1. 引言
烟蚜(Myzus persicae)又称桃蚜，是烟草重要害虫之一 [1] ，其危害时间长、发生数量大，常密集在烟叶背面或叶心上。烟蚜通过吸食烟株韧皮部汁液直接对烟株产生危害，同时烟蚜还分泌蜜露，导致烟叶发生煤污病，使烤烟的产量与质量下降。此外，烟蚜还能够传播病毒病，病毒病的发生将造成巨大的经济损失 [2] [3] [4] ，因此烟蚜的有效防治对烤烟生产至关重要。
目前，在烤烟生产过程中，化学农药的大范围使用导致烟蚜抗药性增强、资源浪费以及农药残留等问题日益凸显 [5] ，化学农药在施用的过程中仅有1%左右为有效喷洒，其余99%则释放至非目标土壤、水体和大气中，最终被人类和其他生物体吸收。农药的使用已经严重危害人类健康，如何有效降低化学农药使用量已经成为全世界面临的一个共同难题 [6] [7] 。针对这些问题近年来生物防控开始兴起，其中利用烟蚜天敌对烟蚜进行防控是一个行之有效的方法 [8] [9] ，但生物防控见效相对较慢、使用不太方便 [5] ，现在烟草生产上亟需更为简便、有效和无农残的烟蚜防治新方法。β-罗勒烯是一种植物通讯信号分子，由植物体内提取而来，具有绿色无污染的特点，它能诱导植株产生防御反应，促使植株进入防御戒备状态，有利于植株更快、更有效的抵御外界生物胁迫 [10] [11] 。Kishimoto K等 [12] 通过研究发现，野生烟草在受到不同昆虫取食后，罗勒烯的释放量会显著升高；Kessler A等 [13] 经过试验发现，表达罗勒烯合成酶的烟草能够吸引更多的蚜虫天敌，并且能够抑制蚜虫的生长发育；Kang等通过外源施加β-罗勒烯的方式诱导大白菜对蚜虫产生抗性，蚜虫在取食大白菜后，生长发育会受到抑制，个体变小、繁殖能力下降 [14] 。桂茜等 [15] 发现经β-罗勒烯诱导的拟南芥在接种斜纹夜蛾后，斜纹夜蛾会展现出较强的拒食性，体重显著降低，拒食率显著增加，拟南芥相关防御基因的表达量显著提高 [10] [16] 。以上研究均表明，β-罗勒烯在绿色防控方面有着巨大的应用潜力和优势，但能否通过外源施加β-罗勒烯，诱导烟草对烟蚜产生抗性的研究还未曾出现。为此，本研究将通过外源施加β-罗勒烯的方式，分析不同β-浓度罗勒烯对烟蚜种群的控制效果，同时通过RT-qPCR分析烟株体内抗性基因的表达情况，最后通过田间药效试验分析β-罗勒烯对烟蚜的防治效果，旨在为进一步丰富绿色防控手段，实现烤烟绿色生产提供科学的参考。
2. 材料与方法
2.1. 供试材料
供试烤烟品种为“云烟87”(湖南农业大学农学院烟草工程重点实验室馈赠)，盆栽种植于湖南农业大学农学院生物测定中心温室内，待烟株长至五叶一心后备用。
烟蚜采自湖南农业大学浏阳烟草实验基地(湖南省浏阳市永安镇永和村，经度：E113.85˚，纬度：N28.29˚)，在室温中以烤烟植株饲养繁殖多代后供试。
2.2. 供试试剂
82% β-罗勒烯(德国Sigma公司)；70%吡虫啉水分散粒剂(河北中保绿农作物有限公司)；无水乙醇(天津市化工三厂有限公司)；EastepTM Super总RNA提取试剂盒(上海普洛麦格生物产品有限公司)；cDNA反转录试剂盒(上海赛默飞世尔科技公司)。
2.3. 试验仪器
仪器：10 L干燥罐(常德比克曼生物科技有限公司)；载玻片(常德比克曼生物科技有限公司)；Light Cycler® 480Ⅱ型荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)。
2.4. 试验方法
2.4.1. β-罗勒烯诱导烟株防控烟蚜的抗性检测
试验方法参考刘梅 [17] 、覃韧 [18] 的方法。试验设置4个处理：分别为5、10、15 mM β-罗勒烯诱导处理及对照(未经β-罗勒烯诱导)，每个处理设置3组重复，每组重复3株烟。将烟株放入干燥罐内，分别暴露于浓度为0、5、10、15 mM的β-罗勒烯中，处理6 h。处理结束后，挑选活力相近的2龄若蚜，分别接入各处理烟株上，每株烟苗接入10头若蚜，接虫部位统一为倒数第二片叶背面，随后将接种有烟蚜的材料放入养虫罩中，在温度为25℃ ± 1℃，RH为60%~70%，光周期为16 L：8D的条件下生长。从接虫后第4 d开始，每隔2 d对各处理烟蚜的数量进行一次统计，直到第12 d。根据公式1、2、3分别计算出各处理，烟蚜种群增长率 [19] 、烟蚜的趋避率 [20] 、以及干扰作用控制指数 [21] ，探究不同浓度β-罗勒烯对烟蚜种群的影响。
(1)
(2)
(3)
2.4.2. 抗性基因表达量检测
烟株经β-罗勒烯诱导处理(处理方式同1.3.1)后，分别收集各处理烟株的叶片，按照Trizol法分别提取叶片总RNA，反转录为cDNA。利用premier primer5软件设计抗性基因PR1和PDF1.2的实时定量PCR (Quanlitlitative Real-Time PCR, qRT-PCR)引物，以Actin作为内参基因，按照Light Cycler® 480 SYBR Green I Msater qPCR试剂盒的操作说明配置反应体系，使用Light Cycler® 480Ⅱ型荧光定量PCR仪进行qRT-PCR反应。根据2−∆∆Ct法对各处理PR1和PDF1.2的相对表达量进行计算 [22] ，探究β-罗勒烯对烟株体内抗性基因表达情况的影响。所用引物如下表1：
2.4.3. 田间药效试验
试验设置在长沙市浏阳烟草试验基地，试验田面积为1800 m2 (60 m × 30 m)，长条型，施肥条件均一致。设置3个处理，以施加β-罗勒烯的田块为处理组，不施加β-罗勒烯和化学农药的田块为空白对照，施用化学农药的田块作为化学药剂对照组。每个处理各设置3个重复，共9个小区，每个小区100 m2。于烟株上烟蚜发生初期(2023年4月10日)，开始施用β-罗勒烯和化学农药，间隔两周施用一次，在整个防控期内分别施用4次β-罗勒烯和4次化学农药。于第一次施用β-罗勒烯和化学农药后7 d，开始对各处理烟蚜进行统计，间隔7 d。
采用五点取样法，在每个小区四周和中心取5个点调查，每个点随机调查5株烤烟，调查时均选取每株烤烟倒1~5片叶上的烟蚜进行统计。统计结束后，根据公式4，分别计算出不同处理烟蚜的虫口减少率。
(4)
2.5. 数据分析
采用Origin 2022、Excel 2010和SPSS 23软件进行作图、数据统计分析、单因素方差分析(p = 0.05) LSD法比较，数据均用平均值±标准误进行表示。
3. 结果与分析
3.1. β-罗勒烯诱导烟株对烟蚜种群数量的影响
见表2，外源施加β-罗勒烯对烟蚜种群数量具有显著的控制效果，于接虫后第12 d，对各处理烟蚜数量进行统计发现，对照组烟蚜数量为124.7头/株；经5、10、15 mM β-罗勒烯诱导后烟蚜数量分别为76.0、43.0、44.0头/株，相比对照分别减少了48.7、81.7、80.7头/株。据此推断10 mM β-罗勒烯对烟蚜种群数量的控制效果最佳，见图1。
Table 2. The effect of β-ocimene on the population of Myzus persicae
表2. β-罗勒烯对烟蚜种群数量的影响
注：表中同一时间图注上不同的小写字母表示单因素方差分析在0.05水平下，差异显著。
Figure 1. Growth and reproduction of Myzus persicaeon tobacco plants after treated by under different concentrations of β-ocimene
图1. 接虫后12 d各处理蚜虫数量
3.2. β-罗勒烯诱导烟株对烟蚜种群增长率的影响
注：图中同一时间图注上不同的小写字母表示单因素方差分析在0.05水平下，差异显著。
Figure 2. Population growth of Myzus persicaeon tobacco plants after treated by different concentrations of β-ocimene
图2. 经不同浓度β-罗勒烯处理后烟蚜种群增长率
见图2：外源施加β-罗勒烯对烟蚜的种群增长率具有显著的抑制效果。随着β-罗勒烯浓度的增加，增长率整体呈下降趋势。12 d内，对照组烟蚜种群增长率为21.03%；经5、10、15 mM β-罗勒烯诱导后，烟蚜种群增长率分别为16.90%、12.16%和12.35%，相比对照分别下降了4.13、8.87、8.68个百分点。终上所述，10 mM β-罗勒烯诱导烟株对烟蚜种群增长率的抑制效果最大。
3.3. β-罗勒烯诱导烟株对烟蚜驱避率的影响
见图3：本研究测试β-罗勒烯三种浓度处理中，5 mM对烟蚜的趋避率影响最小；15 mM对烟蚜趋避率的影响次之；10 mM对烟蚜趋避率的影响最大，其中10 mM和15 mM β-罗勒烯对烟蚜趋避率无显著性差异。最大趋避率出现在经10 mM β-罗勒烯诱导后第10 d为50.97%，最小趋避率为5 mM β-罗勒烯诱导后第6 d仅为11.89%。综上所述10 mM β-罗勒烯对烟蚜驱避效果最佳。
注：图中同一时间图注上不同的小写字母表示单因素方差分析在0.05水平下，差异显著。
Figure 3. Different concentrations of β-ocimeneon the repellency rate of Myzus persicae in tobacco plants
图3. 经不同浓度β-罗勒烯处理后烟株对烟蚜的驱避率
3.4. β-罗勒烯诱导烟株对烟蚜种群的干扰效果
Figure 4. The effect of different concentrations of β-ocimene on the control index of the disturbance of Myzus persicae population
图4. 不同浓度β-罗勒烯对烟蚜种群干扰作用控制指数的影响
见图4：本研究测试β-罗勒烯三种浓度处理中，5 mM对烟蚜种群的干扰效果最小；15 mM对烟蚜种群的干扰效果次之；10 mM对烟蚜种群的干扰效果最大。接入烟蚜后第10 d，三个处理对烟蚜的干扰效果均达到最佳，分别为0.61、0.32和0.33。表示烟蚜种群数量仅为对照组的61%、32%、33%。综上所述，10 mM β-罗勒烯对烟蚜种群的干扰效果最佳。
3.5. β-罗勒烯诱导烟株提高抗性基因的表达
前面试验结果表明，烟株经10 mM β-罗勒烯诱导后对烟蚜种群的控制效果最佳。故以10 mM β-罗勒烯处理的烟株作为处理组，未经β-罗勒烯处理的烟株作为对照组。通过对比发现，经β-罗勒烯诱导后，烟株体内水杨酸(SA)防御途径指示基因PR1的表达量相较于对照提高了9倍；茉莉酸/乙烯(JA/ET)防御途径指示基因PDF1.2的表达量相较于对照提高了1.5倍(见图5)，PR1和PDF1.2表达同时提高，暗示着β-罗勒烯能够解除SA防御途径与JA/ET防御途径之间的拮抗。以上结果表明，β-罗勒烯诱导能够启动烟株自身防御反应，从而增强烟株对烟蚜取食的抗性。
注：同组柱形图中不同字母表示0.01水平下差异极显著，“—”表示对照，“﹢”表示经罗勒烯处理。A：PR1基因相对表达量，B：PDF1.2基因相对表达量。
Figure 5. Relative expression level of resistance genes
图5. 抗性基因相对表达情况
3.6. 田间施用β-罗勒烯对烟蚜种群数量的影响
Table 3. The control effect of different treatments and stages on Myzus persicae
表3. 不同处理不同时期烟蚜虫口减少率
注：表中同一时间图注上不同的小写字母表示单因素方差分析在0.05水平下，差异显著。
根据室内盆栽试验结果，将以10 mM β-罗勒烯用于大田，吡虫啉配制成500倍液后用于大田。见表3，在整个调查期间，处理组与化学试剂对照组烟蚜数量均低于对照组，施用β-罗勒烯后，烟蚜数量相比对照减少了58.67~65.95%；施用化学农药后，烟蚜数量相比对照减少了49.46%~83.97%。β-罗勒烯在整个防控期间内效果较为稳定波动较小，施用化学农药效果波动较大。化学农药能迅速灭杀烟蚜，在施用初期，烟蚜数量迅速减少，效果较为显著，但随着时间的推移以及降雨等天气情况的影响，药效逐渐降低，烟蚜数量开始回升；施用β-罗勒烯后，烟株自身防御体系被激活，此期间不会因外界环境变化而影响防治效果，烟蚜数量从一开始就显著降低，整个防治过程波动较小，效果稳定。综上所述，施用β-罗勒烯及化学农药均能有效控制烟蚜的种群数量，但施用β-罗勒烯效果更加稳定且符合烤烟绿色发展理念。
4. 结论
通过室内盆栽试验确定，烟株经10 mM β-罗勒烯诱导后，对烟蚜展现出的抗性最强。烟株经10 mM β-罗勒烯诱导后，烟蚜密度减少了81.7头/株、种群增长率减少了8.87个百分点；通过进一步分子水平检测发现，烟株体内水杨酸防御途径指示基因PR1与茉莉酸/乙烯防御途径指示基因PDF1.2的表达量分别上升了9倍和1.5倍。以10 mM β-罗勒烯用于大田，在整个防控期间内，烟蚜数量减少了58.67%~65.95%，相较于化学农药效果更加稳定且更加绿色环保。基于本研究的数据得出结论，β-罗勒烯可作为一种新型的烟蚜防控试剂，建议浓度为10 mM。
5. 讨论
通过室内盆栽试验发现，β-罗勒烯对烟蚜种群影响较大，烟蚜种群数量、种群增长率均显著降低，这些结果与Kang等的结论相近 [14] ，此外，烟株经β-罗勒烯诱导后，对烟蚜具有显著的趋避作用。分子水平检测显示，经β-罗勒烯诱导后，烟株体内抗性基因PR1及PDF1.2的表达量极显著上升，这与刘春林报道的结果一致 [23] 。烟株经β-罗勒烯诱导后所展现出的抗性，与PR1及PDF1.2表达量的上调密切相关，这与Shonle的结论一致 [24] 。PR1与PDF1.2分别作为SA防御途径及JA防御途径的指示基因，其表达量的提升预示着两条防御信号通路同时被激活，而SA信号传导途径参与了由烟蚜取食诱导的植物防御反应 [25] ，据此分析，SA防御途径被激活，可能是β-罗勒烯诱导烟株对烟蚜产生抗性的主要原因。以上结果表明β-罗勒烯在防控蚜虫方面存在着巨大潜力。
项目基金
湖南省烟草公司长沙市公司项目“罗勒烯防控烟草病毒病的应用与研究”(CS2023KJ02)；湖南省教育厅项目(20K070)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。