血液代谢物水平与慢性鼻窦炎风险之间因果关系：双向两样本孟德尔随机化研究

Causal Relationship between Blood Metabolite Levels and Risk of Chronic Rhinosinusitis: A Two-Way Two-Sample Mendelian Randomization Study

摘要: 目的：运用孟德尔随机化分析方法，探讨1400种血液代谢物与慢性鼻窦炎之间的因果关系。方法：本研究采用两样本孟德尔随机化分析，利用全基因组关联研究(Genome-wide Association study, GWAS)数据库获得血液代谢物和慢性鼻窦炎相关数据。使用R软件和Two Sample MR软件包进行分析。研究采用逆方差加权法(IVW)为主要分析方法，结合MR-Egger回归、加权中位数法、简单模型法及加权模型法作为补充分析血液代谢物和慢性鼻窦炎的因果关系，并进行异质性分析、多效性分析及敏感性分析评估结果的可靠性和稳定性。由于样本过大，为了结果更加严谨对结果进行错误发现率(FDR)矫正。结果：分析结果显示，发现1种血液代谢物为1-硬脂酰-2-亚油酰-GPI (18:0/18:2)升高与慢性鼻窦炎呈负向因果相关(IVW:OR = 0.873, 95% CI: 0.816~0.934, P < 0.001)，经Cochran Q检验及MR-Egger回归检验，发现不存在水平多效性(P > 0.05)；异质性检验结果P值均<0.001，通过留一法检验分析证实，单个SNPs对整体结果没有显著影响，进一步增强了结果的可靠性和稳定性。结论：在1400种血液代谢物种发现1种1-硬脂酰-2-亚油酰-GPI (18:0/18:2)与慢性鼻窦炎发病存在负向因果关联。通过血液代谢物可为慢性鼻窦炎发病机制及早期预防和治疗提供参考。

Abstract: Objective: To explore the causal relationship between 1400 blood metabolites and chronic sinusitis by using Mendelian randomization analysis method. Methods: Two-sample Mendelian randomization analysis was used in this study, and the data related to blood metabolites and chronic sinusitis were obtained from the Genome-wide Association study (GWAS) database. R software and Two Sample MR software package were used for analysis. The inverse variance weighting method (IVW) was used as the main analysis method, combined with MR-Egger regression, weighted median method, simple model method and weighted model method as supplementary analysis of the causal relationship between blood metabolites and chronic sinusitis, and the reliability and stability of the results were evaluated by heterogeneity analysis, pleiotropy analysis and sensitivity analysis. Due to the large sample size, the results were corrected by false detection rate (FDR) for more rigorous results. Results: The analysis results showed that the increase of 1-stearyl-2-linoleic acid-GPI (18:0/18:2) was negatively correlated with chronic sinusitis (IVW: OR = 0.873, 95% CI: 0.816~0.934, P < 0.001). The Cochran Q test and MR-Egger regression test showed that there was no horizontal pleiotropy (P > 0.05). The results of heterogeneity test were all P < 0.001. The analysis of the one-way ANOVA confirmed that single SNPs had no significant effect on the overall results, further enhancing the reliability and stability of the results. Conclusions: Among 1400 blood metabolites, 1-stearyl-2-linoleic-GPI (18:0/18:2) was found to be negatively correlated with chronic sinusitis, which may provide a reference for the pathogenesis, early prevention and treatment of chronic sinusitis.

1. 引言

慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis, CRS)是指病程12周以上的鼻腔及鼻窦慢性非特异性炎症性疾病，为临床常见的耳鼻咽喉科疾病 [1] 。主要症状是鼻塞、流涕，若炎症进一步发展甚至会头面部胀痛以及嗅觉功能障碍等，可由外伤、遗传、病原微生物感染、变态反应、鼻部解剖结构异常等原因引起，少数过敏、哮喘、阿司匹林不耐受等特异体质的患者，容易反复发作，严重影响患者生活质量 [2] 。但其病理生理学机制复杂。代谢组学是对生物体液、细胞或组织中代谢物的大规模研究，以识别疾病的生物标志物并检测生物途径的细微变化，从而深入了解各种生理状况和异常机制 [3] 。血液代谢物反映了身体的生理状态，研究代谢物水平是提高复杂疾病的病因学认识、预防、诊断和治疗的重要基础 [4] 。Gong等 [5] 通过检索发现共有86篇文献表明“慢性鼻窦炎”和“代谢组学”存在相关性，并强调了通过分析CRS患者的代谢组学数据可以揭示该病的潜在发病机制，为个体化治疗提供指导。然而血液代谢物与慢性鼻窦炎之间的因果关系尚不确定。孟德尔随机化(mendelian randomization, MR)是近年来流行病学中一种新兴的遗传学研究方法，它使用遗传变异作为工具变量来估计暴露与疾病结果之间的因果关系。考虑到遗传变异与后代无关且随机分配，因此遗传变异和结果不受混杂因素的影响，因此因果序列是合理的 [6] 。但目前，血液代谢物与慢性鼻窦炎之间因果关系尚未清楚。因此，本研究以1400种血液代谢物和慢性鼻窦炎为研究对象，进行两样本双向孟德尔随机化分析评估两者之间因果关系，为慢性鼻窦炎发生的早期识别和治疗提供了新思路。

2. 资料与方法

2.1. 数据来源

Shin等 [7] 在研究中对影响人类代谢的遗传位点进行了最全面的探索，该研究纳入两项欧洲人群研究的7824名成年个体，经过严格的质量控制，两个队列中都有486种代谢物可用于遗传分析，包括309种已知代谢物和177种未知代谢物。Chen等 [8] 对1091种血液代谢物和309种代谢物的比值进行了全基因组关联研究(GWAS)，从GWAS Catalog数据库中可获得数据。1400种血液代谢物的目录编号为GCST90199621-GCS90201020。慢性鼻窦炎数据来源于2021年Sakaue等 [9] 发表于Nature Genetics上一项大规模研究，包括452,495名欧洲人群患者和24,179,312个单核苷酸多态性(SNPs)位点用于关联分析。数据集为“ebi-a-GCST90018823”，可在GWAS Catalog数据库(https://gwas.mrcieu.ac.uk/)中获取。

2.2. 工具变量的选择

MR分析的基本原则是，能够预测可改变的暴露程度的遗传工具应与暴露相关结果有因果关系。一个有效的遗传工具必须做出三个假设：(I) 相关性假设：它与暴露有因果关系，(II) 独立性假设：它独立于混杂因素，(III) 排他性假设：它只与暴露的结果相关 [10] 。为满足相关性假设，血液代谢物的全基因组显著阈值设定为P < 1.0 × 10⁻⁵，将连锁不平衡阈值设定为r² = 0.001，kb = 10,000，以保证SNPs的独立性。为排除弱工具变量，最后将F值 > 10的工具变量纳入MR分析 [11] 。

2.3. 统计学分析

2.3.1. MR分析

所有数据分析均使用R软件(4.3.2版本)，本研究以逆方差加权法(inverse-variance weighted, IVW) 120作为主要分析方法，IVW法是使用多个SNP获得MR估计的最简易方法，包括随机效应模型和固定效应模型。本研究还使用MR-Egger分析、加权中位数、简单模型和加权模型等作为MR分析的补充方法。这5种分析方法对于工具变量的有效性假设各不相同，有效提升了孟德尔随机化分析的可信度和解释力。可更为全面地评估血液代谢物与慢性鼻窦炎之间的因果关系。MR结果以比值比(odds ratio, OR)和对应的95%置信区间表示，P < 0.05认为有统计学差异。筛选出来的血液代谢物为结局变量，慢性鼻窦炎为暴露因素进行反向MR分析，进一步明确两者之间的因果关系。

2.3.2. 异质性检验

IVW要求每个基本的MR假设的有效性。若工具变量通过其他途径影响结果，IVW得出的因果估计可能不准确，这表明可能存在多效性.为解决这一问题，运用多种方法进行异质性和多效性进行评估。IVW中的Cochran’s Q检验 [12] 用于检测IV之间的异质性，在保证所有IV有效的前提下，IVW使用每一IV方差的倒数作为权重进行加权计算，回归时不考虑截距项，最终得出的是IV效应值的加权平均值，故当P < 0.05时，认为有统计学意义，即可能存在异质性 [13] 。若检测到的异质性很大时(P < 0.001)，以IVW随机效应模型作为金标准，IVW固定效应为补充方法。

2.3.3. 水平多效性检验

利用MR-Egger截距检验评估工具变量的水平多效性，通过计算截距值来估计方向性 [14] ，计算出方向性P值，若P > 0.05，说明不存在水平多效性问题 [15] ，即所挑选的工具变量通过暴露以外的途径对结局无影响，实验结果稳。MR-Egger法与IVW最大的不同在于回归时考虑截距项，且它使用结局方差的倒数作为权重进行拟合，当分析中至少有50% IV是有效IVW时，WME即定义为比率估计值的加权经验密度函数的中位数，因此可一致性地估计因果关系 [16] 。

2.3.4. 敏感性分析

为了评估血液代谢物对慢性鼻窦炎的因果效应的稳健性并解决潜在的偏倚或异质性来源，进行了一系列的敏感性分析，包括MR-Egger回归、加权中位数法、简单模型法及加权模型法。此外还采用留一法分析来检验数据的稳定性，即通过移除单个SNP以确定是否存在可能具有强影响的SNPs [17] 。

3. 结果

3.1. 工具变量的筛选

首先根据关联性分析和去除连锁不平衡的SNPs设定条件，筛选出1400种血液代谢物，共有34,844个符合条件SNPs的作为血液代谢物的工具变量。将34,844个SNPs进行去除弱工具变量(F检验)，SNPs最小F值为19.5，最大F值为5308.4，所得结果均符合F值 > 10的要求，提示研究受弱工具变量影响的可能性较小。

3.2. MR分析

本研究采用IVW作为评估血液代谢物和慢性鼻窦炎因果关系的“金标准”，筛选得到与慢性鼻窦炎密切相关的代谢物，如图1，结果均显示因果效应值b为负数，代表血液代谢物1-硬脂酰-2-亚油酰-GPI (18:0/18:2)和慢性鼻窦炎是负相关的(IVW:OR = 0.873, 95% CI: 0.816~0.934, P < 0.001)，除了部分MR-Egger方法P > 0.05外，大部分P < 0.05，具有统计学意义。总体OR < 1，其95% CI < 1，可知血液代谢物对慢性鼻窦炎具有负向因果关系。反向MR分析结果提示慢性鼻窦炎与1-硬脂酰-2-亚油酰-GPI (18:0/18:2)无显著相关性(IVW:P = 0.93 > 0.05)。

Figure 1. Forest plot of the effect of metabolite 1-stearoyl-2-oleoyl-GPI (18:0/18:2) on chronic sinusitis by MR Analysis

图1. MR分析森林图 代谢物1-硬脂酰-2-亚油酰-GPI(18:0/18:2)对慢性鼻窦炎影响的森林图

3.3. 结果可靠性和稳定性评估

Cochran Q检验结果(Q = 35.51 P = 0.16 > 0.05)和MR-Egger回归检验结果(Q = 32.97 P = 0.20 > 0.05)，表明研究结果不存在异质性；Egger-intercept (P = 0.16 > 0.05)结果表明不存在水平多效性；MR-PRESSO综合检验结果(P = 0.20 > 0.05)，表明纳入的工具变量没有明显的异常值和或离群值，进一步增强本研究MR分析结果的可靠性和稳定性(表1)；圈图显示，通过筛选与慢性鼻窦炎的5种研究方法(IVW、MR-Egger回归、加权中位数法、简单模型法及加权模型法)满足其一P > 0.05的血液代谢物(图2)。森林图显示与慢性鼻窦炎密切相关的SNP具有稳定性，提示1-硬脂酰-2-亚油酰-GPI (18:0/18:2)是结局变量的保护因素(图3)。留一法检验分析提示没有单个SNP对整体结果有较大影响，进一步证明了结果的可靠性(图4)。漏斗图显示纳入的SNPs基本对称分布，提示MR分析无多效性和异质性(图5)，进一步增强了研究结果的可信度。散点图使用5种算法(IVW、MR-Egger回归、加权中位数法、简单模型法及加权模型法)对代谢物SNPs进行回归，表明1-硬脂酰-2-亚油酰-GPI(18:0/18:2)和慢性鼻窦炎具有显著的负向因果关系，所纳入研究的SNPs具有稳定性(图6)。

Table 1. Sensitivity analysis of the MR Study

表1. MR研究敏感性分析

Figure 2. Circle diagram preliminary screening of blood metabolites that meet one of the five research methods of chronic rhinosinusitis

图2. 圈图 初步筛选满足与慢性鼻窦炎5种研究方法之一的血液代谢物

Figure 3. Shows the comprehensive effect of 1-stearoyl-2-oleoyl-GPI (18:0/18:2) SNPs on chronic sinusitis

图3. 表明1-硬脂酰-2-亚油酰-GPI(18:0/18:2)相关SNPs对慢性鼻窦炎综合效应森林图

Figure 4. Forest map of the results of 1-stearoyl-2-oleoyl-GPI (18:0/18:2) leave-one-out test

图4. 代谢物1-硬脂酰-2-亚油酰-GPI(18:0/18:2)留一法检验分析结果森林图

Figure 5. 1-stearoyl-2-oleoyl-GPI (18:0/18:2) Funnel plot for Mendelian randomization analysis

图5. 1-硬脂酰-2-亚油酰-GPI(18:0/18:2)孟德尔随机化分析漏斗图

Figure 6. Scatter plot of metabolite 1-stearoyl-2-oleoyl-GPI (18:0/18:2) on the risk of chronic rhinosinusitis

图6. 代谢物1-硬脂酰-2-亚油酰-GPI(18:0/18:2)对慢性鼻窦炎风险散点图

4. 讨论

慢性鼻窦炎是鼻腔和鼻窦黏膜的复杂的慢性炎症，是鼻部常见疾病，通常分为2个亚型：不伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎和伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎，目前认为是涉及多种病因的异质性疾病 [18] 。目前许多学者认为遗传易感性是慢性鼻窦炎患病的重要因素，且在全基因组关联分析数据(GWAS)发现个遗传变异位点SNPs与慢性鼻窦炎发生存在关联 [19] [20] ，但两者的因果关系未能研究清楚。现有的MR研究尚未精准地勾画出血液代谢物与慢性鼻窦炎之间的因果关系。为了揭示血液代谢物对慢性鼻窦炎发展的潜在影响，本研究运用孟德尔随机化方法分析1400种血液代谢物与慢性鼻窦炎的关系，筛选出1种血液代谢物共29个SNPs易感位点。代谢物1-硬脂酰-2-亚油酰-GPI (18:0/18:2)与慢性鼻窦炎呈负向因果相关(IVW:OR = 0.837, 95% CI: 0.816~0.934, P < 0.001)，为慢性鼻窦炎保护因素。

1-硬脂酰-2-亚油酰基-GPI是一种磷脂酰肌醇分子，其结构中含有一个硬脂酰基和一个亚油酰基。它是一种的磷脂代谢产物，具有提高记忆力、防衰老、降血脂、保肝、健脑等多种功效 [21] [22] 。它在生物体内起着重要的作用，特别是在细胞膜的结构和功能方面 [23] [24] 。它的衍生物质可透过血脑屏障，上调脑内乙酰胆碱循环水平，改善由脑部疾病引起的认知功能障碍和精神行为异常，临床用于阿尔茨海默病、脑缺血型中风以及多发性脑梗死型痴呆的治疗 [25] [26] 。1-硬脂酰-2-亚油酰基-GPI参与信号传导通路，在多种疾病中对细胞的存活、凋亡和转移过程中起到关键的调控作用 [27] 。有研究报道，1-硬脂酰-2-亚油酰基-GPI参与的信号通路与放射性肠炎及乳腺癌等的发生有关 [28] [29] 。最近的研究表明，1-硬脂酰-2-亚油酰基-GPI与肝癌呈负相关 [30] ，仍需加强进一步验证。

本研究使用MR方法，规避了传统观察性研究的固有局限性，更加准确地进行了因果推断。同时使用当前最大GWAS数据进行分析，优势在于样本量充足及较高的统计效能。此外，本研究以IVW分析为主要分析方法，并补充MR-Egger回归法和加权中位数法等多种分析方法，保证了结果的稳健性与可靠性。但此次研究仍有很多不足与局限性，首先，这项研究仅对欧洲人群进行分析，研究结果是否能进一步推广值得研究;其次，本研究仅对因果关系作出了初步判断，其潜在机制有待进一步研究；最后，此次研究选择的是GWAS汇总数据，限制了遗传因素对结局的全面评估，并且缺乏个体数据，缺乏详细的分组数据，无法进行分层分析。

5. 结论

综上所述，本研究通过孟德尔随机化研究评估了1400种血液代谢物与慢性鼻窦炎的因果关系，此次研究结果为慢性鼻窦炎的早期识别及预防提供了新思路和新方向。

NOTES

^*通讯作者。