摘要: 目的：探索益肺解毒方重塑Lewis肺癌荷瘤鼠免疫抑制微环境的机制。方法：30只C57BL/6小鼠，随机分为5组，分别为空白组、模型组、顺铂(DDP)组、益肺解毒方(YFJDF)组、联合(顺铂 益肺解毒方)组，每组6只。除空白组外，其余组按2.1实验方法建立Lewis肺癌模型，予以相应的药物干预14天，摘眼球取血，处死小鼠，称瘤重，计数肺转移瘤个数，计算抑瘤率和肺转移率；Elase方法检测各组荷瘤鼠及空白组鼠的外周血IL-10、TGF-
β的水平；PT-PCR法检测Lewis肺癌荷瘤鼠肿瘤组织中(Arg-1)，iNOSmRNA表达；流式细胞术检测各组荷瘤鼠肿瘤组织中瘤组织的CD3 、CD4 、CD8 T细胞以及MDSCs、CD4 CD25 T细胞的表达数量。结果：1) DDP组、YFJDF组、DDP YFJDF组荷瘤鼠的瘤重低于Model组，有统计学差异，抑瘤率分别为49.59%、35.98%、68.87%。2) Model组、DDP组、YFJDF组、DDP YFJDF组的荷瘤鼠肺部转移瘤的个数比较无统计学差异，但DDP YFJDF组的肺转移瘤抑制率高于DDP组、YFJDF组。3) 与NC组比较，Model组荷瘤鼠的IL-10、TGF-
β水平明显升高，P < 0.05，有统计学的差异；与Model组比较，DDP组、YFJDF组荷瘤属IL-10、TGF-
β的水平略有降低，但无统计学差异；但DDP YFJDF组荷瘤鼠IL-10、TGF-
β的水平明显降低，P < 0.01，有统计学差异。4) 与Model组比较，DDP组、YFJDF组、DDP YFJDF组的Arg-1mRNA的相对表达量降低，P < 0.01，有统计学差异；与Model组比较，DDP组、YFJDF组、DDP YFJDF组的iNOSmRNA的相对表达量增多，P < 0.01，有统计学差异。5) 与NC组比较，Model组的荷瘤鼠外周血的CD3 、CD4 、CD8 T细胞数目降低，P < 0.01，有显著统计学差异，与Model组比较，DDP组、YFJDF组、DDP YFJDF组荷瘤鼠外周血的CD4 T细胞数目降低，除DDP组外，YFJDF组、DDP YFJDF组的P < 0.01，有显著统计学差异；与Model组比较，DDP组荷瘤鼠外周血的CD8 T细胞数目降低，DDP组的P < 0.05，有统计学差异；YFJDF组、DDP YFJDF组荷瘤鼠外周血的CD8 T细胞数目降低，P < 0.01，有显著统计学差异。6) 与Model组比较，除DDP组外，YFJDF组、DDP YFJDF组的MDSCs的表达显著低于Model组，P < 0.01值有统计学差异；DDP组、YFJDF组、DDP YFJDF组的CD4 CD25 T的表达显著低于Model组，P < 0.01，有统计学差异。结论：Lewis肺癌荷瘤鼠存在免疫抑制，益肺解毒方可作用于MDSCs，降低其分泌的免疫炎性因子，降低了免疫抑制性T细胞的水平，提高了杀伤性T细胞的数目，重塑了免疫抑制的微环境，抑制肺癌生长。
Abstract:
Objective: To explore the mechanism of YFJDF in remodeling the immunosuppressive microenvironment of Lewis lung cancer mice. Methods: Thirty C57BL/6 mice were randomly divided into 5 groups: NC group, Model group, Cisplatin (DDP) group, YFJDF group and (Cisplatin YFJDF) group, with 6 mice in each group. In addition to the blank group, Lewis lung cancer model was established according to the 2.1 experimental method, and corresponding drug intervention was given for 14 days. Blood was taken from eyeballs, mice were killed, a sarcoma was weighed, the number of lung metastases was counted, and anti-tumor rate and lung metastasis rate were calculated. The levels of IL-10 and TGF-β in peripheral blood of each group were detected by Elase. The mRNA expression of Arg-1 and iNOS in Lewis lung cancer tumor tissues was detected by PT-PCR. The expression of CD3 , CD4 , CD8 T cells, MDSCs, CD4 CD25 T cells was detected by flow cytometry. Results: 1) The weight of sarcoma in DDP group, YFJDF group and DDP YFJDF group was lower than that in Model group, and anti-tumor rates were 49.59%, 35.98% and 68.87%, respectively. 2) There was no statistical difference in the number of lung metastases in Model group, DDP group, YFJDF group and DDP YFJDF group, but the inhibition rate of lung metastases in DDP YFJDF group was higher than that in DDP and YFJDF group. 3) Compared with NC group, the levels of IL-10 and TGF-β in Model group were significantly increased (P < 0.05), with statistical difference; Compared with Model group, the levels of IL-10 and TGF-β in DDP group and YFJDF group were slightly decreased, but there was no statistical difference. However, the levels of IL-10 and TGF-β in DDP YFJDF group were significantly decreased (P < 0.01). 4) Compared with Model group, the relative expression of ARG-1 mRNA in DDP group, YFJDF group and DDP YFJDF group decreased (P < 0.01), and the difference was statistically significant. Compared with Model group, the relative expression level of iNOSmRNA in DDP group, YFJDF group and DDP YFJDF group increased (P < 0.01), and the difference was statistically significant. 5) Compared with the NC group, the number of CD3 , CD4 , and CD8 T cells in peripheral blood of Model group decreased (P < 0.01), and the number of CD4 T cells in peripheral blood of Model group, DDP group, YFJDF group, and DDP YFJDF group decreased, except for the DDP group. There was significant difference between YFJDF group and DDP YFJDF group (P < 0.01). Compared with Model group, the number of CD8 T cells in peripheral blood of DDP group decreased, P < 0.05, it was statistically significant. The number of CD8 T cells in peripheral blood of YFJDF group and DDP YFJDF group was significantly different (P < 0.01). 6) Compared with Model group, the expression of MDSCs in YFJDF group and DDP YFJDF group was significantly lower than that in Model group except for DDP group, P < 0.01 it was statistically significant. The expression of CD4 CD25 T in DDP group, YFJDF group and DDP YFJDF group was significantly lower than that in Model group (P < 0.01). Conclusion: Lewis lung cancer tumor bearing mice have immunosuppression, and YFJDF can act on MDSCs, reduce the immune inflammatory factors secreted by MDSCs, reduce the level of immunosuppressive T cells, increase the number of killer T cells, reshape the immunosuppressive microenvironment, and inhibit the growth of lung cancer.
1. 引言
髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是一组髓系来源的在肿瘤微环境中对T细胞具有免疫抑制特性的异质性细胞群体，在肿瘤免疫抑制微环境中发挥重要作用。激活的MDSCs可通过多种机制诱导NK细胞、T细胞失活，从而促进肿瘤免疫抑制微环境的形成，包括：耗竭T细胞激活和增殖所必需的氨基酸，阻碍抗肿瘤T细胞的产生，促进了肿瘤的进展；表达高水平的程序死亡分子配体(PD-1ligand, PD-L1)，其与表达在T细胞上的PD-1结合，诱导构象改变，进而使T细胞进入无活性和功能障碍状态；MDSCs分泌的免疫抑制性细胞因子，抑制抗肿瘤免疫应答；MDSCs来源的外泌体不但能够有效地促进巨噬细胞向M2表型极化；MDSCs在肿瘤免疫抑制微环境的形成中发挥了重要的作用 [1] 。中医肿瘤学专家认为：肾精亏虚，精髓异化，是形成肿瘤免疫抑制微环境的始动因素；脾气亏虚，免疫功能低下，物质能量代谢失常，是形成肿瘤免疫抑制微环境的核心病机 [2] 。益肺解毒方具有益肺养阴、解毒散结的功效，前期研究表明，具有明确的抗肿瘤疗效，本研究以MDSCs为切入点，探讨益肺解毒方重塑免疫抑制微环境的机制。
2. 实验材料
2.1. 细胞系与动物
Lewis肺癌细胞系、近交系C57BL/6小鼠，SPF级，雄性，鼠龄6~8周，体质量为20 ± 2 g，购于青岛实验动物中心(证书编号：SCXK (鲁) 2014-0001)，实验动物使用许可证号：SYXK (黑) 2016-004，本实验通过《齐齐哈尔市第一医院实验动物管理办法(试行)》伦理审核(NO.2018-01)。
2.2. 药物
1) 益肺解毒方(YFJDF)：黄芪、北沙参、天冬、女贞子、生白术、茯苓、山药、石见穿、石上柏等药物组成，水煎，浓缩，5.46克/ml，齐齐哈尔市第一医院制剂室提供。2) 顺铂：注射用顺铂，齐鲁制药厂提供，批准号：3D0156B03，10 mg/支。
2.3. 实验试剂与仪器
小鼠白介素10、TGF-β酶联免疫试剂盒(碧云天生物有限公司)、PrimeScriptTMRTreagentKit (TAKARA公司)；DEPC (焦碳酸乙二酯)：Sigma公司；TRIzolReagent：Ambion公司；MDSCs、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD25+T细胞抗体、试剂盒(默克公司)。
荧光定量PCR仪(罗氏)；低温高速离心机(Hettich) −80℃冰箱(海尔公司)酶标仪(BioTek Instruments, Inc.)流式细胞仪(美国艾森生物公司)。
2.4. 实验分组及给药
实验分组：30只C57BL/6小鼠，随机分为5组，分别空白组、模型组、顺铂(DDP)组、益肺解毒方(YFJDF)组、联合(顺铂 + 益肺解毒方)组，每组6只，除空白组外，其余组按2.1实验方法建立Lewis肺癌模型。空白组、模型组：每日灌胃0.2 mL生理盐水；YFJDF组：予35 g/kg/日中药汤剂分早、晚2次灌胃，每次0.2毫升；顺铂组：0.1 ml/只/3日，顺铂腹腔注射，共4次；联合组：每日中药汤剂灌2次，每日顺铂0.1 ml/只/3日，连续给药14 d后，末次给药后24小时，眼眶取血后处死小鼠，无菌完整剥离皮下移植瘤，称重，计算抑瘤率；计数肺部转移瘤的数目。
3. 观察指标及实验方法
3.1. Lewis肺癌荷瘤鼠模型的建立
Lewis细胞扩增培养，至80%密度为宜，用胰酶消化细胞成单个，计数后用磷酸缓冲盐溶液调整浓度到1 × 107/mL，所用液体均预热，细胞离心2000 r/min，5 min，弃培养液，取80 uL无血清培养基小心混合细胞(总体积约100 uL)；然后用1 mL注射器吸取细胞悬液，排空气泡，将细胞接种于小鼠右前肢腋背部皮下，每3天观察一次肿瘤的生长情况。2周后，处死小鼠，剥离生长旺盛期的瘤组织，选取1.0 mm × 0.5 mm × 0.3 mm左右生长良好的肿块，按肿瘤(g)：生理盐水(mL)为1:3比例匀浆，调细胞数为2 × 106/mL。在无菌条件下，每只小鼠右侧腋窝皮下接种0.2 mL。1周后小鼠腋下可触及明显肿块，说明荷瘤模型成功建立。
3.2. 计算抑瘤率
。
3.3. 计算肺转移瘤抑制率
。
3.4. Elase方法检测各组荷瘤鼠及空白组鼠的外周血IL-10、TGF-β的水平
按照试剂盒说明书进行操作：配制实验所需试剂；每孔分别加不同浓度标准品50 ul；分别设标准品孔、Blank孔、待测样本孔。先在酶标板待测样品孔中加样品稀释液40 ul，再加待测样品10 ul。轻微晃动混匀，每孔加入100 ul酶标试剂(空白孔除外)，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃孵育60 min。弃去孔内液体，甩干，洗涤5次，拍干；依序每孔加底物溶液A，B各50 ul，室温避光显色15 min。依序每孔加终止溶液50 ul，终止反应。在反应终止后用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。
3.5. PT-PCR法检测Lewis肺癌荷瘤鼠肿瘤组织中(Arg-1, iNOS) mRNA表达
1) 提取样本总RNA。2) 紫外吸收测定法检测浓度和纯度，RNA的纯度在1.8~2.2。3) 转录合成cDNA。4) 定量PCR反应：PCR管中配制PCR反应混合液，冰上操作。混匀，每个样品做3个重复对照。设定PCR程序：Stage1：预变性：95℃，30 s；Stage2：PCR反应：95℃，05 s；60℃，34 s。Cycles：40~45。Stage3：Dissociation curve：95℃，15 s；60℃，60 s；95℃，15 s。5) 上机扩增检测，利用2−ΔΔCt法计算相对表达量。
3.6. 流式细胞术检测各组荷瘤鼠及空白组鼠的外周血的CD3+细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞的表达量
各组荷瘤鼠摘眼球取血于抗凝管中，按照抗体说明书加入相应体积的抗体，37℃孵育30 min后上机进行流式细胞术检测。
3.7. 流式细胞术检测各组荷瘤鼠肿瘤组织中瘤组织的MDSCs、CD4+CD25+T细胞的表达数量
无菌剥取瘤组织，PBS冲洗，制成单细胞悬液，分别收集每组细胞至离心管中，PBS清洗2次后弃上清，加入相应抗体，按试剂盒说明书进行操作。
4. 实验结果
4.1. 抑瘤率
表1所示，DDP组、YFJDF组、DDP + YFJDF组荷瘤鼠的瘤重低于Model组，有统计学差异，抑瘤率分别为49.59%、35.98%、68.87%，DDP + YFHDF组的抑瘤率高于DDP组、YFJDF组。
Table 1. The tumor inhibition rate in each group (n = 6, g, %)
表1. 各组抑瘤率(n = 6, g, %)
**P < 0.01，***P < 0.001 vs Model组。
4.2. 肺转移瘤抑制率
表2所示，Model组、DDP组、YFJDF组、DDP + YFJDF组的荷瘤鼠肺部转移瘤的个数比较无统计学差异，但DDP + YFJDF组的肺转移瘤抑制率高于DDP组、YFJDF组。
Table 2. The lung metastasis inhibition rate ineach group (n = 6, x ± s, unit %)
表2. 各组肺转移抑制率(n = 6，x ± s，个，%)
4.3. 各组荷瘤鼠及空白组鼠的外周血IL-10、TGF-β的水平
表3所示，与NC组比较，Model组荷瘤鼠的IL-10、TGF-β水平明显升高，P < 0.05，有统计学的差异；与Model组比较，DDP组、YFJDF组荷瘤属IL-10、TGF-β的水平略有降低，但无统计学差异；但DDP + YFJDF组荷瘤鼠IL-10、TGF-β的水平明显降低，P < 0.01，有统计学差异。
Table 3. Levels of IL-10 and TGF-β in pripheral blood of tumor-bearing mice and blank group in each group (n = 6, x ± s, pg/ml)
表3. 各组荷瘤鼠及空白组鼠的外周血 IL-10、TGF-β的水平(n = 6, x ± s, pg/ml)
*与NC组比较P < 0.05，**P < 0.01；#与Model组比较P < 0.05，##P < 0.01。
4.4. 各组荷瘤鼠瘤组织中Arg-1、iNOS mRNA表达
图1所示，与Model组比较，DDP组、YFJDF组、DDP + YFJDF组的Arg-1mRNA的相对表达量降低，P < 0.01，有统计学差异；与Model组比较，DDP组、YFJDF组、DDP + YFJDF组的iNOSmRNA的相对表达量，P < 0.01，有统计学差异。
#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001 vs Model。
Figure 1. The expression of Arg-1 and iNOS mRNA in tumor tissues of tumor-bearing mice in each group
图1. 各组荷瘤鼠瘤组织中Arg-1、iNOS mRNA表达
4.5. 各组荷瘤鼠及空白组鼠的外周血CD3+、CD4+、CD8+的水平
图2所示，与NC组比较，Model组的荷瘤鼠外周血的CD3+、CD4+、CD8+T细胞数目降低，P < 0.01，有显著统计学差异，与Model组，DDP组、YFJDF组、DDP + YFJDF组荷瘤鼠外周血的CD4+T细胞数目降低，除DDP组外，YFJDF组、DDP + YFJDF组的P < 0.01，有显著统计学差异；与Model组，DDP组、YFJDF组、DDP + YFJDF组荷瘤鼠外周血的CD8+T细胞数目降低，DDP组的P < 0.05，有统计学差异，YFJDF组、DDP + YFJDF组的P < 0.01，有显著统计学差异。
*P < 0.05，***P < 0.001 vs NC；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001 vs Model。
Figure 2. The levels of CD3+, CD4+ and CD8+ in peripheral blood of tumor-bearing mice and blank group in each group
图2. 各组荷瘤鼠及空白组鼠的外周血CD3+、CD4+、CD8+的水平
4.6. 各组荷瘤鼠肿瘤组织中瘤组织的MDSCs、CD4+CD25+T细胞的表达数量
图3所示，与Model组比较，除DDP组外，YFJDF组、DDP + YFJDF组的MDSCs的表达显著低于Model组，P < 0.01，有统计学差异；DDP组、YFJDF组、DDP + YFJDF组的CD4+CD25+T的表达显著低于Model组，P < 0.01，有统计学差异。
*P < 0.05，***P < 0.001 vs NC；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001 vs Model。
Figure 3. Expressions of MDSCs and CD4+CD25+T cells in tumor tissues of tumor-bearing mice in each group
图3. 各组荷瘤鼠肿瘤组织中瘤组织的MDSCs、CD4+CD25+T细胞的表达数量
5. 讨论
益肺解毒方是一临床经验总结方，由黄芪、北沙参、天冬、女贞子、生白术、茯苓、山药、石见穿、石上柏等药物组成，具有益肺养阴、解毒散结的功效 [3] ，前期研究结果表明益肺解毒方能够缓解老年晚期NSCLC临床症状，提高患者生活质量，减轻化疗的毒副反应，提高了化疗的依从性和耐受性 [4] [5] ，同时，基础研究表明，在人肺腺癌A549细胞方面，益肺解毒方可以对其产生较好的抑制作用 [6] 。与顺铂联合以后，能够产生协同增效作用，诱导细胞凋亡(促进Bax表达，抑制Bcl-2表达)、抑制细胞侵袭转移(下调MMP2表达，上调E-cad表达)、降低人肺腺癌A549干细胞ABCB1、ABCG2蛋白的表达 [7] ，下调LncRNA-HOTAIR的表达，促进Bax表达，抑制BCL-2表达，进而诱导A549/DDP细胞凋亡，逆转A549/DDP耐药 [3] 。本实验研究表明：益肺解毒方可抑制Lewis肺癌的增殖，降低肺部转移瘤的发生，顺铂联合益肺解毒方组的抑瘤率和肺转移抑制剂率最高，分别为68.87%、71.43%，显示出化疗药物与中药复方联合应用增效的优势。与空白组比较，模型组的IL-1、TGF-β的表达水平升高，CD3+、CD4+、CD8+T细胞表达数目减少，表明模型组存在免疫抑制；益肺解毒方可降低模型组瘤的免疫炎性因子IL-1、TGF-β的表达水平，同时降低Arg-1mRNA的相对表达量表达、升高了CD3+、CD4+T细胞的表达水平，降低了CD8+T细胞、CD4+CD25+T细胞、MDSCs的表达水平，因此，益肺解毒方可作用于MDSCs，降低其分泌的免疫炎性因子，降低了免疫抑制性T细胞的水平，升高了杀伤性T细胞的水平，重塑了免疫抑制的微环境，达到了抑制肿瘤生长的目的。基础研究已经表明，益肺解毒方可通过多层次、多通路、多靶点抑制肺癌细胞的增殖，应进一步开展益肺解毒方的临床研究，增添临床应用的证据，尽快实现临床科研成果的转化。
基金项目
齐齐哈尔市创新激励项目CSFGG-2022004。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。