的同步荧光光谱(见图1)，可知CP的加入对BSA中Tyr和Trp残基的光谱信息的影响。

c_BSA = 8.729 × 10⁻⁷ mol/L; 0~10 c_CRO = (0, 0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20, 1.40, 1.60, 1.80, 2.00) × 2.712 × 10⁻⁴ mol/L。

Figure 1. Synchronous fluorescence spectra of CP-BSA (T = 310 K, (a) Δλ = 15 nm; (b) Δλ = 60 nm)

图1. CP-BSA的同步荧光光谱(T = 310 K, (a) Δλ = 15 nm; (b) Δλ = 60 nm)

从图1(a)中可以看出，随着CP浓度逐渐增大，BSA中Tyr残基的荧光强度发生明显的荧光猝灭，波长发生微小的移动，从286 nm红移至292 nm，红移了6 nm；图1(b)中看出，Trp残基荧光强度衰弱很明显，同时波长发生明显的红移，从279 nm红移至292 nm，红移了13 nm，表明Tyr残基和Trp残基周围的微环境发生改变，从而影响BSA的能级结构。

根据不同温度下CP-BSA体系Stern-Volmer方程 [6] (公式1)，Δλ = 15 nm和Δλ = 60 nm时，以F₀/F对c_q作图，见图2。

$\frac{F_0}{F}=1+K_{sv}{c}_q=1+K_q\tau c_q$ (1)

Figure 2. Stern-Volmer plots for the quenching of CP-BSA at different temperatures ((a) Δλ = 15 nm; (b) Δλ = 60 nm)

图2. 不同温度下CP-BSA体系的Stern-Volmer曲线((a) Δλ = 15 nm; (b) Δλ = 60 nm)

图2(a)，图2(b)分为Δλ = 15 nm和Δλ = 15 nm时CP-BSA体系的Stern-Volmer曲线，拟合曲线(截距为1)，得到不同温度下的K_sv和K_q，见表1：

Table 1. Quenching reactive parameters of CP-BSA at different temperatures

表1. CP-BSA的荧光猝灭反应参数

n是CP-BSA的结合位点数；r₁是方程 $F_0/F~c_q$ 的线性相关系数；r₂是方程 $\log \left(F_0-F\right)/F~\lg c_q$ 的线性相关系数。

从表1数据来看，Δλ = 15 nm和Δλ = 60 nm不同温度下的 $K_q>2.0\times {10}^{10}\text{L}\cdot {\text{mol}}^{-\text{1}}\cdot {\text{s}}^{-\text{1}}$ ，表明CP与BSA相互作用发生静态猝灭 [7] ，同时随着温度升高，K_q逐渐增大；相同温度下，Δλ = 15 nm的K_a与Δλ = 60 nm的相比，Δλ = 60 nm的结合常数K_a大于Δλ = 15 nm，说明CP在与BSA结合过程中CP更靠近Trp残基形成复合物，同时在相同波长差，随着温度升高，结合常数K_a逐渐增大，表明温度升高有利于CP与BSA结合。同时运用下述公式(2)计算求出结合位点数n以及结合常数K_a。

$\lg \left(F_0-F\right)/F=\lg K_a+n\lg c_q$ (2)

不同温度下，Δλ = 15 nm和Δλ = 60 nm，以 $\log \left(F_0-F\right)/F~\lg c_q$ 作图，见图3。

从图3中可以看出，不同温度下，CP-BSA的 $\log \left(F_0-F\right)/F~\lg c_q$ 曲线呈良好的线性关系，结合位点数n及结合常数K_a数据列于表1，由此得出CP-BSA的结合位数n ≈ 1，表明药物CP与BSA形成1:1复合物。

Figure 3. $\log \left(F_0-F\right)/F~\lg c_q$ plots for the quenching of CP-BSA at different temperatures ((a) Δλ = 15 nm; (b) Δλ = 60 nm)

图3. 不同温度下CP-BSA的 $\log \left(F_0-F\right)/F~\lg c_q$ 曲线((a) Δλ = 15 nm; (b) Δλ = 60 nm)

荧光猝灭比率R_SFQ [8] ( $R_{\text{SFQ}}=\left(F_0-F\right)/F_0$ )和比例分数N_SFQ [9] ( $N_{\text{SFQ}\left(\text{Tyr}\right)}=R_{\text{SFQ}\left(\text{Tyr}\right)}/\left(R_{\text{SFQ}\left(\text{Tyr}\right)}+R_{\text{SFQ}\left(\text{Trp}\right)}\right)$ , $N_{\text{SFQ}\left(\text{Trp}\right)}=\text{1}-N_{\text{SFQ}\left(\text{Tyr}\right)}$ )可进一步表示BSA中Tyr和Trp残基参与体系结合情况。模拟生理条件下310 K时，c_BSA = 58 μg/mL，c_CP = (0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20, 1.40, 1.60, 1.80, 2.00) × 120.8 μg/mL时，N_SFQ(Tyr)分别为40.81%、43.64%、46.06%、47.31%、47.76%、48.08%、48.61%、48.76%、49.11%、49.13%，平均值为46.93%；N_SFQ(Trp)分别为59.19%、56.36%、53.94%、52.69%、52.24%、51.92%、51.39%、51.24%、50.89%、50.87%，平均值为53.07%，结果表明BSA中Tyr和Trp残基均参与体系结合反应，与上述CP-BSA结合位置的结论一致，且N_SFQ(Trp) > N_SFQ(Tyr)，说明体系结合反应更靠近Trp残基，此结论与上述K_a结论一致。

3.2. CP-BSA的结合作用力类型

在不同温度下，由Stern-Volmer方程推演式(3)，由 $1/\left(F_0-F\right)~1/c_q$ 作图，见图4。

$\frac{1}{F_0-F}=\frac{1}{F_0}+\frac{1}{K_D{F}_0{c}_q}$ (3)

Figure 4. $1/\left(F_0-F\right)~1/c_q$ plots for the quenching of CP-BSA at different temperatures ((a) Δλ = 15 nm; (b) Δλ = 60 nm)

图4. 不同温度下CP-BSA的 $1/\left(F_0-F\right)~1/c_q$ 曲线((a) Δλ = 15 nm; (b) Δλ = 60 nm)

图4(a)，图4(b)分别是不同温度下Δλ = 15 nm和Δλ = 60 nm时的 $1/\left(F_0-F\right)~1/c_q$ 曲线，可以看出，不同温度下 $1/\left(F_0-F\right)~1/c_q$ 曲线呈现较好的线性关系，Δλ = 15 nm和Δλ = 60 nm时，随着温度升高，K_D逐渐增大；当温度相同时，Δλ = 60 nm的K_D大于Δλ = 15 nm的K_D，同时也表明药物CP与BSA结合更靠近Trp残基。

根据Vant’s Hoff方程(式4)和热力学方程(式5)，计算CP-BSA结合的热力学参数，结果见表2：

$R\ln K=\Delta S-\Delta H/T$ (4)

$\Delta G=\Delta H-T\Delta S$ (5)

温度变化不大时，ΔH基本不变化，以RlnK_D与1/T作图，ΔH即可由不同温度下CP-BSA的Vant’s-Hoff线性关系图得到，见图5。

Figure 5. Vant’s-Hoff plot for the interaction of CP-BSA at different temperatures

图5. 不同温度下CP-BSA的Vant’s-Hoff曲线

从图5中可以看出Δλ = 15 nm及Δλ = 60 nm时，RlnK_D与1/T呈现良好的线性关系，r分别为0.9990和0.9984。根据图5，式(5)得到ΔH，ΔS，ΔG，结果列于表2中。

Table 2. Thermodynamic parameters of CP-BSA at different temperatures

表2. 不同温度下CP-BSA的热力学参数

从表2中数据看出， $\Delta H_{\Delta \lambda =\text{6}0\text{nm}}>\Delta H_{\Delta \lambda =\text{15}\text{nm}}$ ，且ΔH > 0，表明CP与BSA靠近Trp结合时，放出的热量更大；ΔG随着温度升高ΔG逐渐降低，CP与BSA结合自发进行，并且在相同温度下， $\Delta G_{\Delta \lambda =\text{6}0\text{nm}}>\Delta G_{\Delta \lambda =\text{15}\text{nm}}$ ，说明CP与BSA结合时更靠近Trp残基，这与前面分析结论一致； $\Delta S_{\Delta \lambda =\text{6}0\text{nm}}>\Delta S_{\Delta \lambda =\text{15}\text{nm}}$ ，说明在CP与BSA结合时，Trp残基的混乱度远大于Tyr残基，表明Trp残基更易与CP结合，同时ΔS > 0，表明CP-BSA环境中溶剂分子以有序的方式在CP与BSA体系周围；ΔH > 0，ΔS > 0，ΔG < 0，由此可判断CP与BSA结合的作用力以疏水作用力为主 [10] 。

3.3. 药物协同性及蛋白结合率

药物协同性可体现临床联合用药时的药效，因此药物的协同性作为分析研究药物与蛋白质结合的重要内容之一。药物协同性可以用Hill方程 [11] 的系数n_H进行定量分析，Hill方程(6)：

$\lg \left(\frac{Y}{1-Y}\right)=\lg K_a+n_{\text{H}}\lg \left[L\right]$ (6)

Y为结合饱和分数，其中 $Y/\left(\text{1}-Y\right)=Q/\left(Q_m-Q\right)$ ， $Q=\text{1}-F/F_0$ ，1/Q对1/[L]作图得到1/Q_m；n_H为Hill系数，n_H由 $\text{lg}\left[Y/\left(\text{1}-Y\right)\right]$ 对lg[L]作图得到，n_H > 1表现为正协同作用，n_H < 1为负协同作用，n_H = 1没有协同作用 [12] 。

根据Hill方程得到Δλ = 15 nm及Δλ = 60 nm时n_H，结果列表于表3。

Table 3. Hill coefficient of CP-BSA at different temperatures

表3. 不同温度下CP-BSA的Hill系数

从表3中数据看出，Δλ = 15 nm及Δλ = 60 nm时n_H略小于1，表明药物CP加入BSA后，具有弱负协同作用，对后续药物与BSA的结合具有较弱的负面结果或副作用。

CP-BSA中Tyr和Trp残基的药物结合率(W(Q))及药物CP的蛋白结合率(W(B)) [13] 可根据公式(7)~(8)计算得到。

$W\left(Q\right)=\frac{K_a\left(Q+B\right)+1-\sqrt{K_a^2{\left(Q-B\right)}^2+2K_a\left(Q+B\right)+1}}{2K_{a}Q}\times 100\%$ (7)

$W\left(B\right)=\frac{K_a\left(Q+B\right)+1-\sqrt{K_a^2{\left(Q-B\right)}^2+2K_a\left(Q+B\right)+1}}{2K_{a}B}\times 100\%$ (8)

式(7)与式(8)中，K_a为CP-BSA的结合常数，Q和B分别代表[CP]和[BSA]的总浓度。

模拟生理条件下，c_CP在24~240 μg/mL时，CP-BSA中Tyr残基的药物结合率(W(Q))为0.48%~0.13%，游离的Tyr残基为99.252%~99.87%；Trp残基的药物结合率(W(Q))为0.77%~0.15%，游离的Trp残基为99.23%~99.85%，从数据表明，CP加入到BSA中后，BSA中Tyr残基和Trp残基数量几乎不变，且主要以游离状态为主，说明CP与BSA结合并不影响CP的药物浓度。

CP口服吸收较差，常用于肌肉注射和静脉注射，当静脉给药1g以后，15分钟后c_max为40~70 μg/mL，50%~65%的CP与血浆蛋白结合 [14] 。本实验模拟生理条件下，c_CP在48~72 μg/mL时，CP与BSA中Tyr残基的蛋白结合率(W(B))为47.92%~58.00%，游离药物率为52.08%~42%，CP与BSA中Trp残基的蛋白结合率(W(B))为48.13%~65.05%，游离药物率为51.87%~34.95%，此结果与CP临床用药的药代动力学数据基本一致，表明CP进入血浆后，在血浆中同时存在结合型和游离型药物，游离药物率在40%~50%之间，表明40%~50%的药物具有药物活性，50%~65%的药物与血浆蛋白结合成结合型药物，暂时失去药理活性，并存储于血液中，起到药库的作用，对于药物作用及其维持时间长短具有重要意义。

4. 总结

模拟生理条件下，采用同步荧光光谱，Δλ = 15 nm及Δλ=60 nm时，研究了不同温度下CP-BSA体系的作用机制，同时进一步研究了CP-BSA体系的药物协同性和CP的蛋白结合率及BSA中Tyr和Trp残基的药物结合率。本研究对药物与蛋白质残基结合的作用机制及药代动力学的研究具有一定的意义，为药物在临床应用提供参考。

基金项目

大学生创新训练项目(No: S2023142234094, 2023142234029)；

贵州师范学院大学生科研项目(No: 2023DXS018)。

NOTES

^*通讯作者。