酰腙类荧光探针的设计合成及其性质研究

Design, Synthesis, and Properties of Acylhydrazone Fluorescent Probes

摘要: 本实验选用3-叔丁基-5-溴水杨醛和马来酸二酰肼作为反应物，以无水乙醇作为溶剂，并添加少量冰醋酸作为催化剂，在60℃条件下通过乙醇回流法成功制备了荧光探针G1。通过1H NMR检测，确认了该探针的纯度较高。进一步的溶剂效应实验表明，与其它溶剂相比，该荧光探针在DMSO (二甲亚砜)中的溶解性最佳。因此，以DMSO为溶剂，以该荧光探针为溶质，进行了后续的性质探究。首先，通过阳离子全扫实验，发现Zn² 、Cu² 和Fe³ 这三种阳离子能够引起荧光探针的特殊响应。接着，分别对这三种阳离子进行了滴定实验、抗干扰实验、含水率测试以及时间响应实验，并得到了相应的工作变化曲线。然后，通过Job图实验确定了荧光探针与这三种阳离子的配位比。最后，通过测定一系列酚类物质的响应情况，发现该荧光探针对于酚类物质具有特殊的识别效果，这表明其可以应用于特定场合中酚类物质的检测。

Abstract: In this experiment, 3-tert butyl-5-bromosalicylic aldehyde and maleic acid dihydrazide were selected as reactants, anhydrous ethanol was used as the solvent, and a small amount of acetic acid was added as the catalyst. The fluorescent probe G1 was successfully prepared by ethanol reflux method at 60˚C. The purity of the probe was confirmed to be high through ¹H NMR detection. Further solvent effect experiments showed that the fluorescence probe had the best solubility in DMSO (dimethyl sulfoxide) compared to other solvents. Therefore, further property investigations were conducted using DMSO as the solvent and the fluorescent probe as the solute. Firstly, through the cation full scan experiment, it was found that Zn² , Cu² , and Fe³ cations can induce a special response of the fluorescent probe. Subsequently, titration experiments, anti-interference experiments, moisture content tests, and time response experiments were conducted on these three cations, and corresponding working change curves were obtained. Then, the coordination ratios of the fluorescent probe to these three cations were determined through Job plot experiments. Finally, by measuring the response of a series of phenolic substances, it was found that the fluorescent probe has a special recognition effect on phenolic substances, indicating that it can be applied to the detection of phenolic substances in specific situations.

1. 引言

在生命科学领域不断取得突破的今天，有机合成领域的研究重点已经从单纯的物质合成转向了更加注重化合物的生物活性。科学家们正致力于设计并合成能够满足医药、农业等领域需求的具有特定生物功能的有机化合物。这一转变吸引了众多科学家的关注，他们将目光投向了能够带来实际应用成果的生物活性化合物。回顾历史，1864年，H. Schiff [1] 首次使用氨基化合物和羰基化合物进行脱水缩合，得到了一类新型化合物 [2] [3] [4] [5] [6] ，从而定义了含有C=N基团的化合物为Schiff碱。酰腙类化合物是Schiff碱的一种，但在其被发现后的近70年里，并未引起科研人员过多的关注。直到1931年 [7] [8] [9] ，大量水杨醛及其衍生物，包括吡咯醛、邻氨基苯甲醛等Schiff碱化合物的合成，以及对其金属配合物的深入研究，才开始吸引众多化学工作者的注意。

在许多生物化学反应中，Schiff碱的生成扮演着重要角色。Schiff碱含有多种官能团，可以与金属离子形成稳定的金属配合物，这些配合物在多个领域有着广泛的应用，如抗菌 [10] 、抗癌 [11] 等。近年来，Schiff碱因其独特的结构和生理活性，以及良好的配位化学性能，受到了广泛的关注。酰腙键是酰胺类化合物特有的化学键，由酰肼类化合物与相应的醛或酮缩合而成，是Schiff碱的一种。酰腙类化合物具有稳定的性质，不易发生水解，这得益于次氨基的孤对电子与羰基、亚氨基的共轭作用。作为一种有机合成物，酰腙不仅可以用于鉴别和分离提纯醛和酮，还可以作为羰基试剂。此外，酰腙类化合物还能作为金属离子的传感器，用于识别特定离子。在农业 [12] 和医学领域 [13] ，其应用范围包括杀虫、除草、抗肿瘤、抑菌治疗等多方面 [14] [15] [16] [17] [18] 。随着有机合成技术的不断进步，科学家们已经成功合成了大量的酰腙类化合物，并对其进行了详细的研究。这些研究不仅有助于我们深入了解酰腙类化合物的结构和性质，还为开发新的药物和农药提供了重要的理论基础。在未来，酰腙类化合物在生命科学 [19] 、材料科学 [20] 等领域有望发挥更大的作用。

2. 实验部分

2.1. 仪器与试剂

全部实验所用原料购自安耐吉，其余药品及试剂为分析纯，实验室所用水均为二次蒸馏水，实验仪器见表1。

Table 1. Experimental drugs and instruments

表1. 实验药品与仪器

2.2. 荧光探针的制备与表征

2.2.1. 3-叔丁基5-溴水杨醛的合成

称取3-叔丁基水杨醛，溶解在CH₂Cl₂，冰浴搅拌，将液溴注入到CH₂Cl₂，用恒压漏斗将其注入到醛中，滴加4小时左右。反应结束后加入饱和硫代硫酸钠溶液，继续反应1小时，然后进行分液、萃取操作，用无水硫酸镁进行除水步骤，抽滤，用旋转蒸发仪挥发溶剂。烘干得到黄色絮状产物，产率约20%。分子式：C₁₁H₁₃BrO₂，摩尔质量：257.13 g/mol。反应路线如图1所示。

Figure 1. Synthesis reaction formula of 3-tert butyl 5-bromosalicylic aldehyde

图1. 3-叔丁基5-溴水杨醛的合成反应式

2.2.2. 荧光传感器G1的合成与表征

首先，将0.257克(1 mmol)的3-叔丁基-5-溴水杨醛溶解在无水乙醇中，加热至完全溶解。随后，将0.264克(2 mmol)的马来酸二酰肼也溶解在乙醇中，然后将这两个溶液混合在一起，并加热回流8小时，以促进反应的进行。待反应完成后，将混合物冷却至室温，并进行抽滤，以分离出固体产物(荧光探针G1的合成方案如图2所示)。最后，使用旋转蒸发仪将滤液中的溶剂蒸发，得到纯净的产物。烘干得到0.03 g黄色絮状固体，分子式：C₂₅H₃₀Br₂N₄O₄，摩尔质量：610.35 g/mol。图3为G1的氢谱。

Figure 2. Synthesis scheme of fluorescent probe G1

图2. 荧光探针G1的合成方案

Figure 3. ¹H NMR spectrum of fluorescent probe G1

图3. 荧光探针G1的核磁氢谱图

3. 结果与探讨

3.1. 荧光识别性能研究

(a) (b)

Figure 4. Fluorescence emission spectra of different metal ions added to fluorescent probe G1 in DMSO system

图4. DMSO体系下向荧光探针G1中加入不同的金属离子的荧光发射光谱图

为了研究荧光探针G1对金属离子是否有特异性识别能力，在DMSO溶液体系中进行了荧光光谱的研究。向荧光探针G1溶液加入不同的金属离子，滴定浓度为1.0 × 10⁻³ mol/L。如图4所示，在室温条件下，在359 nm的激发条件下，测得配体在570 nm处出现发射峰，此时荧光较弱。向G1溶液中加入Cu²⁺和Fe³⁺后，荧光发射峰基本被淬平，而在G1溶液中加入Zn²⁺后荧光发射峰大幅度开启，加入其他阳离子后溶液的荧光强度未发生明显的增强。

将配置的G1溶液置于紫外灯下，溶液呈淡黄色荧光；另配制相同的G1溶液分别加入Cu²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺，可观察到G1溶液在加入Cu²⁺和Fe³⁺后黄色荧光明显消失，在加入Cu²⁺后荧光慢慢消失，在加入Fe³⁺后荧光消失的速度较快，而在加入Zn²⁺后黄色荧光明显增强，综合配体的全扫图(见图4)，裸眼识别基本符合实验数据(见图5)，所以G1可以对这三种离子进行荧光识别。

Figure 5. Bare eye view of fluorescent probe G1 on cations

图5. 荧光探针G1对阳离子的裸眼图

3.2. 含水体系研究

Figure 6. Fluorescence spectrum of fluorescence probe G1 at different moisture contents in DMSO solution

图6. 在DMSO溶液中不同含水率下荧光探针G1的荧光光谱图

在DMSO溶液中，将水和溶液作为共溶剂，研究对荧光探针G1的影响。实验结果如图6，随着含水率的增加，荧光探针G1在560 nm的荧光强度逐渐降低，荧光发射强度明显减弱，当含水率为30%时达最低。随后随着含水率的增加，荧光强度不断升高，荧光发射强度明显增强。

3.3. 荧光抗干扰性能研究

通过在DMSO体系中做竞争实验，研究荧光探针G1检测Cu²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺的抗干扰能力。如图7所示，在359 nm的激发条件下，向荧光探针G1与Cu²⁺的混合溶液中加入其他干扰离子，发现Fe³⁺的存在会导致G1荧光发生淬灭，而其他金属粒子的存在不会影响荧光探针G1对Cu²⁺的检测；如图8所示，在359 nm的激发条件下，向荧光探针G1与Fe³⁺的混合溶液中加入其他干扰离子，发现Cu²⁺的存在会导致G1荧光发生淬灭，而其他金属粒子的存在不会影响荧光探针G1对Fe³⁺的检测；同样，如图9所示，在359 nm的激发条件下，向荧光探针G1与Zn²⁺的混合溶液中加入其他干扰离子，发现Cu²⁺和Fe³⁺的存在会导致G1荧光发生淬灭，而其他金属粒子的存在不会影响荧光探针G1对Zn²⁺的检测。通过三组实验，G1与这三种阳离子配置成的溶液在加入其他阳离子金属盐后荧光强度基本无明显变化。其中，配体加入后Zn²⁺的溶液荧光强度增加，在加入Cu²⁺和Fe³⁺后的溶液有较为明显的淬灭，但在其溶液中加入其他金属阳离子盐时，荧光强度并没有较为明显的变化，说明配体在对这三种金属离子进行检测时，其他金属粒子的存在对检测结果不会产生较大的影响。综上所述，该配体的抗干扰能力较为良好。

Figure 7. Fluorescence spectra of Cu²⁺ present and absent in fluorescent probe G1 in DMSO solution

图7. DMSO溶液中荧光探针G1中存在和不存在Cu²⁺的荧光光谱图

Figure 8. Fluorescence spectra of Fe³⁺ present and absent in fluorescent probe G1 in DMSO solution

图8. DMSO溶液中荧光探针G1中存在和不存在Fe³⁺的荧光光谱图

Figure 9. Fluorescence spectra of Zn²⁺ present and absent in fluorescent probe G1 in DMSO solution

图9. DMSO溶液中荧光探针G1中存在和不存在Zn²⁺的荧光光谱图

3.4. 荧光探针G1的滴定

图10是在室温下，G1对Cu²⁺的紫外滴定光谱图。可以测得G1在310 nm处出现了一个强的吸收峰，随着向G1的溶液中逐渐加入等量的Cu²⁺，可以看到吸收峰逐渐上升，直至吸光度不再发生变化。同时在386 nm处出现了等吸收点，说明Cu²⁺与G1发生了配位作用。

Figure 10. Ultraviolet titration experiment of G1 on Cu²⁺

图10. G1对Cu²⁺的紫外滴定实验

图11是在室温下，激发波长为359 nm的条件下，G1对Cu²⁺的荧光滴定谱图，随着Cu²⁺的加入，溶液的荧光强度逐渐减弱，并发生蓝移，至570 nm处，到加入Cu²⁺的量为0.5 eq时，荧光强度不再发生变化，证明G1与Cu²⁺的配位比为2:1。

为了进一步确定荧光探针G1与Cu²⁺的结合化学计量比，本实验做了Jobs实验研究。在DMSO溶液中，使荧光探针G1与该金属离子的总浓度保持不变，增加金属离子的摩尔分数，检测G1在金属离子不同的摩尔分数时对应的荧光强度，由图12可证明G1与Cu²⁺的配位比为2:1。

图13是在室温下，G1对Fe³⁺的紫外滴定光谱图。可以测得G1在300 nm处出现了一个将强的吸收峰，随着向G1的溶液中逐渐加入等量的Fe³⁺，可以看到吸收峰逐渐上升，直至吸光度不再发生变化。同时在460 nm处出现了等吸收点，说明Fe³⁺与G1发生了配位作用。

图11. G1对Cu²⁺的荧光滴定实验

Figure 12. Jobs plot of Cu²⁺ and fluorescent probe G1 in DMSO solution

图12. 在DMSO溶液中Cu²⁺与荧光探针G1的Jobs图

Figure 13. Ultraviolet titration experiment of G1 on Fe³⁺

图13. G1对Fe³⁺的紫外滴定实验

图14是在室温下，激发波长为359 nm的条件下，G1对Fe³⁺的荧光滴定谱图，随着Fe³⁺的加入，溶液的荧光强度逐渐减弱，并发生蓝移，至570 nm处，到加入Fe³⁺的量为0.5 eq时，荧光强度不再发生变化，证明G1与Fe³⁺的配位比为7:10。

Figure 14. Fluorescence titration experiment of G1 on Fe³⁺

图14. G1对Fe³⁺的荧光滴定实验

为了进一步确定荧光探针G1与Fe³⁺的结合化学计量比，本实验做了Jobs实验研究。在DMSO溶液中，使荧光探针G1与该金属离子的总浓度保持不变，增加金属离子的摩尔分数，检测G1在金属离子不同的摩尔分数时对应的荧光强度，由图15可证明G1与Fe³⁺的配位比为7:10。

Figure 15. Job’s plot of Fe³⁺ and fluorescent probe G1 in DMSO solution

图15. 在DMSO溶液中Fe³⁺与荧光探针G1的Job’s图

由于荧光探针G1对Zn²⁺有时间响应且时间过长(12 h以上)，所以Zn²⁺未作滴定。另外，为排除Zn²⁺的时间响应，本实验所做的所有含Zn²⁺实验均使用放置24 h以上的Zn²⁺溶液，以保证排除干扰。

3.5. 检测限及络合常数计算

绘制荧光探针G1与Cu²⁺的Benesi-Hildebrand曲线图(图16)，图16显示了G1与Cu²⁺相互作用的浓度和吸收强度在0~10 μmol/L范围内表现出较好的线性关系，计算出检测限为2.4 × 10⁻⁵ mol/L。表明荧光探针G1具有较低的检测限以及较强的络合能力。

Figure 16. Linear relationship between absorption intensity and Cu²⁺ concentration

图16. 吸收强度与Cu²⁺浓度之间的线性关系图

图17显示了G1与Fe³⁺相互作用的浓度和吸收强度在0~10 μmol/L范围内表现出较好的线性关系，计算出检测限为2.4 × 10⁻⁵ mol/L。表明荧光探针G1具有较低的检测限以及较强的络合能力。

Figure 17. Linear relationship between absorption intensity and Fe³⁺ concentration

图17. 吸收强度与Fe³⁺浓度之间的线性关系图

3.6. 实际应用

环境中被酚污染的水，被人体吸收后，若进入人体内的量超过正常人体解毒功能时，超出的部分可以蓄积在体内各脏器组织内，造成慢性中毒，出现不同程度的头昏、头痛、皮疹、皮肤瘙痒、精神不安、贫血及各种神经系统症状和食欲不振、吞咽困难、流涎、呕吐和腹泻等慢性消化道症状。酚类化合物被吸收后，在体内经过肝脏的解毒作用，大部分氧化成苯二酚、苯三酚，并与硫酸、葡萄糖醛酸结合而失去毒性。肾脏是它的主要排泄器官。酚在体内代谢迅速，因此酚污染水体引起的中毒多为急性中毒，主要表现为出汗、肺水肿、黑尿。所以检测和控制酚类对水体污染是十分重要的。

Figure 18. Titration of phenols by fluorescent probe G1

图18. 荧光探针G1对酚类的滴定

在室温下，在359 nm的激发条件下，测定荧光探针G1对酚类的荧光滴定谱图，加入不同的酚类，可以看出淬灭和开启情况不一，于是再对其做裸眼，发现不同的酚类对配体体现出不同的颜色，可以作为特定识别应用。在G1溶液中加入各种酚类，溶液颜色会随着酚类的不同而出现各种各样的颜色(图18)，同时由图19可以看出，不同的酚类都有其特定的荧光强度，因此我们可以使用配体对酚类进行识别，根据其特定的颜色和荧光强度就可以简单识别该酚类的种类，从而达到治理的目的。

Figure 19. Bare eye image of fluorescence probe G1 for phenolic recognition

图19. 荧光探针G1对酚类识别的裸眼图

4. 结论

酰腙类化合物在合成上具有较大的灵活性，跟金属离子有很好的配位作用，是一类很重要的含氮配体。同时酰腙类化合物具有一定的杀菌抑菌、抗病毒及抗肿瘤等生物活性，在功能材料领域也有着很广的应用前景，这些原因使得酰腙及其配合物的研究变得十分广泛，特别在相应配合物的合成与应用等方面有着很好的发展。研究表明，大部分酰腙类化合物的配合物与原配体相比，原有的性质能得到进一步的加强。

综上所述，本实验通过乙醇回流法合成了配体G1，对金属阳离子的荧光传感性质进行了探究，发现该配体在DMSO (二甲亚砜)溶液中对Zn²⁺、Cu²⁺和Fe³⁺有特异性的荧光响应。然后通过荧光滴定对Zn²⁺、Cu²⁺和Fe³⁺这三种离子分别进行滴定，同时做了竞争，确定配位比。然后使用¹H NMR谱图和Job图进一步确定配体预期结合方式，确定了配位比。在探究G1的过程中，还发现在酚类的滴定时可以对酚类特殊响应，可以应用于一些酚类的识别与鉴别上，具有较好的识别性能。

NOTES

^*通讯作者。