1. 引言
真菌性角膜炎是由曲霉菌和镰刀菌等致病真菌感染引起的感染性角膜疾病，是发展中国家常见的严重致盲性眼病之一 [1] [2] 。近年来，由于隐形眼镜的频繁使用、抗生素和激素的滥用和角膜表面手术的增多，真菌性角膜炎的发病率呈上升趋势 [3] [4] 。角膜炎症及其相关并发症是真菌性角膜炎视力障碍的主要原因，过度的炎症反应诱导免疫细胞的聚集，促进促炎细胞因子的产生，导致角膜损伤甚至穿孔 [5] [6] 。目前，真菌性角膜炎的治疗仍由局部应用抗真菌药物为主，现有抗真菌药物存在溶解度差、生物利用度低、组织渗透性差、眼表毒性大等缺点 [7] [8] [9] 。并且难以解决角膜过度炎症反应造成的角膜组织损伤 [9] 。因此，需要探索安全性高、能够有效减轻真菌性角膜炎炎症反应的方法。
近年来，细胞膜包被的仿生纳米颗粒由于保留了细胞膜表面特异性蛋白，发挥出良好的生物相容性及较低的免疫原性受到研究者的广泛关注 [10] [11] 。红细胞是人体含量最丰富的血细胞，且成熟红细胞没有细胞核、细胞器等结构 [12] 。由于其高生物相容性、低毒性、优异的可获得性和可操作性被广泛用作药物递送载体 [12] [13] 。聚乳酸–羟基乙酸(PLGA)是一种聚酯，由于具有良好的生物相容性和生物降解性而被应用于纳米递药系统，可以增加药物的缓释效果和稳定性 [14] [15] 。目前，红细胞膜仿生-PLGA纳米递药系统应用在肿瘤、炎症的治疗中，可以增加药物的治疗作用、减轻毒副作用 [16] [17] 。然而其在真菌性角膜炎中的作用未见报道。本研究探究了红细胞膜仿生PLGA纳米颗粒(RBCm@PLGA)对烟曲霉菌性角膜炎炎症反应及严重程度的影响。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
PLGA (50:50)购买于中国济南戴钢生物材料有限公司。沙氏培养基、磷酸盐缓冲液粉末(PBS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、牛血清白蛋白(BSA)购买于中国北京索莱宝公司。二氯甲烷(500 mL)购买于上海生物工程股份有限公司。三氯甲烷(氯仿，500 mL)购买于青岛捷隆化工有限公司，DEPC水(100 mL)购买于上海生物工程有限公司。脂质体挤出器购买于美国Avanti公司。实验动物C57BL/6小鼠(雌性，8周龄)购买于济南彭悦实验动物有限公司，所有动物实验均符合ARVO眼科和视觉研究动物使用声明。人角膜上皮细胞(HCECs)由厦门大学(中国厦门)实验室提供。实验用烟曲霉菌为中国普通微生物菌种保藏管理中心(中国北京)烟曲霉菌3.0772菌株。
2.2. 实验方法
2.2.1. RBCm@PLGA的制备
从C57BL/6小鼠眶静脉取全血，并在每毫升血液中加入1.5 mg EDTA抗凝。在4℃下3000 rpm离心5 min后去除上层的血浆及白细胞等成分，将下层红细胞用1 × PBS溶液洗涤3次后再次离心收集沉淀。在获得的红细胞沉淀中加入0.25 × PBS，并置于4℃冰箱中使红细胞低渗涨破。12 h后，在4℃下14,000 rpm离心10 min，收集沉淀并用1 × PBS洗涤2次。将洗涤后的沉淀用双蒸水重悬，并用脂质体挤出器依次通过400 nm、200 nm的聚碳酸酯多孔膜连续挤出。
将250 mg PLGA溶解在10 mL二氯甲烷中形成油相，随后逐滴滴加到30 mL 4%的BSA溶液中，用探头超声仪300 W，启动3 s，停止2 s超声1 min。将超声后的溶液在室温下用磁力搅拌器搅拌过夜。将剩余溶液在4℃下14,000 rpm离心10 min，收集沉淀并用1 × PBS洗涤3次。将洗涤后的沉淀用双蒸水重悬后在真空冷冻干燥机中冻干。
将冻干后的粉末与红细胞膜按照10:1的质量比混合，用探头超声仪超声1 min超声使其充分混匀。用脂质体挤出器依次通过400 nm、200 nm、100 nm的聚碳酸酯多孔膜连续挤出20次后用真空冷冻干燥机冻干，将获得的RBCm@PLGA粉末保存在−80℃冰箱中。
2.2.2. 角膜荧光素钠染色
采用角膜荧光素钠染色法研究RBCm@PLGA对正常小鼠角膜的毒性作用。将PLGA和RBCm@PLGA用PBS配成250 μg/mL的混悬液。将5 μL混悬液滴入C57BL/6小鼠单眼，每天3次，PBS处理的对侧眼作为对照(n = 3/组/次)。在小鼠角膜灌注后1、3和5天，在钴蓝光下使用裂隙灯显微镜检查角膜荧光素染色情况。
2.2.3. 烟曲霉菌培养及孢子、灭活菌丝的收集
在无菌操作台中将50 μL烟曲霉菌3.0772菌株接种于沙氏固体培养基中，在37℃恒温箱中培养3~5天后，在无菌操作台中，用含有0.1% Tween20的无菌PBS缓冲液冲洗并收集分生孢子。在4℃下12,000 g离心5 min后弃上清，重悬后得到分生孢子悬液，将其放置在4℃冰箱中保存备用。
将烟曲霉菌3.0772菌株接种于含有300 mL无菌沙氏液体培养基的烧瓶中，将烧瓶置于恒温摇床培养箱中在37℃下120 rpm摇菌培养。当真菌生长至团块状时，在无菌操作台中收集真菌团块并用无菌研磨棒物理研磨。将研磨后的菌丝置于离心管中，在4℃下5000 rpm离心15 min，收集沉淀并用无菌PBS洗涤3次。在洗涤后的沉淀中加入75%酒精，在4℃冰箱中过夜灭活，灭活后再次离心弃上清，用无菌PBS洗涤3次。将菌丝用高糖型细胞培养液(DMEM)重悬并稀释成1 × 108 CFU/mL的灭活菌丝悬液。
2.2.4. 烟曲霉菌性角膜炎小鼠模型的建立
将C57BL/6小鼠用8%水合氯醛(0.4 mL/kg)腹腔麻醉后，在显微镜下用微注射器(10 μL)在小鼠右眼角膜基质注射2.5 μL浓度为3 × 107/mL的烟曲霉菌分生孢子悬液，左眼为空白对照组。将小鼠随机分为空白对照组、PLGA处理组和RBCm@PLGA处理组，分别用10 μL PBS、PLGA (250 μg/mL)和RBCm@PLGA (250 μg/mL)点眼处理，每天4次。在处理后第1、3、5天用裂隙灯显微镜拍照观察小鼠角膜的病变情况并进行临床评分。临床评分按照之前的标准 [18] 。收集处理后第3天的小鼠角膜，用于聚合酶链式反应(RT-PCR)实验检测其TNF-α及CCL-2的mRNA表达水平。
2.2.5. HCECs培养和处理
将HCECs接种于6孔板中，在37℃恒温箱中培养48 h，用浓度为5 × 106灭活的烟曲霉菌菌丝刺激1 h后，加入PBS、PLGA或RBCm@PLGA处理。在感染后8 h收集细胞进行RT-PCR实验检测其TNF-α及CCL-2的mRNA表达水平。
2.2.6. RT-PCR
将组织破碎仪破碎后的小鼠角膜组织或者HCECs中加入RNA裂解液并置于冰盒上裂解30 min。4℃下12,000 rpm离心5 min后吸取上清液至新的EP管中，在EP管中加入1/5体积的氯仿，充分混匀后在室温下放置5 min。4℃下12,000 rpm离心15 min，吸取上清液至新的EP管中。在上清液中加入等体积异丙醇，充分混匀后在室温下放置10 min。4℃下12,000 rpm离心10 min后缓慢倒出上清液收集RNA沉淀。500 μL 75%酒精洗涤后再次离心弃上清后，室温放置使酒精完全挥发。用10 μL DEPC水溶解RNA沉淀，充分混匀后立即用核酸蛋白分析仪测定RNA的纯度及含量。RNA样品使用HiScript III RT SuperMix (Vazyme，南京，中国)进行逆转录，生成cDNA模板。引物序列见表1。
Table 1. Primer sequence of target gene
表1. 目的基因引物序列
F: forward; R: reverse.
2.3. 统计学方法
采用GraphPad 8.0软件进行数据分析，计量资料用
表示。各组间比较采用单因素方差分析，其中的两两比较采用LSD-t检验，结果以P < 0.05为差异有统计学意义(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001)。NS表示差异无统计学差异。所有实验均重复至少3次。
3. 结果
3.1. RBC@PLGA对小鼠角膜上皮细胞无毒性
为了评估RBCm@PLGA的毒性，采用角膜荧光素钠染色的方法检测PLGA和RBCm@PLGA对小鼠角膜上皮细胞的损伤情况(图1)。结果表明与正常对照组相比，PLGA和RBCm@PLGA点眼后小鼠角膜均无明显荧光素钠染色，说明PLGA和RBCm@PLGA不会损伤角膜上皮细胞，有良好的生物安全性。
注：PLGA和RBCm@PLGA点眼后，小鼠角膜的荧光素钠染色照片，与正常对照组相比，各治疗组在点眼后1，3，5天均无明显荧光素钠染色。
Figure 1. Toxicity of RBCm@PLGA to corneal epithelial cells
图1. RBCm@PLGA对角膜上皮细胞的毒性
3.2. RBC@PLGA降低小鼠真菌性角膜炎的严重程度和临床评分
我们构建了小鼠烟曲霉菌性角膜炎模型，并用PLGA和RBCm@PLGA点眼治疗，感染后1、3、5天在裂隙灯下观察并拍照。结果显示，与PBS对照组相比，PLGA和RBCm@PLGA处理后，小鼠角膜的浑浊程度减轻，溃疡面积减小(图2(a))。感染后第3天和第5天，PLGA和RBCm@PLGA处理组临床评分较PBS对照组显著降低(图2(b))。
3.3. RBC@PLGA降低烟曲霉菌性角膜炎小鼠角膜中促炎因子的表达
为了进一步评估RBCm@PLGA在体内对炎症反应的影响，我们用RT-PCR检测了烟曲霉菌感染3天后小鼠角膜中促炎因子TNF-α (图3(a))和CCL-2 (图3(b)) mRNA的表达。结果表明，与正常对照组相比，烟曲霉菌感染后第3天小鼠角膜组织中TNF-α和CCL-2 mRNA的表达量显著升高(P < 0.0001)。与AF组比较，RBCm@PLGA处理3 d后，TNF-α和CCL-2 mRNA水平均明显受到抑制(P < 0.001, P < 0.0001)。
(a) (b)注：烟曲霉菌感染后1、3、5天，PBS、PLGA和RBCm@PLGA治疗组小鼠角膜的眼前节照相(a)与临床评分(b)。与PBS组相比，PLGA和RBCm@PLGA减轻了小鼠角膜炎的严重程度和临床评分，差异有统计学意义(*P< 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，ns表示差异无统计学差异)。
Figure 2. RBCm@PLGA alleviates the severity of Aspergillus fumigatus keratitis in mice
图2. RBCm@PLGA减轻小鼠烟曲霉菌性角膜炎的严重程度
(a) (b)注：PLGA和RBCm@PLGA处理对烟曲霉菌感染后第3天小鼠角膜组织中TNF-α (A)和CCL-2 (B) mRNA水平的影响。与AF组比较，RBCm@PLGA处理后，TNF-α和CCL-2 mRNA表达量降低，差异有统计学意义。(*P< 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001)。
Figure 3. RBCm@PLGA decreased the mRNA expression of proinflammatory factor in the cornea of mice infected by Aspergillus fumigus
图3. RBCm@PLGA降低烟曲霉菌感染后小鼠角膜中促炎因子mRNA的表达
3.4. RBC@PLGA抑制烟曲霉菌刺激后HCECs中促炎因子的表达
我们检测了PLGA和RBCm@PLGA对烟曲霉菌刺激后HCECs中促炎因子TNF-α和CCL-2的表达水平(图4(a)，图4(b))。RT-PCR结果显示，与未感染组相比，烟曲霉菌刺激后HCECs中TNF-α和CCL-2的mRNA表达升高(P < 0.0001)。与AF组相比，PLGA和RBCm@PLGA可以显著下调TNF-α和CCL-2的表达(P < 0.0001)。
(a) (b)注：PLGA和RBCm@PLGA处理对烟曲霉菌感染后HCECs细胞中TNF-α (a)和CCL-2 (b) mRNA水平的影响。与AF组相比，PLGA和RBCm@PLGA处理后TNF-α和CCL-2的mRNA水平降低，差异具有统计学意义(****P < 0.0001)。
Figure 4. Effects of PLGA and RBCm@PLGA on the inflammatory response of HCECs
图4. PLGA和RBCm@PLGA对HCECs炎症反应的影响
4. 讨论
真菌性角膜炎可以引起严重的角膜损伤，调查显示，每年全球有100多万人新感染真菌性角膜炎，是世界范围内重要的致盲性眼病 [19] 。根据世界卫生组织2001年的调查显示，角膜盲是继白内障之后的第二大失明原因 [20] 。而眼外伤和角膜溃疡是角膜失明的重要原因。当致病真菌侵入角膜后，会在角膜定植、生长、繁殖，会导致眼睑水肿、结膜充血、角膜上皮缺损及潜在基质浸润、前房积脓，随着病情进展，可能会出现角膜溃疡及眼内眼 [21] [22] ，严重损害视力，影响患者的生活质量。目前，临床应用的抗真菌药物溶解性差、药物利用率低，且缺乏抗炎作用 [23] [24] ，真菌性角膜炎的治疗仍十分棘手。
角膜上皮是角膜的最外层，是直接保护眼睛免受病原体入侵的主要结构屏障。目前应用的抗真菌滴眼液具有眼表毒性，并且临床应用时往往需要长期给药，频繁点药会损伤角膜上皮细胞，导致眼表刺激症状，降低患者的依从性 [25] 。Su等人 [26] 的研究开发了一种红细胞膜伪装的PLGA纳米颗粒递送三氧化二砷由于治疗急性早幼粒细胞白血病，可以降低三氧化二砷对肾脏细胞的毒性。本研究发现，在点眼后第1、3、5天PBS、PLGA和RBCm@PLGA组角膜均未见荧光素钠染色，表明RBCm@PLGA对角膜上皮细胞无毒性，具有良好的生物安全性。
固有免疫是机体抵御病原体入侵的重要防线。当角膜被感染时，正常免疫监测可以激活巨噬细胞和中性粒细胞等免疫细胞，介导角膜上皮细胞和免疫细胞的炎症反应，促进炎症细胞浸润及炎症细胞因子产生，有效识别和吞噬真菌 [27] [28] 。但是，随着炎症级联逐渐增加，许多信号被放大。最后，强烈且持续的免疫反应会导致角膜混浊甚至穿孔 [29] [30] 。因此，抑制真菌性角膜炎中过度的炎症反应对于改善角膜炎预后具有重要意义。体内实验表明，RBCm@PLGA治疗后，烟曲霉菌性角膜炎小鼠角膜的浑浊程度减轻、溃疡面积减小、临床评分降低，表明RBCm@PLGA对真菌性角膜炎具有保护作用。我们的研究检测了RBCm@PLGA对烟曲霉菌感染后HCECs细胞和小鼠角膜中促炎因子TNF-α和CCL-2 mRNA水平的影响，结果表明RBCm@PLGA可降低促炎因子的表达减轻角膜炎症反应。
综上所述，RBCm@PLGA具有良好的生物安全性，可以减轻促炎因子的表达抑制炎症反应在真菌性角膜炎中发挥保护作用，为真菌性角膜炎的治疗提供新的思路。
5. 问题与展望
RBCm@PLGA具有抗炎作用，可以通过减轻炎症反应在真菌性角膜炎中发挥保护作用。但临床应用的具体浓度、频次等还需要进一步实验来摸索。RBCm@PLGA本身没有抗真菌作用，在临床应用中需要与抗真菌药物联合应用。后续研究中我们可以用RBCm@PLGA负载抗真菌药物使其同时发挥抗菌和抗炎的双重效果。总之，作为一种新兴的递药系统，RBCm@PLGA具有广阔的应用前景，为真菌性角膜炎的治疗提供新方向。
NOTES
*通讯作者。