莲子心中三种主要生物碱在大鼠体内代谢产物的鉴定

Identification of Metabolites of Three Main Alkaloids in Lotus Seed in Rats

摘要: 目的：对莲子心中三种生物碱在大鼠体内代谢产物的鉴定。方法：采用HPLC/Q-TOF MS法鉴定大鼠灌胃给药后不同时间尿液、粪便和脑脊液中莲子心三种生物碱的代谢产物。结果：得到三种原型药物及13种代谢产物，除了去甲基化代谢产物外，其他化合物均为首次分析鉴定得到。结论：羟基化，去甲基化，葡萄糖醛酸化及硫酸化是莲子心生物碱在大鼠体内主要的代谢途径。

Abstract: Objective: Identification of metabolites of three alkaloids in lotus seed in rats. Methods: HPLC/Q-TOF MS method was used to collect the metabolites of three alkaloids in urine, feces and cerebrospinal fluid of rats at different times after inadministration. Results: Three prototype drugs and 13 metabolites were obtained. All compounds except demethylated metabolites were identified for the first time. Conclusion: Hydroxylation, demethylation, gluconaldehyde acidification and sulfation are the main metabolic pathways of lotus heart alkaloids in rats.

1. 引言

莲子心是一种普遍易得的中药材，具有清热去火，降压降脂的功效 [1] 。甲基莲心碱，莲心碱和异莲心碱作为莲子心中双苄基异喹啉类生物碱的主要活性成分，在莲子心药效发挥中起到重要的药理学作用。目前，在国内的研究中，关于莲子心三种生物碱代谢产物鉴定的报道很少，黄颖等运用HPLC/Q-TOF MS法，鉴定甲基莲心碱在大鼠肝脏内的代谢产物，但受分析技术和分析方法的限制，只鉴定出原型药物和去甲基化产物 [2] 。观察甲基莲心碱报道的代谢产物的结构，可以看到莲子心中双苄基异喹啉类生物碱在大鼠肝脏中主要发生去甲基化代谢 [2] 。对大鼠灌胃给药后，于不同时间段收集大鼠的尿液和粪便，以及在不同时间段对同一批大鼠随机分组，进行脑积液的抽取，鉴定三种生物碱在大鼠体内代谢产物。检测方法为HPLC/Q-TOF MS法，并对三种莲子心生物碱在大鼠体内可能的代谢途径进行推测。

2. 实验材料

2.1. 实验试剂

莲子心三种生物碱为本实验室自制，纯度大于95%；乙腈，甲醇(色谱级，Sigma，USA)，超纯水(广州屈臣氏食品饮品有限公司)，甲酸(色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司)，微孔滤膜(津隆科技公司)。

2.2. 实验仪器

冷冻离心机(Thermo科技有限公司)；微量移液器(Eppendorf，德国)；旋涡混合器WH-861型(科尔德实验仪器厂)；安捷伦1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；AgilentB飞行时间(HPLC/Q-TOF)液质联用仪(美国安捷伦公司)；液相色谱柱为AgilentSB-C色谱柱(4.6 × 50 mm, 1.8 μm)。

2.3. 实验动物及给药方案

健康雄性SD大鼠，体重为180~220 g，由本溪长生生物公司提供。在恒温23℃ ± 2℃和正常光照条件下饲养，大鼠正常自由饮食和饮水，每天更换垫料，使大鼠适应实验室环境数周后，进行相关实验。给药后采用眼眶后静脉丛采血，并收集尿液、粪便和脑脊液。

3. 实验优化及鉴定

3.1. 实验方法的优化

HPLC/Q-TOF MS条件优化

MS条件：ESI电离源，采用正离子模式采集，鞘气温度：400℃，鞘气流速：12 L/min，喷嘴电压：300 v，雾化气压力：35 psi，毛细管电压：3500 v，干燥气流速：9 L/min，锥孔电压：65 v，碎裂电压：135 v。

HPLC条件：柱温：25℃；流速：0.5 ml/min；进样量：2 μL。流动相：二元梯度洗脱系统，A：乙腈-0.1% FA，B相：水-0.1% FA；梯度洗脱程序为：0~10 min，A相由15%升至20%；10~27 min，A相由20%升至23%；27~34 min，A相由23%升至40%；34~40 min，A相由40%升至60%；40~50 min，A相由60%~99%；50~60 min，A相保持不变 [3] - [9] 。

3.2. 鉴定结果

莲心碱，异莲心碱和甲基莲心碱的裂解规律

通过将代谢产物的二级质谱结果与原型药物二级质谱裂解规律比较，可以大致判断代谢产物的结构，整个分析鉴定过程借助Angilent Mass Hunter来完成。以下分别是莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的裂解规律 [9] [10] [11] [12] 。

莲心碱的裂解规律(M0) 莲心碱的准分子离子[M + H]⁺m/z 611.3118的二级产物离子碎片信息在表中列出。莲心碱准分子离子 m/z 611.3118，失去一个-NH₂CH₃，得到产物离子m/z 580.6538；产物离子m/z 580.6538失去一个-C+ 3得到m/z 568.2694；产物离子m/z 568.2694失去-OCH₃得到产物离子m/z 537.2492；产物离子m/z 537.2492，失去C₇H₇得到产物离子m/z 446.1961；产物离子m/z 446.1961失去-C₉H₁₀O得到产物离子m/z 312.1226；产物离子m/z 312.1226失去-C₆H₂O₂得到产物离子m/z 206.1170；产物离子m/z 206.1170。原型药物准分子离子 m/z 611.3118，失去-CH₂C₆H₄OH，得到产物离子m/z 503.2547；产物离子m/z 503.2547，失去-CH₂得到产物离子m/z 489.2375；原型药物m/z 611.3118从7’断裂C-O键得到离子m/z 283.1560，主要裂解结果见表1。

Table 1. Secondary fragment ions of liensinine, prototype compound and structure after cracking, deviation of fragment results from calculated results and unsaturation

表1. 莲心碱的二级碎片离子、原型化合物及其裂解后的结构、碎片结果与计算结果的偏差以及不饱和度

异莲心碱的裂解规律(M1) 异莲心碱的准分子离子为[M + H]⁺m/z611.3310的二级产物离子碎片信息在表中列出。异莲心碱准分子离子m/z 611.3110失去一个[-NH₂C₂H₃]²⁺得到产物离子m/z 568.2683；产物离子m/z 568.2683，失去-OCH₃得到产物离子m/z 537.2492；产物离子m/z 537.2492，失去-C₈H₉，得到产物离子m/z 432.1798；异莲心碱的准分子离子m/z 611.3110，失去-C₉H₁₃O，得到产物离子m/z 475.2219；异莲心碱从7'位断裂得到产物离子m/z 297.1748；异莲心碱从1，9位的C-C键断裂得到产物离子m/z 192.1010和产物离子m/z 417.2354，异莲心碱的裂解规律，以及产生的碎片离子见表2。

Table 2. Isolynesinine secondary fragment ion, prototype compound and structure after fragment, fragment result, calculation deviation，and unsaturation.

表2. 异莲心碱二级碎片离子、原型化合物及其裂解后的结构、碎片结果和计算偏差以及不饱和度

甲基莲心碱的裂解规律(M2) 甲基莲心碱的准分子离子为[M + H]⁺m/z 625.3270的二级产物离子碎片信息在表中列出。甲基莲心碱的准分子离子m/z 625.3270失去一个-CH₅N得到产物离子m/z 594.6643；产物离子m/z 594.6643失去一个-C+ 3得到产物离子m/z 582.2842；产物离子m/z 582.2842失去C9H12O得到产物离子m/z 446.1972；甲基莲心碱的准分子离子m/z 625.3270，失去C8H9O得到产物离子m/z 503.4132；产物离子m/z 503.4132失去-CH₂得到产物离子m/z 489.2374；甲基莲心碱从7’位断裂得到产物离子m/z 297.1733；甲基莲心碱从1，9位的C-C键断裂得到产物离子m/z 206.1182和产物离子m/z 417.1563。甲基莲心碱二级碎片离子结果见表3。

Table 3. Structure of secondary fragment ion, prototype compound and cracking, cleavage result, calculation deviation and unsaturation of methyl liensinine

表3. 甲基莲心碱二级碎片离子、原型化合物及其裂解后的结构、裂解结果和计算偏差以及不饱和度

4. 结果

采用HPLC/Q-TOF MS法，分析及鉴定大鼠灌胃50 mg/kg莲子心三种生物碱后，大鼠的血浆，尿液，粪便和脑脊液中原型药物和代谢产物 [12] - [17] ，将代谢产物分类如下：

原型药物(M0, M1, M2)

原型药物M0为莲心碱(tR= 13.67 min)，M1为异莲心碱(tR = 18.03)，M2为甲基莲心碱(tR = 26.2)。通过比较M0，M1，M2与莲心碱，异莲心碱和甲基莲心碱标准品质谱信息，确定M0，M1和M2与三种生物碱标准品的的保留时间以及质谱信息相同，确定三者为相对应的三种生物碱 [17] - [24] 。

葡萄糖醛酸化代谢产物(M3, M4, M5)

代谢产物M3 (tR = 9.22)代谢产物M4 (tR = 17.46)代谢产物M5 (tR = 22.92)。代谢产物M3的准分子离子为m/z 787.3437，比原型药物的准分子离子m/z 611.3116多了176.0321Da(C₆H₈O₆)，它的二级碎片中m/z 503.2540，m/z 206.1170，m/z 611.3116的离子丰度很高，表明为莲心碱葡萄糖醛酸化代谢产物。同时根据产生的离子碎片m/z 283.6582可知葡萄糖醛酸化发生在莲心碱的13’位。代谢产物M4的准分子离子m/z 787.3437，比原型药物的准分子离子m/z 611.3116多了176.0321 Da (C₆H₈O₆)，在它的二级碎片中m/z 498.2374，m/z 297.1748，m/z 192.1010的离子丰度很高，表明是异莲心碱发生了葡萄糖醛酸化代谢，同时根据产生的离子碎片m/z 368.8532可知葡萄糖醛酸化发生在异莲心碱的7位。代谢产物M5的准分子离子为m/z 801.3593，比原型药物甲基莲心碱的准分子离子m/z 625.3272多了176.0321Da(C₆H₈O₆)，它的二级碎片中m/z 584.8944，m/z 489.2384，m/z 206.1182的离子丰度很高，表明是甲基莲心碱发生了葡萄糖醛酸化，根据产生的离子碎片m/z 297.1733可知，葡萄糖醛酸化发生在甲基莲心碱的13位。

去甲基化代谢产物(M6, M7)

代谢产物M6 (tR = 9.27)的准分子离子为m/z 597.2959，比原型药物少了14Da(CH₃)，它的二级碎片中m/z 192.1019，m/z 283.1560，m/z 489.2375丰度很高，表明该代谢产物为莲心碱去甲基化的结果，同时根据碎片离子m/z 489.2375，可知去甲基化发生在2，6或者7位上。代谢产物M7 (tR = 15.729)的准分子离子为m/z 597.2959，同时根据其二级碎片中的m/z 178.0835，m/z 297.1748可知该代谢产物为异莲心碱去甲基化的代谢产物，同时根据m/z 178可知，去甲基化发生在2或6位上。

去甲基化，葡萄糖醛酸化(M8, M9)

代谢产物M8 (tR = 7.2)的准分子离子为m/z 773.3280，比原型药物莲心碱多了162Da，它的二级碎片中m/z192.1019，m/z 283.1560，m/z 489.2375的丰度很高，说明M8为莲心碱代谢产物，去甲基化发生在2，6或7位上，葡萄糖醛酸化发生在13’位。代谢产物M9 (tR = 11.96)，比原型药物异莲心碱多162Da，根据M9的二级碎片m/z 178.0835，m/z 297.1748可知M9为异莲心碱代谢产物，同时根据其二级碎片m/z 178.0835可知去甲基化发生在2或6位上，同时根据m/z 368.4582葡萄糖醛酸化发生在7或8位羟基。

羟基化(M10)

代谢产物M10 (tR = 21.51)的准分子离子为m/z 641.3221，比原型药物甲基莲心碱多了16Da，它的二级碎片中m/z 206.1176，503.2574离子丰度很高以及m/z313.1224表明甲基莲心碱发生羟基化的位点分子量为297的异喹啉环连接的甲氧基苯环上。

硫酸化(M11, M14, M15)

代谢产物M11 (tR = 7.30)的准分子离子m/z 691.2684，比原型药物莲心碱多了80Da(SO4H)，它的二级碎片中m/z 206.1176，283.1560，538.2190证明M12为莲心碱代谢产物，根据其代谢产物的碎片m/z 583.2803可以判断其硫酸化发生在13位的羟基上。代谢产物M14 (tR = 15.17)的准分子离子为m/z 691.2684，比原型药物异莲心碱分子量多80Da，它的二级碎片中含有m/z 192.1019，m/z 297.1748判断其为异莲心碱硫酸化代谢产物，根据其碎片离子m/z 569.1952判断形成硫酸酯的位置发生在13位的羟基上。代谢产物的M15 (tR = 20.65)的准分子离子m/z 705.2840，比原型药物甲基莲心碱多了80Da，它的二级碎片中m/z 206.1176，m/z 297证明其为甲基莲心碱代谢产物，根据其碎片离子m/z 583.2190和碎片离子297.1723，判断硫酸化发生在13位的羟基上。

去二甲基化(M12, M13)

代谢产物M12 (tR = 8.03)的准分子离子m/z 583.2803，比原型药物莲心碱少了28Da，它的二级碎片中含有m/z 178.0835，m/z 283.1560，m/z 475.2219表明去脱两个甲基发生在含有两个甲氧基的异喹啉环上。代谢产物M13 (tR = 8.64)的准分子离子m/z 583.2803，比原型药物异莲心碱少了28Da，其离子碎片中含有m/z 178.0835，m/z 283.1560和m/z 475.2219表明脱去的两个甲基分别发生在6位和6’位。

异构化

在尿液及粪便的代谢产物鉴定过程中，莲心碱的峰面积明显高于异莲心碱的峰面积，可能为异莲心碱异构为莲心碱，或甲基莲心碱去脱去一个甲基成为莲心碱。三种生物碱原型药物及代谢产物相关信息见表4，三种生物碱代谢方式见图1~3。各个原型药物与相关代谢产物在血浆，尿液及粪便中的提取色谱图见图4。

Table 4. The HPLC/Q-TOF MS method was used to identify the total alkaloid content in rat plasma, urine and feces, and to identify prototype drugs and their metabolites

表4. 采用HPLC/Q-TOF MS方法鉴定大鼠血浆、尿液和粪便中总生物碱的含量，并鉴定原型药物及其代谢物

P: plasma; U: urine; F: feces.

5. 讨论

本研究采用HPLC/Q-TOF MS法，利用MassHunter软件分析鉴定出血浆，尿液和粪便中三种莲子心生物碱及其13种代谢产物。莲心碱、异莲心碱的代谢产物中均检出原型和它们的进一步去甲基产物，与其体内、体外代谢产物研究报道一致 [2] [24] 。根据与文献中质谱信息的比对分析，结果表明：去甲基化、葡萄糖醛酸化为莲心碱、异莲心碱在大鼠体内代谢的主要途径。林敏婷等研究发现莲子心生物碱在人结肠腺癌Caco-2细胞中主要代谢途径与上述结论一致 [25] 。此外，本研究首次对莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的代谢物进行了全面的分析鉴定，根据代谢产物的结构，推测出三种生物碱在大鼠体内的代谢

Figure 1. Metabolism of liensinine

图1. 莲心碱的代谢方式

Figure 2. Metabolic pattern of iso-lianxinine

图2. 异莲心碱的代谢方式

Figure 3. Metabolic pattern of methyl-lianxinine

图3. 甲基莲心碱的代谢方式

Figure 4. Extraction chromatogram of three alkaloids and their metabolites

图4. 三种生物碱及其代谢物的提取色谱图

途径：发现除去甲基化、葡萄糖醛酸化以外，羟基化和硫酸化同样为莲子心生物碱在大鼠体内代谢的主要途径。结果表明，三种生物碱在大鼠体内主要可以发生的一相代谢有羟基化、去甲基化，及二相代谢有葡萄糖醛酸化和硫酸化，在血浆、尿液及粪便中，莲心碱与异莲心碱峰面积的响应值此消彼长，不排除莲心碱与异莲心碱相互转化的可能性，也有可能甲基莲心碱去甲基代谢成莲心碱和异莲心碱。

基金项目

辽宁省教育厅青年科技人才“育苗”项目(项目编号：LQN202005)。

NOTES

^*共同一作。

^#通讯作者。